SCLA مجلة التشخيص المخبري - هيئة مخابر التحاليل الطبية

المجلد 3 , العدد 9 , رمضان 1426 - تشرين الأول (أكتوبر) 2005

تطبيق اختبار رَغابَة Avidity الـ IgG لأضداد المقوسات على عينات مصلية لسيدات حوامل أظهرن ارتفاعاً في عيارها

Toxoplasma IgG Avidity testing on Serum Samples of Pregnant Women with high titer of there antibodies

د. جيهان علي و د. إميل شاهين

Ali J. and Chahine E.

كلية الصيدلة – جامعة دمشق

الملخص Abstract

تمت مقايسة أضداد IgG , IgM و IgA للمقوسات في المصل عند 200 مريضة من الحوامل المشكوك بإصابتهن الحادة بداء المقوسات بطريقة ELISA. كذلك تم إجراء اختبار رَغابَة Avidity الـ IgG على 90 عينة من العينات السابقة التي أبدت قيم IgG مرتفعة وقيم IgM سلبية بطريقة ELISA أيضاً. وقد قمنا بتحديد النسبة المئوية للمريضات ذوات IgM إيجابية فكانت 23.5%. والنسبة المئوية للمريضات ايجابيات IgA بالنسبة لمجموعة المرضى ذوات IgM إيجابية فكانت 23.4%. والنسبة المئوية للمريضات ايجابيات IgG بدرجة عالية وسلبيات IgM 45%. وكانت النسبة المئوية للمريضات منخفضات قيم الرَغابة Avidity 6.6% وهي نسبة المريضات بإصابة حادة.

The concentration of toxoplasma IgG, IgM, and IgA antibodies have been estimated in the serum of 200 pregnant women suspected of having acute toxoplasmosis using ELISA method. Also, the IgG Avidity assay by ELISA method was done on the 90 samples ( of the previous samples) that had high IgG titer and negative IgM titer. The percentage of IgM positive women was calculated and was 23.5%. The percentage of IgA positive in the IgM positive group was 23.4%, and the percentage of patient with high positive IgG titer and negative IgM was 45%. The percentage who had low IgG Avidity values was 6.6, which is a low percentage, and These patients had an acute infection.

المقدمة Introduction

تنتشر الإصابات البشرية بالمقوسات الغوندية في جميع أنحاء العالم, وتكون هذه الإصابات غير ذات اختطار غالباً لدى الأصحاء ولا تؤدي إلى ظهور أعراض سريرية على المريض؛ ولكن يكمن اختطار هذه الإصابات عند الحوامل لأنها تؤدي إلى ظهور أثار سلبية على الجنين. قد لا تلاحظ مباشرة بعد الولادة إنما مع تقدم العمر. ويُعد الإنسان من أكثر الثدييات التي تصاب بهذا الطفيلي (10).
تشير الدراسات إلى اختلاف معدل انتشار المرض من منطقة إلى أخرى لأسباب لا تزال غامضة لكن المعدل الأعلى الذي تم تسجيله كان (93%) عند النساء الباريسيات اللاتي يتناولن اللحم النيء (8).
لقد أجريت عدة دراسات في مراكز متعددة وفي مناطق متعددة على داء المقوسات الولادي وركزت في معظمها على النواحي الإمراضية وعوامل الاختطار أثناء الحمل وطرق الوقاية ودراسة نظم العلاج. كما درس بعضها العلاقة بين وجود أضداد المقوسات والعمر والتوزع الجغرافي فكانت هناك اختلافات واضحة (1، 2، 12).
ونظراً للاختطار الذي يسببه هذا المرض على الجنين في حال إصابة الأم به أثناء الحمل، من إجهاض أو تشوهات، فقد قمنا بإجراء بحث يهدف إلى:
1- مقايسة أضداد المقوسات من نوع IgA عند الحوامل المشكوك بإصابتهن الحادة بداء المقوسات ولديهن أضداد IgM إيجابية , لأن أضداد الـ IgA أكثر نوعية من أضداد الـ IgM في تحديد الطور الحاد.
2- تحديـد النسبة المئوية للحوامـل ذوات
المصول الإيجابية بالنسبة لأضداد المقوسات من نوع IgG مع سلبية IgM ثم إجراء اختبار رَغابَة Avidity الـ IgG على جميع المصول الإيجابية العالية بالنسبة لأضداد IgG لأن هذا الاختبار هو العامل الحاسم في تحديد وقت حدوث الإصابة في هذه الحالة، هل حدثت قبل الحمل أم خلاله.

