| الملخص Résumé |
تتألف جزيئات HLA ( مستضدات الكريات البيض البشرية) من بروتينات سكرية تتوضع بشكل أساسي على أغشية الخلايا المنواة، وهي متعددة الأشكال وتلعب دوراً أساسياً في الاستجابات المناعية وفي مناعيات الاغتراس.
أدى التنوع المثير للانتباه لمستضدات HLA لإجراء اختبارات مصلية على نطاق واسع. وحديثاً، بينت الاختبارات المجراة بواسطة طرق البيولوجيا الجزيئية أنها تمكن من تحديد الأساس البنيوي لهذا التنوع الهائل من المورثات التابعة لمجمل التوافق النسيجي HLA أكثر مما تظهره التحاليل المصلية. وبشكل خاص، المورثة الشديدة التنوع للمنطقة HLA-D التي هي الموضع DRB1 التي ترمز أكثر من 70 أليل بينما لا تحدد الطرق المصلية أكثر من 14 نوع من HLA-DR.
لقد أدى حالياً توفر تسلسلات أليلية من معرفة أليل لـ HLA مباشرة في مستوى DNA (التنميط الجيني)، مما فتح الآفاق لتنميط بديل عن التنميط الأصلي. بشكل خاص، تهجين الـ DNA، المضخم مسبقاً في الزجاج بواسطة تفاعلات التضخيم بالـ PCR، ثم ضمها مع قليلات النيكليوتيد Oligonucléotides، السلاسل النوعية (التنميط الدقيق لـ HLA)، مؤدية لتحديد زوج واحد من الأسس النووية الموجودة بين أليلين HLA.
بغية استعمال هذه الطرق استعمالاً نمطياً (روتينياً)، طورت طريقة أخرى سريعة للـ HLA-DR، وتجرى دون اللجوء لاستعمال نظائر مشعة وهي فائقة الدقة وحساسة أيضاً.
بعد إجراء التضخيم بواسطة PCR للـ Xenon 2 لمورثات DRB، يهجن DNA على صفيحة مستدقة بحيث يوضع في كل بئر من آبارها 96 مسبار قليل النيكليوتيد- تسلسل نوعي (20 مسبار/ لتنميط DR). وبعد غسيل آلي، تحلل آبار الصفيحة المستدقة بواسطة جهاز قارئ للصفائح بطول موجة (OD492).
إن صفيحة مستدقة تحوي 96 بئراً، تكفي لتنميط 4 مرضى، ويجرى الاختبار بأقل من 6 ساعات.
|
Les molécules HLA (Human Leukocyte Antigens) sont des glycoprotéines de surface polymorphiques qui jouent un rôle capital dans le contrôle de la réponse immune et en immunologie de transplantation. La diversité remarquable des antigènes HLA a été largement explorée par la sérologie. Plus récemment, les travaux de biologie moléculaire du système HLA ont non seulement expliqué la base structurelle de ce polymorphisme, mais également révélé que cette diversité était en fait bien plus grande que ne le laissait prévoir l'analyse sérologique. En particulier, le gène le plus polymorphe de la région HLA-D est le locus DRB1 qui code pour plus de 70 allèles, alors que la sérologie ne discrimine que 14 spécificités DR.
La disponibilité des séquences ADN alléliques permet maintenant la reconnaissance de n'importe quel allèle HLA directement au niveau de l'ADN (génotypage), ce qui a ouvert la voie à des approches alternatives au typage sérologique. En particulier, l'hybridation de l'ADN, préalablement amplifié in vitro par la réaction d'amplification en chaîne (PCR), avec des oligonucléotides séquence-spécifiques (oligotypage HLA) permet la discrimination d'une seule paire de bases entre deux allèles HLA. Afin de pouvoir utiliser de telles méthodes pour le typage de routine nous avons développé une technique d'oligotypage HLA-DR rapide, hautement discriminative, et ne nécessitant pas l'utilisation d'isotopes radioactifs. Après amplification par PCR de l'exon 2 des gènes DRB, l'ADN est hybridé sur une plaque de microtitration donc chacun des puits est recouvert d'une sonde oligonucléotidique séquence-spécifique (20 sondes/groupage DR).
