| المجلد 3 , العدد 10 , ذي الحجة 1426 - كانون الثاني (يناير) 2006 |
| |
| دراسة وراثية خلوية لبعض حالات الإجهاض المتكررة غير المفسرة |
| Cytogenetic Study of Some Unexplained Recurrent Abortion |
| د. مازن كنج* و د. فوزة منعم** |
| Mazen Kenj and Fawza Monem |
| *مستشفى الأسد الجامعي، **كلية الصيدلة - جامعة دمشق |
| الملخص Abstract |
يراجع الكثير من الأزواج عيادات الأطباء الاختصاصيين بشكوى الإجهاضات المتكررة, حيث تجرى لهم الفحوص السريرية والمخبرية العامة لمعرفة الأسباب المختلفة لهذا الاضطراب، وتبقى بعض الحالات دون تفسير. ونظراً لأن حالات الإجهاضات المتكررة ترتبط في كثير من الدراسات العالمية بالاضطرابات الصبغية عند أحد الأزواج, تمت دراسة التنميط النووي (الصيغة الصبغية) لهؤلاء المرضى بهدف رصد هذه التبدلات المحتملة لديهم وإيجاد العلاقة ما بين هذه الشذوذات والإجهاضات المتكررة.
تم انتقاء عينة من المرضى مؤلفة من 40 زوجاً يعانون من مشكلة الإجهاضات المتكررة, وأجريت لهم دراسة الصيغة الصبغية في مختبر مستشفى الأسد الجامعي بدمشق وذلك في الفترة ما بين الشهر الأول من عام 2004 ومنتصف عام 2005, وقد أجري العمل باستخدام طرق الوراثة الخلوية المرجعية بعد زراعة اللمفاويات وتلوينها بطريقة G banding.
تم رصد ثلاثة شذوذات صبغية صريحة هي:
• 46; XYt (7; 11) (p11; q25)
• 46; XX 14p+
• 46; XX - 45; X Mosaic
أي أن نسبة التبدلات الصبغية في الدراسة هي 3\40 (%7.5).
تتوافق هذه النسبة (%7.5) مع الدراسات العالمية الأخرى, وتؤكد أهمية إجراء اختبار التنميط النووي (الصيغة الصبغية) لمرضى الإجهاضات المتكررة على التوازي مع الاستقصاءات الرئيسية الأخرى. |
Many couples suffer from recurrent abortions, are investigated in laboratories and clinics to detect the most common suspected reasons for this disorder. Still, some cases remain unexplained. According to many international studies, recurrent abortions correlate with chromosomal disorders in one of the parents, so karyotyping was done to those patients, in order to uncover their probable chromosomal abnormalities.
40 couples suffering from recurrent abortions, were studied in Al Assad University Hospital Laboratory during the first month of 2004 and middle of 2005, karyotyping was performed according to standard lymphocyte culture methods and standard G banding staining.
3\40 (7.5%) cases showed chromosomal abnormality:
46; XYt (7; 11) (p11; q25)
46; XX 14p+
46; XX - 45; X Mosaic
Our result complies with other international studies, and refers to the importance of performing karyotyping test in recurrent abortion patients in parallel with other main investigations. |
| المقدمة Introduction |
يحدث الإجهاض العفوي في 15-20% من الحمول المشخصة سريرياً (2), وتعددت العوامل المسببة لتشمل العيوب التشريحية, والاضطرابات الهرمونية, إلى جانب العداوى الميكروبيولوجية, وردود الفعل المناعية, وغيرها.
وقد كشف الباحث Schmidt في أبحاثه التي أجراها في عام 1962 (2) وجود عامل آخر يلعب دوراً في مشكلة الإجهاضات المتكررة لا يقل أهمية عن العوامل السابقة, ألا وهو التبدلات الصبغية عند أحد الأزواج, التي يمكن أن تنتقل إلى الأجنة من خلال قوانين الاحتمالات الوراثية, حيث تظهر الدراسات أن 50% من الأجنة التي عانت من الإجهاض العفوي كانت تحمل تنميطاً نووياً
(صيغاً صبغيـة) شاذاً (2).