مبدأ اختبار رَغابة Avidity الـ IgG:
اكتشف Hedman ومساعدوه في فنلندا طريقة تطبيق اختبار رَغابَة Avidity الـ IgG على مصول حوامل ذات نسبة عالية من أضداد IgG. وهو اختبار يساعد في التمييز بين خمج مكتسب حديثاً وخمج سابق (3).
ويعتمد على قياس الألفة الوظيفية لأضداد IgG النوعية للمقوسات بعد تعريضها للمستضد, حيث تكون الأضداد المتشكلة بعد تعرف الجسم على المستضدات ذات ألفة منخفضة, وتزداد هذه الألفة تدريجياً مع نضج الأضداد خلال مراحل الاستجابة المناعية من أسابيع إلى أشهر, وهذه الزيادة ناتجة عن طريقة اختيار خلايا بائية محرضة بالمستضد مما يؤدي إلى زيادة معقدات ضد-مستضد المتشكلة (4، 6، 7).
من المعروف أن ظهور الأضداد العالية من IgG في الشهر الرابع من الحمل لا يحدد بدقة زمن إصابة الحامل. لذلك قمنا بتطبيق هذا الاختبار, بطريقة ELISA, حيث يتم العمل على عينتين لكل مصل, وهو يعتمد على أنه في فترة الحضانة الأولى يتم ارتباط أضداد المقوسات من نوع IgG في حال وجودها في المصل مع المستضدات المغللة coated للآبار. يلي ذلك دورة الغسيل التي تؤدي إلى إزالة المواد غير المرتبطة. ثم في فترة الحضانة الثانية يتم تفكك معقد ضد- مستضد المتشكل سابقاً في الآبار التي يضاف إليها محلول اليوريا. يبقى هذا المعقد دون تفكك في الآبار المضاف لها محلول ممدد العينة. يلي ذلك دورة الغسيل الثانية التي تؤدي إلى إزالة الأجزاء المتفككة. وفي فترة الحضانة الثالثة يتم ارتباط الأضداد المضادة للـ IgG المقترنة مع بيروكسيداز الفجل الحار horseradish مع معقد ضد- مستضد المتبقي. بعد عملية الغسيل التي تتبع هذه المرحلة تتم إضافة محلول مولد اللون (تترا ميثيل بنزيدين TMB) الموجود في دارئة الركازة إلى الحجرات مما يؤدي إلى تشكيل مركب ملون نتيجة تفاعله مع إنزيم البيروكسيداز. يتم إيقاف التطور اللوني بإضافة حمض الكبريت H2SO4 الممدد. وفي الخطوة النهائية يتم
قياس الكثافة الضوئية بواسطة مقياس الطيف الضوئي Spectrophotometer بموجة طولها 450 نانومتر. وبموجة مرجعية طولها 620 نانومتر. وتحسب النسبة بين الكثافتين الضوئيتين للعينة نفسها (5، 9).

المواد والطرق Materials and Methods
شـملت دراستنا 200 مريضة من الحوامل
المشكوك بإصابتهن الحادة بداء المقوسـات
اللواتي راجعن عيادات ومخابر خاصة للتأكد من الإصابة. تمت مقايسة أضداد IgG و IgM عندهن. تبين لنا أن 47 من أصل 200 مريضة لديها أضداد IgM إيجابية, وللتأكد من حداثة أضداد IgM طبقنا طريقة الكشف عن أضداد IgA, كون IgA هو الحكم على حداثة الإصابة في حال IgM إيجابية, لأن إيجابية IgM لا تعني إصابة حديثة بسبب تمكن الأجهزة الحديثة من كشف ثمالات IgM بعد فترة طويلة من الإصابة تمتد أشهر وحتى سنوات. فكان عدد الحالات ذات IgA إيجابية 11 حالة أي بنسبة 23.4% ( بالنسبة لإيجابية أضداد IgM) وبنسبة كلية 5.5% (11).
كما ظهر لدينا 90 عينة ذات IgG مرتفعة و IgM سلبية من أصل 200 عينة السابقة, علما أنه تم أخذ العينات بين الشهر الرابع والسادس من الحمل, حيث طبقنا اختبار رَغابَة Avidity الـ IgG على جميع هذه العينات لكي نحدد فيما إذا كانت الإصابة قد حدثت خلال الحمل أم قبله.
استخدمنا عتائد جاهزة لشركة Radim الإيطالية بطريقةELISA (Enzyme linked Immuno Sorbent Assay).
وقد أخذت عينة دم لكل مريضة على أنبوب جاف, تم تنبيذ العينات بسرعة 4000 دورة/ دقيقة ثم فصل المصل ووضع في أنبوب إيبيندورف, حفظت العينات بالدرجة -20 إلى -70°م إلى حين إجراء المقايسة (خلال 6 أشهر). تمت الدراسة في كلية الصيدلة خلال مدة سنة. وتمت قراءة النتائج على جهاز قارئ ELISA. الجدولان 1 و 2.