Après un lavage automatisé et une détection colorimétrique, la microplaque est analysée par un lecteur de plaques (OD492).
Une seule microplaque à 96 puits permet le typage de 4 patients et le test se fait en moins de 6 heures.
|
| المقدمة Introduction |
لقد تنامى في السنوات القليلة الفائتة الاهتمام بالاكتشافات الوراثية وتطبيقاتها في العلوم الطبية والحيوية وأدى تطور علم البيولوجيا الجزيئية بشكل مذهل إلى قلب المفاهيم التي كانت سائدة في علم الوراثة، مما أدى لتعميق المفاهيم الطبية النظرية والعملية والتي كانت تعتمد في السابق على الأعراض والعلامات، فاجتازت حالياً مراحل حاسمة بحيث توصلت مباشرة إلى الأسباب الأولى للأمراض من شذوذات المورثات الجينات Genes إلى الأسس التي تتكون منها المورثات، وبذلك انتقل التشخيص من معرفة النمط الظاهري إلى النمط الوراثي.
يُبنى التشخيص حالياً على تحديد المورثة الشاذة قبل أن يتم تحديد البروتين الشاذ والفيزيولوجيا المرضية أي إلى العلم في الوراثة المعكوسة.
لقد أضيف في السنوات الثلاث الأخيرة طرق مخبرية أكيدة وموثوقة بسطت تدريجياً عبر خبرات عملية حثيثة أدت ?ظهار العلامات الوراثية التي تبدلت عند متلقي الفريسة "الخميرية المستدقة Microchimerisme" ويتم ذلك باستبدال المورثة المريضة بمورثة صحيحة حيث سيظهر البروتين الموافق المصنع من قبل هذه المورثة ويتم التعرف على هذه الخميرية بالطرق المخبرية للبيولوجيا الجزيئية.
لقد طبقت المفاهيم الحديثة في علم الوراثة بطرق عملية ولذلك فإن الذي سيطغى على طب القرن الواحد والعشرين هو مفهومنا المعمق أكثر فأكثر للآليات الوراثية التي تكمن خلف كل حالة مرضية ولا يمضي أسبوع إلا ونتعرف على المورثة المسؤولة عن حالة مرضية معينة ومعرفة مكانها على منظومة المورثات الإنسانية وتتضمن هذه المعرفة عزل المورثة وتهجينها وتسلسل أسسها النووية Nucléotides ثم طرق تعبيرها وأخيراً غرسها للحيوان الموديل الملائم لمعرفة وظيفتها.
لقد أمكن التحري عند الإنسان لمورثات لها علاقة بمجمل التوافق النسيجي وبالتحديد الصنف الثاني Classe II / خاصة عند الأطفال/ ونتج عن ذلك رعاية صحية أو غذائية أو بيئية خاصة لهؤلاء المستعدين ولحمايتهم ومراقبتهم قدر المستطاع من المرض الوبيل المقبل، وهذه الأمراض المتعلقة ببعض مورثات المفاصل، الأمراض المناعية الذاتية، بحيث لا تظهر هذه الأمراض إلا عند الأشخاص المؤهبين أي عند أشخاص يمتلكون على منظومتهم الوراثية مجموعة ألائل معينة تؤهبهم لاستعداد مخصص.
وبفضل البيولوجيا الجزيئيةBiologie Moléculaire سيكون طب المستقبل طباً متوقعاً. فالأفضل توقع الحالة المرضية لتوقيها أو لعلاجها بأسرع ما يمكن.
|
الهدف من البحث: لقد كانت الغاية من إجراء هذا البحث المورثات المتعددة التابعة للمجمل HLA-Dr, DQ, DP, Br للأشخاص المؤهبين في أسر مرضى ظهرت لديهم حالات مرضية معينة، وكذلك تحديد مورثات المجمل السابق للمرضى الموضوعين على لائحة الانتظار، ومعطي الأعضاء: الكلية، القلب، الكبد، الرئة، البنكرياس ونقي العظام. ولقد تم تحديد مورثات المجمل HLA-A, B, C, DrB, DQ, Br في بعض حالات الطب الشرعي والشك بالأبوة.