ومن أهم التبدلات الصبغية عند الأزواج الذين يعانون من مشكلة الإجهاض المتكرر:
آ- الإزفاء (الإنتقال الصبغي) المتوازن Balanced translocation بنوعيه:
• الإزفاء (الانتقال) الروبرتسوني Robertsonian Translocation (انتقال الذراع الطويل لصبغي طرفيِ القسيم المركزي, إلى الذراع الطويل لصبغي آخر طرفيِ القسيم المركزي, وذلك بعد فقدان الأذرع القصيرة).
• الإزفاء المتبادلReciprocal Translocation
في حالة الإزفاء المتوازن, لا تزداد المادة الصبغية, ولا تنقص, ولذلك لا يعاني المريض من أعراض سريرية ولكن حالة الإزفاء المتوازن هذه تنقلب إلى إزفاء غير متوازن في 50% من الأعراس الجنسية لهذا المريض, الأمر الذي يفسر ولادة أطفال يعانون من التشوه Malformation, أو الإجهاض التلقائي لحمولهم.
ب- الإنقلاب الصبغي Inversion
يأتي الانقلاب الصبغي في المرتبة الثانية بعد الإزفاء المتوازن الذي يعد التبدل الأكثر شيوعاً في مشكلة الإجهاض المتكرر الناتج عن تبدل الصيغة الصبغية لدى أحد الزوجين (6، 9).
أجريت العديد من الدراسات على مستوى العالم لدراسة العلاقة ما بين الإجهاضات المتكررة, والتبدلات الصبغية لدى مجموعات متفاوتة من المرضى يعانون من هذه المشكلة. يوضح الجدول 1 ست دراسات عالمية أجريت في مناطق مختلفة جغرافياً, وعرقياً, وسكانياً ,تم في هذه الدراسات تحديد أنماط التبدلات الصبغية المشاهدة وأعدادها, وحساب نسبة مجموع هذه التغيرات إلى عدد الحالات المدروسة. أظهرت الدراسات أن نسبة التبدلات الصبغية تراوحت ما بين 4.7% (في الدراسة الكندية) (4) إلى 9.92% (في الدراسة الصينية) (2، 10).
من المعلوم أن عدد الصبغيات عند الإنسان هو 46 صبغي موزعة على 23 زوجاً:
22 زوج من الصبغيـات الجسـدية Autosomes, وزوج واحـد من الصبغيات
الجنسية Sex Chromosomes.
يتألف الزوج الجنسي عند الذكر من الصبغيين X, Y, وعند الأنثى من الصبغيين X, X.
يعبَر عن الصيغة الصبغية بكتابة العدد الكلي للصبغيات أولاً ويتبع بذكر الصبغيات الجنسية ثم التبدلات الصبغية إن وجدت وذلك وفق تعليمات (An International System For Human Cytogenetic Nomenclature) ISCN لعام 1995 أي أن:
التنميط النووي الطبيعي (الصيغة الصبغية الطبيعية) للرجل هي: 46;XY (الشكل 1).
التنميط النووي الطبيعي (الصيغة الصبغية الطبيعية) للمرأة هي: 46;XX (الشكل 2).
|
| المواد والطرق Materials and Methods |
شملت مجموعة الدراسة 40 زوجاً من المرضى المراجعين لمختبر مستشفى الأسد الجامعي بدمشق بقصة إجهاضات عفوية متكررة (إجهاضين على الأقل), بقيت غير معروفة السبب بعد نفي العوامل التشريحية والهرمونية والمناعية والميكروبيولوجية من قبل الأطباء الذين قاموا بتحويل المرضى إلى مختبر المستشفى.
تم إجراء اختبار التنميط النووي (الصيغة الصبغية) karyotyping لكل المرضى بطريقة G banding (6) (مع مراعاة إجراء اختبار مزدوج duplicate لكل حالة).
