| الملخص Abstract |
| مُقَايَسَةُ المُمْتَزِّ المَناعِيِّ المُرْتَبِطِ بالإِنْزِيْم ((ELISA تقنية كيميائية حيوية مناعية عالية الحساسية تسمح بالكشف والتحديد الكمي لعدد كبير من المُكوّنات، تستند هذه الطريقة إلى التعرف النوعي على المركب الهدف (المستضد أو المادة المراد تحليلها) من قبل أضداد ترتبط معه، ويتم كشف معقد ضد- مستضد ومعايرته باستخدام ضد (أو مستضد) موسوم بإنزيم، وعند إضافة الكاشف غير الملون يعطي الإنزيم تفاعلاً لونياً تتناسب شدة اللون فيه طرداً أو عكساً مع تركيز المادة المراد تحليلها في العينة (1، 2).
تستخدم الـ ELISA بشكل رئيسي في المناعيات لكشف وجود ضد أو مستضد في عينة ما، حيث يتم فيها استخدام ضدين، أحدهما نوعي للمستضد والآخر يتفاعل مع معقد ضد- مستضد المتشكل ويكون مقترناً مع إنزيم، هذا الضد الثاني الذي يمثل الجزء المرتبط بالإنزيم "enzyme-linked" من اسم الاختبار يمكن أن يؤدي إلى توليد إشارة بدءاً من ركازة مولدة للون أو التألق (3، 4).
يمكن إجراء الـ ELISA بشكل كيفي أو كمي، حيث تعطي الطرق الكيفية نتيجة إيجابية أو سلبية لعينة ما. أما في الطرق الكمية فيتم إدراج وحدات التألق أو الكثافة الضوئية في منحنى معياري يتم رسمه بدءاً من سلسلة تمديدات للمادة المراد معايرتها.
هناك العديد من المصطلحات والرموز تستخدم في هذه التقنية، وهي مدرجة في الجدولين 1 و 2.
لا بد من توفر المكونات التالية لإنجاز المقايسة باستخدام الـ ELISA:
|
1- الإنزيم Enzyme
يعمل الإنزيم كمضخم amplifier فحتى لو تم تثبيت أضداد قليلة مرتبطة بالإنزيم فإن جزيئات الإنزيم ستولد العديد من جزيئات الإشارة (اللون أو التألق). فالإنزيمات هي محفزات بيولوجية تزيد سرعة تحويل الركازة إلى منتج ولا تسـتهلك أثناء التفاعل وهذا يعني أن الإنـزيم يستطيع أن يحفز
عدة جزيئات من
الركازة مضخماً كمية المنتج المتولد (5، 6).
يمكن مراقبة فعالية الإنزيم مباشرة بمقايسة المنتج المتشكل أو بمقايسة تأثير المنتج على تفاعل مقترن اعتمادا على الركازة المستعملة عندها يمكن أن يقاس المنتج ضوئياً أو تألقياً أو باللمعان الكيميائي. ويوضح الجدول 3 بعض الإنزيمات المستخدمة في الـ ELISA (أو المقايسات المناعية الإنزيمية الأخرى).