لقد أنجز في هذا البحث استفراد مورثات المجمل لبعض الأشخاص السوريين.
طرق العمل: هنالك ثلاث طرق اتبعت لتحديد المجمل HLA-Dr, DQ, DP وهي:
أولا: الطريقة المصلية التقليدية مع تعديلات خاصة.
ثانيا: الطريقة الخلوية: الزرع اللمفاوي المختلط.
ثالثا: طريقة البيولوجيا أو الوراثة الجزيئية: وهي طريقة تحديد مورثات المجمل مباشرة.
وسنذكر فيما يلي:
|
| طريقة البيولوجيا الجزيئية
Biologie Moléculaire
مفاهيم وتطبيقات لتفاعل سلسلة البوليميراز PCR:
|
لقد تم حل ألغاز المورثات للمجمل HLA وغيره من منظومة المورثات بفضل هذه الطريقة التي تقبل نتائجها دون شك وبشكل قطعي تفوق كل الطرق الأخرى المصلية والخلوية، وذلك إذا أتقن العمل وأجري بدقة.
مبدأ هذه الطريقة: التطبيق المنهجي لتضخيم DNA. يضخم حجم (جزيء) DNA, RNA بعد نسخها العكوس حيث يمكن الحصول على 1000 - 100 زوج أساس نووي اعتباراً من قطعة صغيرة من جزيء DNA. إن كمية DNA الناتجة بعد عدة ساعات يمكن لها أن تصل إلى واحد مكروغرام. يمكن تضخيم كل سلسلة مورثية انتقائياً إذا عرف منها ما يعادل 15 - 20 أساساً نووياً.
لقد قادت هذه الفكرة الأولية للكشف عن تطبيقات متعددة قلبت المفاهيم المدرسية للتحليل المورثي السابق مثل التهجين المباشر للـ DNA المورثي، إحداث الطفرات في الزجاج، الطبعات الوراثية، والتحليل المباشر للسلاسل Séquançage .... الخ.
إن تتابع ظهور طرق الكشف بالمسابير اللاشعاعية (المسابير الباردة) قد خفف بشكل مدهش طرق البحث الأساسية والتطبيقية عن الأمراض الوراثية والأمراض بالعوامل الخامجة والكشف عن مستضدات التوافق النسيجي، وخاصة التي لا يمكن كشفها بالطرق التقليدية والتي هي هامة جداً في اغتراس الأعضاء.
وبفضل هذه الإنزيم Taq-Polymérase فإن هذه الطريقة التي تدعى:
Polymérase Chain Reaction = PCR. التفاعل السلسلي لإنزيم البوليميراز تمكن من استخدام كميات زهيدة من DNA لإجراء تحليل مورثي، وإن قليلاً من DNA الخلايا المنواة يكفي لإجراء هذا العمل (خلايا من باطن الخد، خلايا دموية منواة، نطاف) مع إنزيم Taq-Polymérase التي تصنع من قبل بكتريا حية تعيش في الحرارة المرتفعة، قادرة على تضخيم المورثة المراد دراستها، ثم تجمع مع جزيئات ذات تسلسل معروف لأحماضها النووية (تدعى بالفرنسية: Amorces، وبالانكليزية: Primers)، يضاف لها نكليوتيدات بشكل مفرق لتكون بذلك اللبنة البدئية للـ DNA. يتم التضخيم بشكله البسيط بجمع جزيء DNA (المؤلف من طاقان) مع جزيئين من النكليوتيد أحدهما يتصل نوعياً بالجزء الرامز لـ DNA، والآخر بالجزء التميم له. تحصل الإطالة لجزء DNA اعتباراً من الجزء التميم، يقوم إنزيم Taq-Polymérase بنسخ كل من الطاقين (Strands – Brins).
إن ميزة إنزيم البوليميراز هي إعادة إطالة جزيئات جديدة من DNA اعتباراً من الجزيئات المصنَّعة مؤدية بذلك لإنتاج أعداد لمتوالية هندسية من DNA.