المواد Materials
- وسط زرع جاهز للمفاويات الدم المحيطي Chromosome medium B يحتوي على: MEM Joklik, وfetal bovine serum, |
الجدول 1:
معدل التبدلات الصبغية لدى مرضى الإجهاضات المتكررة في بعض الدراسات العالمية (1، 2، 4، 5، 8، 10).
Country |
Authors |
Year |
No. of couples studied |
Number |
% |
Pakistan |
Azim M et al . |
2003 |
300 |
16 |
5.3 |
Saudi Arabia |
Al Husein M et al. |
2000 |
193 |
13 |
6.7 |
Belgium |
Fryns JP et al. |
1998 |
1743 |
93 |
5.34 |
China |
Tsui KM et al. |
1996 |
514 |
51 |
9.92 |
Japan |
Makino T et al. |
1990 |
639 |
55 |
8.6 |
Canada |
De braekeleer M et al. |
1990 |
22199 |
1043 |
4.7 |
الشكل 1: تنميط نووي طبيعي (صيغة صبغية طبيعية) للرجل 46;XY, يلاحظ أن كل زوج من الصبغيات الجسدية مؤلف من صبغيين متطابقين تماماً. (ملفات مرضى مخبر مستشفى الأسد الجامعي بدمشق).
الشكل 2: تنميط نووي طبيعي (صيغة صبغية طبيعية) للمرأة 46;XX. يلاحظ أن كل زوج من الصبغيات الجسدية والجنسية مؤلف من صبغيين متطابقين تماماً. (ملفات مرضى مخبر مستشفى الأسد الجامعي بدمشق).
|
والغلوتاتيون، Biochrom AG-Germany.
- محلول KCl بتركيز 0.075 M.
- محلول Colcemide بتركيز 10 µg\ml. (Biochrom AG-Germany).
- محلول التثبيت: يتألف من ثلاثة حجوم من الميثانول, وحجم من حمض الأسيتيك الثلجي. يحضر قبل الاستعمال مباشرة ويحفظ بدرجة حرارة 20?م أثناء مراحل العمل.
- محلول الدارئة الفسفاتي PBS, pH = 7.
- محلول التربسين: 35 ملغ من التربسين 1\250, تحل في 70 مل من الدارئة الفسفاتية.
- محلول غيمزا: 3 مل من ملون غيمزا الخزين, تمدد إلى 100 مل بالدارئة الفسفاتية.
- أنابيب من البولي بروبيلين, سعة 15 مل, مخروطية, عقيمة, خاصة بالزرع الخلوي Switzerland) TPP).
|
| الطرق Methods |
أولاً: الزرع الخلوي للمفاويات الدم المحيطي (3):
يسحب 5 مل من الدم الوريدي للمريض على أنبوب هيبارينات الصوديوم العقيم المفرغ من الهواء Vacutainer BD®)).
يوضع 10 مل من وسط الزرع الجاهز للمفاويات الدم المحيطي في أنبوب مخروطي سعة 15 مل عقيم خاص بالزرع الخلوي.
يضاف 400-200 مكرولتر من الدم المسحوب إلى وسط الزرع.
يحضن المزيج بدرجة حرارة 37?م لمدة 72 ساعة.
ثانيا: الحصاد الخلوي: Harvesting (3):
• بعد انقضاء 70 ساعة بالضبط على بداية فترة الحضن, يضاف إلى الأنبوب 60 مكرولتر من Colcemide ذي التركيز10 µg\ml.
• يحضن بدرجة حرارة 37?م لمدة 40 دقيقة.
• ينبذ الأنبوب بسرعة 1000 دورة بالدقيقة, لمدة عشر دقائق بدرجة حرارة الغرفة.
• يرمى الطافي, ويضاف 5 مل من محلول KCl ذي التركيز 0.075 M إلى الرسابة ذات اللون الأحمر.
• يحضن بعد المزج بدرجة حرارة 37?م لمدة 10 دقائق.
• ثم ينبذ الأنبوب بسرعة 1000 دورة بالدقيقة, لمدة عشر دقائق بدرجة حرارة الغرفة.