|
الجدول 1: تعريف مختصر لبعض المصطلحات المستخدمة في الـ :ELISA
المصطلح |
التعريف |
الطور الصلب
Solid phase |
وهو عادة أنبوب بلاستيكي أو بئر في الصفيحة الميكروية، وهناك صفائح ميكروية خاصة بالـ ELISA متوفرة تجارياً (الشكل 1) ويمكن استخدامها مع معدات خاصة متنوعة مصممة للتعامل السريع مع العينات بما في ذلك الممصات متعددة الأقنية. |
الامتزاز (الادمصاص)
Adsorption |
عملية إضافة ضد أو مستضد ممدد في دارئة بحيث يرتبط بشكل غير فاعل مع الطور الصلب أثناء الحضن، وهي طريقة بسيطة لتثبيت أحد المتفاعلات في الـ ELISA وأحد الأسباب الرئيسية لنجاحها. |
الغسل
Washing |
ملء وتفريغ الآبار بمحلول الدارئة بشكل كاف لفصل العوامل المرتبطة (المتفاعلة) عن غير المرتبطة (غير المتفاعلة) وهي أيضاً خطوة أساسية لنجاح الـ ELISA ويمكن أن تتم يدوياً أو باستخدام الغاسل الآلي (الشكل 3). |
المستضد
Antigen |
بروتينات أو سكريات تحرض إنتاج الأضداد عند حقنها في الحيوانات، ومثل هذه الأضداد يمكن أن تتفاعل بشكل نوعي مع المستضد المستخدم لذلك يمكن أن تستخدم لكشف ذلك المستضد. |
الأضداد
Antibodies |
بروتينات تنتج استجابة للتحريض بالمستضدات، ويمكن أن تكون ذات قدرة مستضدية أيضاً، وكلما ازدادت نوعيتها كانت أفضل (وحيدة النسيلة) |
أضداد ضد النوع
Anti-species
antibody |
وهي تنتج عندما تحقن بروتينات (بما فيها الأضداد) من أحد الأنواع في نوع آخر، فمصل خنزير غينيا الذي يحقن في أرنب يحرض إنتاج أضداد الأرنب ضد خنزير غينيا. |
الإنزيم
Enzyme |
مادة تستطيع التفاعل بتركيز منخفض كحفاز يحرض تفاعل نوعي. ويستخدم في الـ ELISA العديد من الإنزيمات النوعية مع ركازاتها النوعية. |
الإنزيم المقترن
Enzyme conjugate |
إنزيم مرتبط بشكل غير عكوس مع بروتين (عادة ضد) فمثلاً أضداد الأرنب ضد خنزير غينيا المرتبطة مع بيروكسيداز الفجل الحار هي مثال عن الإنزيم المقترن مع ضد النوع. |
الركازة
Substrate |
مركب كيميائي يتفاعل معه الإنزيم بشكل نوعي. يستخدم هذا التفاعل بطريقة ما لإعطاء إشارة تُقرأ كتفاعل لوني أو تألقي. |
حامل اللون
Chromophore |
مادة كيميائية تغير اللون نتيجة تفاعل الإنزيم مع الركازة. |
الإيقاف
Stopping |
عملية إيقاف فعل الإنزيم على الركازة وبالتالي إيقاف تغير اللون في الـ ELISA (محلول حمضي أو قلوي). |
القراءة
Reading |
قياس اللون الناتج في الـ ELISA بمقياس طيف ضوئي خاص في طول موجة معين ويمكن تقدير الاختبارات عينياً. |
الجدول 2: شرح الرموز الواردة في المقال.
الرمز |
الوصف |
I |
الطور الصلب |
- |
الارتباط مع الطور الصلب بشكل منفعل |
Ag |
المستضد |
Ab |
الضد |
AB |
ضد آخر(من نوع مغاير للنوع المعطي لـAb ) |
Anti Ab |
ضد لـ Ab |
Anti AB |
ضد لـ AB |
Enz * |
إنزيم مرتبط مع المتفاعل |
S/C |
جملة الركازة مع حامل اللون |
Wash |
مرحلة الغسل |
C° |
الحضن |
Read |
القراءة |
+ |
إضافة كواشف |
Stop |
إيقاف تطور اللون |
الجدول 3: الواصمات الإنزيمية المستخدمة في المقايسات المناعية.
الإنزيم |
المصدر |
الوزن الجزيئي
(كيلو دالتون) |
الفعالية |
سرعة التقلب |
درجة الحرارة |
الفسفاتازالقلوية |
أمعاء العجل |
140 |
420.000 |
37 |
b-غالاكتوزيداز |
الإشريكية القولونية |
540 |
324.000 |
37 |
غلوكوز أكسيداز |
الرشاشيات السوداء |
186 |
538.000 |
25 |
G-6-PD |
النُّسْتُقَةُ المَساريقِيَّة* |
130 |
93.600 |
30 |
البيروكسيداز |
الفجل الحار |
40 |
220.000 |
25 |
اليورياز |
البقوليات |
540 |
450.000 |
25 |
* النُّسْتُقَةُ المَساريقِيَّة (Leuconostoc mesen-teroides) : جنس من الجراثيم المعوية.
|
إن هذه الإنزيمات مفيدة كواصمات لأنها تحقق المعايير التالية:
1- فعالية نوعية عالية: حيث يتناسب تضخيم الإشارة باستخدام واصم إنزيمي مع كمية الركازة المحولة إلى منتج خلال فترة التفاعل. فالإنزيمات ذات الفعالية النوعية الأعلى تولد التضخيم الأعظم. والمقايسات التي تسـتخدم هذه الإنزيمات ذات حسـاسية ممتازة وقادرة على قيـاس تراكيـز قليلـة جداً من اللجين (الربيطة) ligand.