وتتم دورات الإطالة هذه بواسطة هذا الإنزيم المقاوم للحرارة العالية التي هي ضرورية لمسخ DNA.
مراحل دورة التضخيم: تتألف الدورة من ثلاث مراحل:
المرحلة الأولى تسخين DNA إلى 90?م لأجل المسخ أي لتفريق الطاقين إلى اثنين، ثم إلصاق جزيء من DNA وحيد الطاق Monobrin المصنع في المخبر والموافق لإحدى نهايات المورثة Gene المراد إعادة نسخها وهنا تكون سلسلة الأساس (A-G-T-G-T-C) للجزيء المصنع متممة للسلسلة (T-C-A-C-A-G) من الجزء النهائي لطاق DNA، فيحصل بذلك تضاعف جديد في جزء DNA وتخفض درجة الحرارة إلى (37°م – 55°م) حال حصول هذا الالتحام، ثم ترفع درجة الحرارة من جديد إلى 90°م لتأدية مسخ جديد في DNA بواسطة إنزيم Taq-Polymérase، يفك الجزء المصنع من DNA المطابق نوعياً للأسس السابقة المراد دراستها من جزيء المورثة.
لقد وجدت أجهزة خاصة مبرمجة تقوم بهذا العمل، وبواسطة إنزيم Taq-Polymérase التي تنتقل على طول المورثة بعد تعلقها على نكليوتيد جديد مصنع، ثم تنفصل الجزيئات المصنعة المماثلة تماما لجزء المورثة. تتم عملية الالتحام أو التهجين Hybridation بحسب درجة الحرارة وتركيز الأملاح في الوسط.
التضخيم: إن الزمن اللازم لتضخيم طيقان DNA بواسطة Taq-Polymérase تابع لطول طاق DNA المراد تضخيمه فهو مثلاً 30 ثانية لـ 400-500 أساس نووي بعد 15 دقيقة من التضخيم.
حجم التضخيم: يكون مقدار التضخيم نظريا(n 2) حيث: n = العدد الكامل للدورات.
باعتبار أن التفاعل يتم بشكل متوالية هندسية.
في الحقيقة يحسب مقدار التضخيم y بالعلاقة التالية: y = (1+x)
حيث: x = الوسط الحسابي لدورات التضخيم المجدية.
من الناحية العملية يكون مردود التضخيم لكل دورة هو 0.95 في البداية، ثم ينخفض إلى 0.6 بعد 40 دورة (يصبح تركيز الجزيئات المصنعة Amorces وإنزيم Polymérase غير كافٍ)، كما أن تراكم الفسفات الحرارية Pyrophosphates المثبطة للإنزيم يزداد، وبذلك يصبح مقدار التضخيم y يعادل 10 5
يؤدي تضخيم مورثة عشرين دورة لإنتاج 100 نانوغرام (نغ) من DNA أي (Pg 105) وهو كاف لكشفها بواسطة بروم الايثيديوم Bromure d'Ethidium بعد ترحيلها على هلامة الأغاروز.
تلخص مراحل تضخيم أو إطالة جزيئات DNA المراد دراستها على النحو التالي:
المرحلة 1: مسخ طاقا DNA بدرجة حرارة مرتفعة 95°م تقريباً.
المرحلة 2: تهجين Hybridation الجزيئات المصنعة للـ DNA في مستوى النهايات 5' للسلسلة المراد إطالتها (إعادة الحرارة إلى 40°م، 65°م).
تحدد الحرارة وفقاً لطول ونوعية قِليل النكليوتيد Oligonucléotides المستعمل كَمَشْرَع Primers.
المرحلة 3: تفاعل الإطالة بواسطة إنزيم Taq-Polymérase (استعمال إنزيم مقاوم للحرارة والعمل بدرجة حرارة ثابتة بين 70- 75°م .