• يرمى الطـافي, ثم يضـاف 5 مللتـر من
محلول التثبيت, الحديث التحضير, إلى الرسابة ذات اللون الأحمر الداكن.
• يمزج جيداً ( تأخذ الرسابة لوناً بنياً عند هذه المرحلة ) ويحفظ بدرجة حرارة +6?م لمدة 30 دقيقة.
• ينبذ الأنبوب بسرعة 1000 دورة بالدقيقة, لمدة عشر دقائق بدرجة حرارة الغرفة.
• تعاد عملية الغسيل بمحلول التثبيت والتنبيذ عدة مرات حتى الحصول على رسابة بيضاء (اللمفاويات المنقسمة).
ثالثاً: نشر الصبغياتChromosomes spreading:
بعد عملية الغسيل والتنبيذ الأخيرة, يرمى الطافي مع مراعاة ترك حوالي نصف مللتر من محلول التثبيت فوق الرسابة, تُعلق الرسابة مجدداً بما تبقى من الطافي جيداً, يؤخذ القليل من معلق الرسابة بوساطة ممص باستور, وتوضع عدة قطرات على صفائح زجاجية نظيفة, مع مراعاة رمي القطرات من ارتفاع لا يقل عن 30 ملم (squash preparation). تترك الصفائح لتجف لمدة 24 ساعة بدرجة حرارة الغرفة.
رابعاً: التلوين بطريقة G banding (7):
توضع الصفائح في محلول التربسين ذي التركيز 35mg\70ml عدة ثوان, ثم في محلول الدارئة الفسفاتية (pH = 7) لمدة عشرين ثانية, ثم في محلول غيمزا الممـدد
(3%) عدة دقائق.
خامساً: التنميط النووي (الصيغة الصبغية) Karyotyping
تمت دراسة 20 خلية منقسمة في مرحلة الـ metaphase لكل مريض باستخدام مجهر Nicon E 600 بواسطة العدسة الغاطسة 100x, وتوثيق التنميط النووي (الصيغة الصبغية) لخمسة انقسامات خلوية على الأقل, بتصويرها بواسطة الكاميرا المجهرية Voss Kohler 1300, ومعالجتها بواسطة برنامج حاسوبي Lucia Karyo® من شركة LIM (Czech republic).
|
| النتائج Results |
تمت الدراسة على 80 عينة تابعة لـ 40 زوجاً, وبالنتيجة نجد أن ثلاث عينات فقط أظهرت تبدلات صبغية صريحة. وفيما يلي دراسة توضيحية لهذه التبدلات:
الحالة الأولى:
46;XYt (7;11) (p11; q25)
يظهر الشكلان 3 و 4 أن كامل الذراع القصير للصبغي السابع قد انتقل إلى الذراع الطويل للصبغي الحادي عشر بشكل متوازن, أي دون زيادة أو نقصان في المادة الوراثية, الأمر الذي يفسر عدم ظهور أي أعراض سريرية عند المريض نفسه.
ولكن عند تشكل النطاف لدى هذا المريض, فإنه من المتوقع أن تتشكل بعد الإنقسام المنصف أربعة أنواع من النطاف وفق قوانين الاحتمالات الوراثية المعروفة. ونسبة تشكل كل من هذه الاحتمالات هي 25%. ويبين الشكل 5 هذه الاحتمالات, كالتالي:
الاحتمال الأول: نطاف تحمل الصبغي السابع الطبيعي, والصبغي الحادي عشر الطبيعي. تؤدي هذه النطاف بإلقاحها لبيوض طبيعية إلى إنجاب أطفال طبيعيين.
الاحتمال الثاني: نطاف تحمل الصبغي السابع الطبيعي, والصبغي الحادي عشر غير الطبيعي.
تؤدي هذه النطاف بإلقاحها لبيوض طبيعية إلى تشكل أجنة غير طبيعية, لأن هذه الأجنة ستعاني تثلثاً جزئياً Partial trisomie للصبغي السابع (إزفاء غير متوازن unbalanced translocation), وبالتحديد تثلث الذراع القصير للصبغي السابع, وهذا التبدل لا يتوافق مع الحياة مما يفسر الإجهاض التلقائي لهذه الأجنة.