2- تقترن بسهولة مع اللجين: للإنزيمات أحماض أمينية أساسية أو قلوية، أو مجموعات تيول أو سكريات تقترن بسهولة مع اللجين دون فقدان الفعالية الإنزيمية الحقيقية.
3- الثباتية: إن الواصمات الإنزيمية ثابتة خلال المقايسة وتحت ظروف الخزن بالبرودة.
4- لا توجد في النسيج أو السائل: هذه الإنزيمات لا توجد عادة في السائل الحيوي أو النسيج المراد تحليله.
5- الاحتفاظ بالفعالية: تحتفظ الإنزيمات بمعظم فعاليتها عندما ترتبط مع اللجين أو الضد.
تتوفر الفسفاتاز القلوية (ALP) وبيروكسداز الفجل الحار (HPR) بثمن رخيص وشكل عالي النقاوة. لهذا السبب وللأسباب السابقة فإن هذين الإنزيمين يستخدمان غالباً في الـ ELISA.
يمكن استخدام بعض الإنزيمات المدرجة في الجدول مع ركازات مولدة للون chromogens أو مولدة للتألق fluorogens أو مولدة للمعان luminogens. إحدى فوائد الركازة المولدة للون هي أن منتجها يمكن أن يتم كشفه بصرياً. ويمكن كشف منتجات الفلورة واللمعان بتراكيز أقل بـ 100- 1000 مرة من حوامل اللون، كما يمكن اختصار زمن الحضن معها (7).
2- الركازة Substrate
في حالة الواصمات الإنزيمية يتم اختيار الركازة النقية النوعية للإنزيم لزيادة الفعالية المحفزة للإنزيم إلى حدها الأقصى. وكما هو الحال في أية مقايسة إنزيمية يجب الانتباه إلى إضافة ركازة كافية بحيث لا تستنفد خلال زمن التفاعل، حتى عند ارتباط كمية كبيرة من الإنزيم مع الطور الصلب، والركازات المستخدمة غالباً هي (6، 7):
4-nitrophenylphosphate - لـ ALP
o-phynxylencdiamine dihydrochloride (OPD) - لـ HRP
- Tetra Methyl Benzedine (TMB) لـ HRP
وهي تؤدي إلى إنتاج لون عند تفعيلها بالإنزيمات الخاصة، ويتم كشف اللون إما ضوئياً أو يقاس على قارئ الـ ELISA (7).
3- مركب الاقتران Conjugate
غالباً ما يكون أضداد IgG وأحياناً IgM، أو IgA يقترن مع إنزيم ALP، HRP.
4- العينةSample
يمكن مقايسة العديد من الهرمونات والبروتينات والأضداد وهي ثابتة في المصل لعدة أيام في درجات حرارة منخفضة وللحفظ فترة أطول ينصح بتجميد العينة (-20°م) (6، 7).
5- الطور الصلب solid phase
يجب اختيار البلاستيك أو اللاتكس أو الخرزة
المغناطيسية بحيث لا يُزال العامل الرابط (الملتقِط) بمحلول الغسل تحت ظروف المقايسة. وقد طور العديد من المصنعين صفائح ميكروية بلاستيكية (الشكل 1) وأنابيب اختبار خاصة بالمقايسات المناعية الإنزيمية (2).
6- جهاز القياس Spectrophotometer
يستخدم جهاز سبيكتروفوتومتر لقياس تبدلات اللون الناتجة عن الفعالية الإنزيمية. يمكن أن تؤتمت هذه العملية باستخدام الأجهزة المتوفرة حالياً وهناك إمكان لإجراء مقايسات حركية. عندما يحصل التفاعل في صفيحة صغروية بحجوم محاليل 100-200 ميكرون تستخدم أجهزة سبيكتروفوتومتر خاصة تسمى قارئات العيار الميكروي microtiter readers أو قارئات الإليزا الميكروية readers
microELISA (الشكل 2).