يتم المسخ السريع لنتاج الدورة الأولى بواسطة الحرارة، تتم عملية تهجين جديدة لطاقا DNA الآتية من الدورة المضخمة الأولى. يستخدم كل طاق من قبل إنزيم البوليميراز. يتضاعف في كل دورة عدد نسخ جزيئات DNA أي يصبح نظرياً 1024 بعد 15 دورة و 1048576 بعد 20 دورة.
طريقة العمل: تلخص طريقة العمل والتي تمت في قسم المناعيات النسيجية على النحو التالي:
a- استخلاص DNA المورثي للخلايا المنواة من الدم المحيطي.
b- مراقبة التضخيم.
c- تطبيق مسابير مخصصة لـ HLA-Dr على DNA المضخم.
d- تعيين المجمل الوراثيHLA-Dr, DQ, DP
|
a- استخلاص DNA المورثي:
استخلص DNA المورثي بإتباع المراحل التالية:
1- حل الكريات الحمر للتخلص منها وذلك بجمع 50 مل من الدم الوريدي على EDTA بنسبة حجم EDTA إلى 9 أحجام دم، بحيث يعطي 30 مل دم كامل 600 مكروغرام DNA.
ينبذ الدم 10 دقائق بمقدار 1500 دورة بالدقيقة، تفصل طبقة البلازما بعناية عن الدم الكامل بحيث تبقى الطبقة البيضاء السطحية، ثم يضاف المحلول الذي يحل الكريات الحمر وتركيبه باختصار عبارة عن كلور الصوديوم والمغنزيوم وملح TRIS وماء مقطر بمقادير معلومة على أن يكون pH=7.6.
2- استخلاص DNA المورثي: يوجد عدة طرق لحل الخلايا المنواة. الطريقة التي اتبعت هي إحدى طرق زيادة الحلولية خارج الخلوية باستعمال كلور الصوديوم المشبع: Téchniques de relargage 6M، يركب هذا المحلول المشبع لكلور الصوديوم 6M ويوضع بدرجة +4°م لمدة 12 ساعة. خلال هذا الزمن يضاف لراسب الكريات البيض المحلول الحال لها ويتألف من Tris-EDTA مضافاً إليه كلور الصوديوم 4M وكبريتات الأمونيوم مع إنزيم حال للكريات البيض هي البروتيناز Protinase – K بمقادير معلومة
على أن يكون pH=8.
يضاف مقدار مناسب من هذا المحلول إلى راسب الكريات البيض بدرجة حرارة 20°م، ثم يوضع المزيج المستحلب في أنبوب على حامل يدور باستمرار في محم جاف درجته 42°م طيلة 12 ساعة لكي ينحل الغشاء النووي حيث أن دور البروتيناز (ك) هو حل الخلايا البيض والخلط الخفيف لحل الغشاء النووي.
3- ترسيب DNA في اليوم التالي بواسطة محلول كلور الصوديوم المشبع حيث تضاف كمية معلومة للراسابة، بعد ذلك يمزج الخليط بالرج العنيف للحصول على مزيج حليبي رغوي، ينبذ 15 دقيقة بسرعة 5000 دورة بالدقيقة.
4- يضاف 2 - 3 أحجام من الإيثانول المطلق للحصول على رسابة هلامية تشبه قنديل البحر Méduse.
يكمن نجاح هذه الطريقة بدقة العمل المطلقة للحصول على الهلامة الشفافة التي تمثل خيوط DNA.
تغسل هذه الهلامة بعناية ثلاث مرات بالإيثانول المبرد درجته 70% لطرح الأملاح الزائدة.
يمكن حفظ DNA المستخلص بشكل هلامة بالإيثانول المطلق بدرجة حرارة - 80°م إذا لم تتابع المراحل التالية.
إذا رغب بالمتابعة توضع الهلامة بعد استخلاصها مباشرة بمحلول Tris مع EDTA لحل DNA.
5- يوزن DNA المستخلص بجهاز خاص لقياس الكثافة الضوئية DO بموجة طولها 260 نانومتر.
تعادل كل وحدة من DNA 50 مكروغرام/مل.
b- تضخيم DNA:
استعملت الأجهزة والأدوات والمواد التالية:
- الجهاز المستعمل لإطالة جزء DNA (Thermecycler 9600) من شركة Perkin Elmer.