الجدول 1: قيم IgG الكلية مقدرة بـ IU/ml المتوافقة مع أرقام العينات.

قيمة IgG	رقم العينة	قيمة IgG	رقم العينة	قيمة IgG	رقم العينة
129.3	61	182	31	> 300	1
129.2	62	181.8	32	> 300	2
127.4	63	179	33	>200	3
124.8	64	177.1	34	>200	4
123.7	65	177	35	>200	5
123	66	176.1	36	>200	6
122.5	67	173.4	37	>200	7
121.9	68	172.1	38	>200	8
121.8	69	172	39	>200	9
121.4	70	169.3	40	>200	10
121	71	169	41	>200	11
119.47	72	168	42	>200	12
119.2	73	166.9	43	>200	13
119.8	74	166.7	44	>200	14
119	75	166.3	45	>200	15
118.4	76	163	46	>200	16
118.3	77	162.4	47	>200	17
118.1	78	162	48	>200	18
118	79	161.6	49	>200	19
117.9	80	158.5	50	>200	20
114.5	81	158	51	>200	21
114.3	82	155	52	>200	22
114	83	147	53	>200	23
113.8	84	145	54	193.7	24
113	85	144	55	192.1	25
111.8	86	138.8	56	192	26
99.8	87	137.8	57	186.6	27
98.9	88	136	58	186	28
97.48	89	131.1	59	183.3	29
86.9	90	130	60	183.1	30

الجدول 2: قيم رَغابة Avidity الـ IgG المتوافقة مع أرقام العينات، وهي نسبة مئوية ناتجة عن تقسيم الكثافة الضوئية للعينة المضاف إليها محلول اليوريا المشبع على الكثافة الضوئية للعينة نفسها دون إضافة محلول اليوريا x 100.

رقم العينة	IgG Avidity	رقم العينة	IgG Avidity	رقم العينة	IgG Avidity
1	88.67	31	80.02	61	63.1
2	102.2	32	58.67	62	70.9
3	42.4	33	82.61	63	28.4
4	102.31	34	45.9	64	44.5
5	54.37	35	47.7	65	98.9
6	40.5	36	51	66	51.5
7	5.8	37	9.13	67	53.94
8	88.2	38	95.5	68	40.04
9	59.3	39	50.16	69	50.46
10	47.1	40	16.7	70	46.1
11	48.7	41	58.8	71	48.87
12	51.7	42	50.7	72	60.7
13	47.3	43	86.6	73	45.3
14	92.08	44	32.5	74	71.4
15	38.25	45	87.7	75	91.4
16	70.34	46	28.5	76	76.6
17	120.04	47	14.8	77	41.2
18	104.4	48	41.8	78	100.9
19	127.6	49	43.4	79	51.42
20	56.6	50	68.88	80	125.6
21	96.7	51	65.96	81	71.44
22	63.8	52	53.1	82	42.5
23	53.9	53	98.2	83	29.4
24	82.18	54	88.09	84	59.4
25	11.55	55	67.44	85	41.03
26	46	56	50.9	86	103.1
27	13.4	57	42.3	87	50.8
28	27.9	58	73.12	88	49.9
29	82.29	59	50.4	89	44.5
30	49.1	60	46.5	90	20.06

تم تحديد النسبة المئوية للمريضات اللاتي أعطين نتيجة اختبار رَغابَة Avidity الـ IgG منخفضة. وقد توافقت دراستنا مع دراسة Montoya Jack S. Remington, Philippe Thulliez, and Jose في فرنسا عام 2004.

النتائج Results
أجرينا اختبار رَغابَة Avidity الـ IgG على 90 من أصل 200 عينة مأخوذة من حوامل مشكوك بإصابتهن الحادة بداء المقوسات وقد راجعن عيادات ومخابر خاصة للتأكد من ذلك. أبدين هؤلاء ارتفاعاً في عيار أضداد IgG, ولكي نحدد فيما إذا كانت الإصابة حديثة أم أنها قديمة والأضداد مرتفعة بشكل دائم. اعتمدنا على الاختبار المذكور لأنه الوحيد الذي يحكم على حداثة الإصابة في هذه الحالة, اعتماداً على زيادة الألفة أو نقصانها.
قمنا بتحديد النسبة المئوية للمريضات اللاتي أبدين قيم رغابة Avidity الـ IgG منخفضة (أقل من 20) فكانت 6.6%. وهذا يعني إحالة الحامل حديثاً خلال الأشهر الثلاثة السابقة لإجراء المقايسة والنسبة المئوية للمرضى، أما الذين أبدوا قيم رَغابة Avidity الـ IgG مرتفعة (أكثر من 30) فكانت 90% أي كانت الإصابة قديمة, وبقي 3.3% ضمن المجال المشكوك فيه (المنطقة الرمادية) grey zone (بين 20 – 30) أي غير محدد بالنسبة للإصابة وعلى هؤلاء المرضى المتابعة والمراقبة.