الاحتمال الثالث: نطاف تحمل الصبغي السابع غير الطبيعي, والصبغي الحادي عشر الطبيعي.
تؤدي هذه النطاف بإلقاحها لبيوض طبيعية إلى تشكل أجنة غير طبيعية, لأن هذه الأجنة
ستعاني نقصاً جزئياً Partial monosomie للصبغي السابع (unbalanced translocation), وبالتحديد نقص الذراع القصيـر للصبغي السـابع, وهذا التبـدل لا يتوافق مع الحياة مما يفسر الإجهاض التلقائي لهذه الأجنة.
الاحتمال الرابع: نطاف تحمل الصبغي السابع غير الطبيعي, والصبغي الحادي عشر غير الطبيعي. تؤدي هذه النطاف بإلقاحها لبيوض طبيعية إلى تشكل أجنة طبيعية من الناحية الظاهرية والسريرية وغير طبيعية من الناحية الصبغية, لأن هذه الأجنة ستحمل التبدل الصبغي ذاته الذي يعاني منه الأب, أي الإزفاء المتوازن (Balanced translocation). ومن المتوقع ألا تعاني هذه الأجنة بعد الولادة (الأطفال) من أية مشاكل سريرية (1).
|
الشكل 3: التنميط النووي (الصيغة الصبغية) لمريض الحالة الأولى تظهر إزفاء صبغي متوازن Balanced Translocation بين الصبغيين السابع والحادي عشر.
الشكل 4 : تنميط نووي جزئي (صيغة صبغية جزئية) لمريض الحالة الأولى تظهر انتقال كامل الذراع الق صير للصبغي السابع إلى الذراع الطويل للصبغي الحادي عشر بشكل متوازن . كما يظهر المخططات المرجعية Ideograms لكل من الصبغيين السابع والحادي عشر.
الشكل 5 : التشكيلات الممكنة للصبغيين 7 و 11 في نطاف مريض الحالة الأولى, والزوجين الصبغيين 7 و 11 في ذريته في حال تلقيح بيوض ذات صبغيين 7 و 11 طبيعيين. |
الحالة الثانية: 46;XX 14p+
يتضح من الشكل 6 بأنه يوجد لدى المريضة مادة صبغية زائدة على الذراع القصيرللصبغي 14 ,وبسبب ضآلة هذه المادة لم يكن من الممكن التأكد من هويتها بواسطة تقنية G banding, وحيث أن المريضة لا تعاني من أية أعراض سريرية, فإن ذلك يؤدي إلى الاعتقاد بأن هذا التبدل هو جزء من إزفاء متبادل متوازن Balanced Reciprocal Translocation لا تسمح حدود الطريقة المتَبعة باكتشافه.
الحالة الثالثة: (Turner Syndrome Mosaic) 46;XX, 45;X Mosaic:
يبين الشكل 7 أن المريضة تعاني من فقدان الصبغي الجنسي X في نسبة قليلة
(حوالي 15 %) من الخلايا, الأمر الذي لا يترافق عادة مع أعراض سريرية صريحة ولكنه من المعروف أن معظم النساء المصابات بهذا التبدل يعانين من الاجهاضات
المتكررة المبكرة (1).