- الكواشف محفوظة بدرجة حرارة -30°م.
- DNA المصنع (شركة بهرنغرمانهايم) Amorces 10 mm.
- لبنات dNTP 10 mm (شركة بهرنغرمانهايم).
- إنزيم Taq-Polymérase = 5U/ML (شركة بهرنغرمانهايم أو شركة Perkin Elmer).
- دارئة خاصة بالإنزيم، مكثفة عشر مرات (شركة بهرنغرمانهايم أو شركة Perkin Elmer).
- يحضر مزيج يضم كل من هذه الكواشف بكميات دقيقة مدروسة، يضاف لها المقدار المعين من DNA المستخلص. يوضع المزيج في أنابيب دقيقة خاصة بالجهاز المذكور أعلاه والذي من وظيفته العمل بدرجات حرارة متفاوتة مبرمجة لإجراء المسخ والتهجينDénaturation et Hybridation والتضخيم Amplification.
- بعد حوالي ساعة من الزمن (هذا الزمن يتبع عدد العينات- نوع المورثات المضخمة).
- حضرت هلامة الأغاروز من Agarose Nusiève à 3%، أضيف لها ملح الايثيديوم Bromure d'éthidium ثم وضعت في جهاز ترحيل خاص للهلام، حيث يوضع في كل بئر مقدار 1/10 أزرق بروموفينول Bleu de Bromophénol.
- لقد وضع شاهد معلوم Ladder للمراقبة، بحيث يرحل بنفس الشروط Ladder B.R.L (Ref.5613 sa)، صنع شركة بهرنغرمانهايم.
بعد انتهاء الترحيل، وضعت الهلامة في جهاز تصوير مضاء بأشعة فوق بنفسجية، حيث تلاحظ العصابات الحاصلة عيانياً بشكل مباشر ثم بعد إتمام التصوير الفوري.
تدل العصابة في مكان معين وبكثافة معينة على أن DNA قد تضخم بشكل جيد، أما دقة العصابة أو انعدامها فهي دليل على قلة أو انعدام حصول التضخيم.
|
| تطبيق مسابير HLA-DR أو HLA-DQ أو HLA-DPB على DNA المضخم لكل من هذه المواضع على حدة: |
لأجل هذه الغاية اتبعت المراحل التالية:
1- استعملت أغشية من النايلون المشحونة إيجابياً (صنع شركة بهرنغرمانهايم).
وضع مقدار 1/20 من DNA المضخم بواسطة جهاز خاص مبرمج وهو موزع للعينات من صنع شركة Beckman.
انتخب البرنامج المناسب لتوزيع العينات على الأغشية بواسطة الحاسوب ويعمل الجهاز في مراحل متعددة.
مسخ DNA لمدة 10 دقائق بواسطة NaOH = 0.4 ml تم تعديله بواسطة أسيتات الأمونيوم 1M ثم وضع 50 مكرولتر مع كل DNA المضخم على الغشاء، توضع الأغشية بعد ذلك في فرن خاص ترفع حرارته إلى 100°م لمدة 25 دقيقة، بعد ذلك يوضع كل غشاء في أنبوب فالكون من البلاستيك مضافاً له سائل التهجين، يحكم الإغلاق، ثم يوضع بدرجة حرارة 4°م إذا لم تتم المراحل التالية أو يجري ما يلي لإتمام العمل:
1) عملية التهجين Hybridation مع مسابير HLA-DR-DNA (المحدد التركيب والموسوم بالديجوكسين) لكل واحد من الدارئة، يغطى الأنبوب ويوضع على خض مستمر بدرجة حرارة 4°م طيلة 12 ساعة.