من مساوئ قارئات الصفيحة الميكروية أنها ليست حساسة كمقاييس الضوء الطيفية المعيارية إضافة إلى أنها قارئات لنقطة نهاية التفاعل عادة. على أية حال فإن العديد منها يعطي نتائج صفيحة معيارية ذات 96 بئراً خلال 1-2 دقيقة. وتوجد قارئات ELISA تنجز القراءة خلال عدة ثوان فقط. هناك 3 طرق رئيسية تشكل الأساس لتقانة الـ ELISA:
- الـ ELISA المباشرة.
- الـ ELISA غير المباشرة.
- الـ ELISA ذات الشطيرة.
وهذه المجموعات الثلاث يمكن أن تستخدم في مقايسات تسمى:
- الـ ELISA التنافسية أو التثبيطية.
يمثل الشكل 4 شرح الرموز الواردة في الأشكال المختلفة للـ .ELISA
الـ ELISA المباشرةDirect ELISA : ويمكن إجراؤها وفق الخطوات الرئيسية التالية (الشكل 5):
1- تحضير الطور الصلب.
2- يمدد المستضد في دارئة (كربونات/ بيكربونات أو ملح فسفاتي متعادل) ويضاف إلى الطور الصلب، حيث إن الدارئة لا تحوي بروتينات أخرى يمكن أن تنافس المستضد الهدف على الارتباط مع الطور الصلب البلاستيكي. المستضدات عادة بروتينات بشكل رئيسي وترتبط مع البلاستيك بشكل منفعل (لا تتفاعل معه).
3- الحضن لفترة محددة في درجة حرارة محددة.
4- الغسل لفصل المستضدات الحرة عن المرتبطة حيث تُزال المستضدات غير الممتزة.
5- إضافة الأضداد المرتبطة بالإنزيم، وهي موجهة بشكل نوعي إلى المواقع المستضدية للمستضد المرتبط على الطور الصلب، تكون الأضداد المرتبطة بالإنزيم ممددة في دارئة تحوي مواد تمنع الامتزاز المنفعل للبروتين لكنها تسـمح بالارتباط المناعي،
وهذه المواد إما بروتينات أخرى تضاف بتراكيز عالية لتنافس الأضداد على الطور الصلب أو منظفات بتراكيز منخفضة وتسمى عوامل معيقة، وأثناء الحضن ترتبط الأضداد مع المستضدات.
6- غسل بسيط للتخلص من الأضداد غير المرتبطة والمعقد الباقي على الصفيحة هو مستضد مرتبط مع ضد نوعي موسوم بإنزيم.
7- إضافة ركازة ملائمة أو ركازة/ حامل لون مما يؤدي إلى تطور تفاعل لوني يحفزه الإنزيم. يُسمح للتفاعل بالاستمرار فترة محددة ثم يوقف بتبديل باهاء الوسط أو بإضافة عامل مثبط ثم يقاس اللون باستخدام مقياس ضوئي في موجة طولها ملائم للون الناتج (5، 7، 8، 9).
الـ ELISA غير المباشرة (Indirect ELISA)
ويمكن إجراؤها وفق الخطوات الرئيسية التالية (الشكل 6):
1- تحضير الطور الصلب.
2- يمدد المستضد في دارئة (كربونات / بيكربونات أو ملح فسفاتي متعادل) ويضاف إلى الطور الصلب، حيث إن الدارئة لا تحوي بروتينات أخرى يمكن أن تنافس المستضد الهدف على الارتباط مع الطور الصلب البلاستيكي. المستضدات عادة بروتينات بشكل رئيسي وترتبط مع البلاستيك بشكل منفعل(لا تتفاعل معه).
3- الحضن لفترة محددة في درجة حرارة محددة.
- الغسل لفصل المستضدات الحرة عن المرتبطة حيث تُزال المستضدات غير الممتزة.
5- إضافة أضداد غير موسومة ممددة في دارئة محصرة blocking buffer لمنع الارتباط غير النوعي للبروتينات في المصل الضدي على الطور الصلب.
6- حضن فترة محددة ثم شطف الأضداد غير المرتبطة لتأمين الارتباط النوعي، بحيث يبقى على الطور الصلب معقد ضد- مستضد.
7- إضافة ضد الضد الموسوم بإنزيم ممدداً في
دارئة محصرة.
8- حضن ثم غسل لتأمين ارتباط نوعي للضد الموسوم بإنزيم.
9- إضافة ركازة/حامل اللون وترك اللون يتطور.