|
| المناقشة Discussion |
|
هدفت دراستنا بشكل أساسي إلى إلقاء الضوء على معدل تقريبي لظاهرة التبدلات الصبغية لدى الأزواج الذين يعانون من مشكلة الإجهاضات المتكررة في سورية. وبمقارنة معطيات دراستنا مع المعطيات الموجودة في الجدول (1) نجد أنه كان من الممكن الوصول إلى نتائج أكثر دقة بزيادة عدد الأزواج في مجموعة الدراسة, وذلك بهدف الإقلال من تأثير عامل الصدفة
|
الشكل 6 : التنميط النووي (الصيغة الصبغية) لمريضة الحالة الثانية تظهر مادة صبغية زائدة على الذراع القصير للصبغي 14 , يمكن أن تشخص على أنها Balanced reciprocal translocation
الشكل 7 : التنميط النووي (الصيغة الصبغية) لمريضة الحالة الثالثة تظهر فقدان الصبغي الجنسي X من بعض الخلايا. |
| بسبب قلة المرضى في دراستنا مع قصر الفترة الزمنية نسبياً التي تمت بها الدراسة, مع ضبط معايير قبول المرضى في الدراسة التي تشترط نفي العوامل التشريحية والهرمونية والمناعية والميكروبيولوجية من قبل الأطباء الاختصاصيين مسبقاً (وهو الشرط الذي لم يذكر صراحة في الدراسات العالمية المبينة في الجدول 1), بالإضافة إلى كلفة الاختبار المرتفعة. مع ذلك نجد أن النسبة المئوية التي خلصت إليها الدراسة (7.5%) تقع ضمن المجال المذكور في الأدب الطبي في الدراسات التي تمت ما بين عام 1990 وعام 2003 في مناطق مختلفة من العالم, (الجدول 1), ونأمل أن نتمكن من تدقيق هذه النسبة في المستقبل من خلال دراسات أكبر تخص هذا الموضوع في سورية. |
| الاستنتاج Conclusion |
|
يجب إجراء التنميط النووي (الصيغة الصبغية) لكلا الزوجين الذين يعانون من مشكلة الإجهاض المتكررفي حال سلبية الاستقصاءات السريرية والمخبرية الروتينية المتعلقة بهذه المشكلة. كما يجب إجراء هذا الاختبار بشكل روتيني لجميع محاصيل الحمل المُجْهَضَة, الأمر الذي يساعد الطبيب على التوجه المبكر نحو التبدلات الصبغية عند الزوجين في نسبة لا بأس بها من الحالات.
|
| المراجع References |
1-Al Hussain M; Al-Nuaim L; Abu Talib Z. and Zaki O.
Cytogenetic study in cases with recurrent abortion in Saudi Arabia.
Ann Saudi Med, 20(3-4): 233-236, 2000.
2-Azim M; Khan AH; Khilji ZL; Pal JA. and Khurshid M.
Chromosomal abnormalities as a cause of recurrent abortions: a hospital experience.
The journal of Pakistan medical association, 53(3):117-119, 2003.
3-Clouston HJ.
Lymphocyte culture in, "Human Cytogenetics constitutional analysis.
ed. Roony D; Pub. Oxford University press, New york, 33: 41, 2001.
4-De Braekeleer M. and Dao TN.
Cytogenetic studies in couples experiencing repeated pregnancy losses.
Human Reproduction (Oxford-England), 5(5): 519-528, 1990.
5-Fryns JP. and van Buggenhout G.
Structural chromosome rearran-gements in couples with recurrent fetal wastage.
European journal of obstetrics, Gynecology, and reproductive biology. 81(2): 171-176, 1998.
6-Kingston H.
Common chromosomal disorder, in "ABC of clinical genetics".
pub. BMJ, London ,21: 23, 2002.
7-Kohler A.
Chromosome staining.
in "Diagnostic Cytogenetics", ed. Wegner R, pub. Springer, Berlin, 56: 57, 1999.
8-Makino T; Tabushi T; Nakada K; Iwasaki K; Tamura S. and Iizuka R.
Chromosomal analysis in Japanese couples with repeated spontaneous abortions.
International Journal of fertility. 35(5): 266-270, 1990.
9-Schinzel A.
Catalogue of unbalanced chromosome aberrations in man.
Pub. Wde G; Berlin, 814: 817, 2001.
10-Tsui KM; Yu WL; Lo FM. and Lam TS.
A cytogenetic study of 514 Chinese couples with recurrent spontaneous abortion.
Chinese medical journal. 109(8): 635-638, 1996.
|
| |
| المجلد 3 , العدد 10 , ذي الحجة 1426 - كانون الثاني (يناير) 2006 |
|
|
|