2) يغسل الغشاء بالدارئة I المؤلف من ملحين SSPE و SDS ودارئة TMAC المؤلف من ملح TRIS-HCl المعدل إلى pH=8 مع TMAC مع EDTA ذو pH=8 مع SDS حيث يغسل الغشاء مرتين لمدة 10 دقائق بدرجة حرارة المخبر بالدارئة I، ثم يوضع مرة واحدة مع دارئة TMAC لمدة 15 دقيقة بدرجة حرارة 59°م، يتم تبديل الزمن ودرجة الحرارة بحسب نوع المسبار الموضوع على الغشاء.
3) الإظهار Révélation: أجريت كل مراحل الإظهار بدرجة حرارة المخبر مع الخض المستمر وقبل تطبيق المادة المظهرة الكاشفة، يغسل الغشاء بثلاثة محاليل دارئه وهي:
I- دارئةTRIS-HCl مع NaCl.
II- يضاف للدارئة I نسبة 0.2 - 2% من مادة مثبطة للتفاعل.
III- دارئة TRIS-HCl ذات pH=9.5 مع NaCl و MgCl.
يغسل الغشاء لمدة 5 دقائق بالدارئة I مع الخض المستمر ثم يغسل الغشاء 30 دقيقة بالدارئة II.
يضاف للغشاء 2 مكرولتر من أضداد DIG-AP (أضداد ديجوكسين مضاف لها الدارئة II مع الخض لمدة ساعة بدرجة حرارة المخبر).
يغسل الغشاء بعد ذلك مرتين لمدة 15 دقيقة بـ 100 ميلي لتر من الدارئة I .
يحضن بعد ذلك دقيقتان مع الدارئة III.
يوضع الغشاء على طبقة من النايلون، يغطى بالدارئة III المضاف إليه مقدار 10 مكرولتر من المظهر LUMIGEN بمقدار محدد حسب كمية DNA في كل بقعة، ثم يغطى بطبقة من النايلون ويحضن 5 - 15 دقيقة بدرجة حرارة 37°م.
يجرى تصوير ذاتي باستعمال فيلم شعاعي عادي، يتم التعريض للفيلم الشعاعي على مرحلتين، الأولى لمدة 5 دقائق والثانية لمدة 10 دقائق.
يمكن بهذه الطريقة إجراء التهجين والإظهار باستعمال هذه الأغشية من النايلون المشحونة إيجابياً والتابعة لشركة بهرنغرمانهايم.
4- تعيين المجمل الوراثي:
يؤخذ الفيلم الشعاعي Blot ويوضع على جهاز كاشف لقراءة البقع Spots التي تقابل مع جدول معياري موضع عليه نوعية المسابير التي استعملت في الاختبار.
يدل كل مسبار على نوعية محددة من أفراد المجمل النسيجي، وإن كل المسابير المستعملة تختبر بقعة DNA.
في مركـز المناعيات النسـيجية في مدينة
ليون الفرنسية، تم تحديد المجمل النسيجي HLA-DR بطريقة حديثة جداً، حيث انتهى تقييمها في C.R.T.S-LYON وسينتهي قريباً في مدينة ستراسبورغ وجنيف في مراكز المناعيات النسيجية لهاتين المدينتين.
تنص هذه الطريقة على مبدأ المقايسة المناعية الإنزيمية بعد استخلاص DNA لكريات بيض الدم المحيطي وتضخيمها بواسطة إنزيم Taq-Polymérase على جهاز Thermocyclar التابع لشركة Perkin Elmer . وقد طورت هذه الطريقة شركة Bio-Merieux-Marcy-L'Etoile-LYON في مركز البحوث التابع لها والموجود في ضواحي مدينة LYON.
الطريقة أبسط من السابقة وهي نوعية وسريعة وتستند على مبدأ التهجين العكسي بطريقة المقايسة المناعية الإنزيمية ELISA. تكشف عن 10 نوعية HLA-DR الموجودة على موضع DRB5, DRB3, DRB1 فقط. ولا تزال الأبحاث جارية لتحديد المجمل HLA-DQ.
مبدأ الطريقة: يستعمل 23 مسباراً، عشرون منهم نوعياً لـ HLA-DR وشاهدان إيجابيان وشاهد سلبي.
تستعمل صفيحة من لدائن البلاستيك مقسمة تقسيماً خاصاً وتحوي على ستين بئراً، 24 بئراً لكل عينة DNA.