المناقشة Discussion
قمنا بمقايسة أضداد IgA لجميع العينات التي أبدت إيجابية لأضداد IgM كونه الوحيد الذي يحكم على حداثة الإصابة في حال IgM إيجابية. أما في حال IgM سلبية وIgG إيجابية وذات قيمة عالية نلجأ إلى اختبار رَغابة Avidity الـ IgG.
أجرينا هذا الاختبار على 90 عينة من العينات التي أعطت قيم IgG إيجابية ومرتفعة, ظهر منها 9 عينات ذات قيم رَغابة Avidity أقل من 30:
6 عينات ذات رََغابة Avidity منخفضة, أي بنسبة مئوية 6.6%, وهي نسبة الحوامل المصابات إصابة حادة. لأن انخفاض قيمة الرَغابة Avidity يعني إصابة حديثة وارتفاعها يعني إصابة قديمة, وهذا يعتمد على الألفة الوظيفية لأضداد IgG النوعية للمقوسات بعد تعرضها للمستضد.
و 3 عينات أي بنسبة مئوية 3.3% ضمن (المنطقة الرمادية) grey zone أي مشكوك بإصابتها الحادة بداء المقوسات وهذه تستدعي المراقبة. و 81 عينة أي بنسبة مئوية 90% أعطت قيم رَغابة Avidity مرتفعة وهذا يعني إصابة قديمة والأضداد موجودة والحامل ممنعة.

التوصيات:
عند مراقبة مصول حوامل للتحري عن أضداد المقوسات وملاحظة ارتفاع في مقدار أضداد IgG علينا تطبيق اختبار الرَغابة Avidity للتأكد من عدم حدوث انقلاب مصلي خلال الحمل وخاصة في الأشهر الأولى. أما عندما تكون أضداد IgM إيجابية نتأكد أن الإصابة في طورها الحاد بمعايرة أضداد IgA.

المراجع References

1- Dubey JP. et al.
Sources and reservoirs of toxoplasma gondii infection on 47 swine farms in illinois.
J. parasitol 81 :723-729, 1995.

2-Guebre-Xabier M. et al.
Sero- epedimiological survey of toxoplasma gondii in Europe.
Med. J., 31 :201-208, 1993 .

3-Hedman K; Lappalainen M; Seppala I. and Makela O.
Recent primary Toxoplasma infection indicated by a low avidity of specific IgG.
J. Infect. Dis. 159:736-739. 1989.

4-Remington JS; Thulliez Ph. and Montoya J.
Journal of Clinical Microbiology 42, 3, 941-945, 2004.

5-Lappalainen M; Koskela P; Kokiniemi M; Ammala P; Hiilesmaa V; Teramo K; Raivio KO; Remington JS. and Hedman K.
Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved sero-diagnosis based on Avidity of IgG.
J. Infect. Dis., 167: 691-697, 1993.

6-Liesen feld O; Monotoya JG; Kinney S; Press S. and Remington JS.
Effect testing for IgG Avidity in the diagnosis of toxoplasma gondii infection in pregnant women: experiences in a US. Reference Laboratory.
J. infect. Dis. 183: 1248-1253. 2001.

7-Montoya JG.
Laboratory diagnosis of toxoplasma gondii and toxoplasmosis.
J. infect. Dis. 185: S73-82. 2002.

8-Remington J; Mcleod R; Thulliez ph. and Desmonts G.
Toxoplasmosis, infectious disease of the fetus and newborn infant.
Remington and Klein, 5: 205-346, 2001.

9-Rescaldani R; Vigore L; Vezzo R; Vergani P; Speita A. and Cerruti P.
Infection of toxoplasma and
pregnancy: diagnosis value of a new serological assay: avidity- ELISA of specific IgG antibodies.
Int. J. Feto-Mat. Med. 6(2): 147-153, 1993.

10- جمعة و شاهين
مقارنة الطرائق الحديثة في معايرة أضداد الغلوبولينات المناعية من نوع IgG, IgM في داء المقوسات الغوندية والحصبة الألمانية.

11- جيهان علي و إميل شاهين
مجلة جامعة دمشق, قيد النشر.

12- علاء الريش و د. محمد طاهر اسماعيل
انتشار داء المقوسات عند الحوامل في مشفى التوليد الجامعي بدمشق.
كلية الطب عام 2003.

المجلد 3 , العدد 9 , رمضان 1426 - تشرين الأول (أكتوبر) 2005

SCLA

By Platinum Inc.