يجري تهجين DNA المستخلص والمضخم، يتم الغسيل بعد ذلك بدارئة خاصة ثم توضع مسابير نوعية Oligonucléotides-HLA-DR، توسم بواسطة إنزيم البيروكسيداز وضدها، ثم تظهر بـ OPD وحمض الكبريت (السلفوريك)، يقرأ اللون بواسطة مقياس الطيف الضوئي لتحديد الآبار التي يظهر عليها اللون البرتقالي الواضح الذي يدل على أنها تحمل النوعية المحددة للمسبار من أنواع HLA-DR.
|
| المناقشة والاستنتاج: |
يتطلب القصور الوظيفي النهائي لأي عضو من أعضاء الجسم (كالقصور الكلوي في مراحله النهائية والقصور القلبي) غرس عضو مماثل جينياً من شقيق مماثل بمجمل التوافق النسيجي HLA أو من شخص آخر مماثل جينياً.
لقد تطورت هذه المعالجة كثيراً في السنوات الأخيرة بحيث أنشئ لها مراكز مستقلة وطنية ودولية وعالمية يتم فيها تبادل الأعضاء الملائمة للأشخاص الموضوعين على لائحة الانتظار.
يتطلب نجاح اغتراس الأعضاء التلاؤم النسيجي في المجملين HLA-, ABO وخاصة في الصنف HLA-Class II بين المعطي (الواهب) والمتلقي.
لقد تمت طرق التهجين الوراثي لتحديد هذا المجمل بشكل عملي بفضل طريقة PCR-SSO و PCR-SSP حيث أمكن تحديد النوعيات المتورطة في نجاح واستمرار الغريسة بين المعطي والمتلقي، وإن توافقها التام يؤدي لاستمرار نجاح الغريسة في جسم المتلقي.
فمثلاً، ينتج عن حالات قصور النقي (Aplasie Médullaire) بسبب توقفه عن إنتاج الخلايا الدموية أو استعماره من قبل الخلايا السرطانية (Leucémie) اضطرابات خطيرة تودي بحياته، وإن العلاج الشافي الأمثل في هذه الحالات يكون عبارة عن نقل النقي لهؤلاء المرضى من أشخاص واهبين لهم ومتماثلين وراثياً بالمجمل HLA-Class II تحديداً. وإن المعطي المناسب قد يكون ضمن أشقاء هذا المريض، وإذا لم يكن فلقد أوجدت حالياً سجلات وطنية وعالمية يسجل فيها المتبرعين للنقي بحيث تحدد منظومتهم الوراثية بالطرق المخبرية الآنفة الذكر، وتحفظ النتائج في الحاسوب الموجود في المخبر المركزي للرجوع إليها في حالات قصور النقي النهائي أو ابيضاض الدم عند مريض ليس له شقيق ملائم.
تجرى عملية المطابقة الوراثية ويستدعى المتبرع المناسب لإعطاء النقي، فهي عملية طوعية إنسانية دون مقابل لا يلحق بالمتبرع أي خطر إذا أتقن العمل، بحيث يمكنه العودة لوضع اسمه في السجل بعد ستة أشهر من تبرعه.
|
| المراجعRéférences |
1-Préface de la deuxième édition
La Biologie Moléculaire.
J. Dausset, Edition Flammarion, 1993.
2-American Society for Histocom-patibility and Immunogenetics.
Human Immunology, 39, 96-105, 1994.
3-Préface de la 2ème édition,
La Biologie Moléculaire appliquée à la médicine.
J. Dausset, Edition Flammarion 1993.
4-Miller S.A, Dykes and Pelesky H.F.
A Simple Saulting-out.
5-Bio-Merieux
Marcy-L'Etoile, LYON, 1998.
6-Cros et al.
Lancet, 340: 870, 1992.
7-Société Suisse de Médecine Interne.
Lausanne, 13-15, mai 1993.
|
| |
| |
| المجلد الثالث - العدد 2 - ذي القعدة 1424 - كانون الثاني 2004 |
| |