10- إيقاف تطور اللون ثم القراءة في موجة طولها ملائم.
الطريقة غير المباشرة تشبه الطريقة المباشرة في كون المستضد يرتبط مباشرة مع الطور الصلب وتستهدفه الأضداد المضافة (الأضداد المتحرية) وهذه الأضداد نفسها تستهدفها أضداد أخرى مرتبطة مع إنزيم، مثل هذه الأضداد تُنتج ضد الغلوبولينات المناعية للنوع الذي أنتجت فيه الأضداد المتحرية وتسمى أضداد ضد النوع "antibodies anti-species"
وهكذا فإذا كانت الأضداد المتحرية تنتج في الأرنب فإن الأضداد الموسومة بالإنزيم يجب أن تكون ضد الغلوبولين المناعي للأرنب. وهذا ما يحقق مرونة كبيرة في استخدام أضداد ضد النوع بحيث يمكن استخدام نوعيات مختلفة من الضد الموسوم لتحري غلوبولينات مناعية معينة مرتبطة في المقايسة وهناك آلاف الأضداد متوفرة تجارياً. وضد الضد للنوع يمكن أن يكون anti-IgM، anti-IgG الطريقة غير المباشرة لها ميزة أن عدداً من المصول الضدية يمكن تحري ارتباطها بمستضد معين باستخدام ضد وحيد موسوم ضد النوع. استغلت هذه الطريقة بشكل كبير في التشخيص خاصة عند فحص عدد كبير من العينات (7-9).
|
|
الشكل 1: صفيحة الـ ELISA ذات الـ 96 بئراً.
الشكل 2: قارئ الـ ELISA . الشكل 3: الغاسل الآلي.
الشكل 4: شرح الرموز الواردة في الأشكال المختلفة للـ ELISA .
الشكل 5: الخطوات الرئيسية للـ ELISA المباشرة.
الشكل 6: الخطوات الرئيسية للـ ELISA غير المباشرة.
|
الـ ELISA ذات الشطيرة Sandwich ELISA
إن مصطلح شطيرة Sandwich آتٍ من حقيقة أن المستضدات تكون محصورة بين ضدين؛ الضد المرتبط بالطور الصلب الذي يسمى أحياناً الضد الملتقِط Capture antibody والضد المرتبط بالإنزيم الذي يسمى الضد المتحري Detector antibody. تتنوع طرق الشطيرة حسب مصدر الأضداد المستخدمة ولتسهيل المصطلحات ستسـتخدم
التعاريف التالية:
الشطيرة المباشرةSandwich Direct والشطيرة غير المباشرة Sandwich Indirect
الشطيرة المباشرة Sandwich Direct
تتضمن هذه الطريقة الارتباط المنفعل للأضداد الملتقِطة على الطور الصلب (الشكل 7)، ثم ترتبط هذه الأضداد مع المستضدات التي تكون ممددة في دارئة محصرة blocking buffer لتجنب الارتباط غير النوعي على الطور الصلب، هنا لا ينبغي أن تحوي الدارئة على مستضدات قد ترتبط مع الأضداد الملتقِطة (6، 7).
بعد الحضن والغسل يبقى معقد ضد- مستضد مثبتاً على الطور الصلب. يتم تحري المستضد المُلتقط (أو المحصور trapped) بإضافة وحضن أضداد نوعية موسومة بإنزيم في دارئة محصرة ترتبط مباشرة مع الأهداف المستضدية على المستضد المُلتقط، هذا الضد الثاني قد يكون كالمستخدم في الالتقاط (الضد الملتقط) أو قد يكون مختلفا. بعد الحضن والغسل تتم إضافة الركازة / مولد اللون ثم يوقف التفاعل ويقرأ اللون الناتج باستخدام جهاز الطيف الضوئي.
بما أنه استخدم ضد واحد موسوم بالإنزيم فإن هذه الطريقة مقتصرة على النوعيات والخصائص الموجودة في ذلك الضد المعين، وهذا ما يحد من تعدد استعمال الاختبار أي أن كل مستحضر مستخدم للضد يجب أن يكون موسوماً ( من أجل مستضدات مختلفة) بالطريقة نفسها التي تكون فيها الـ ELISA المباشرة مقتصرة على مستحضرات ضد واحد.
الطريقة محدودة أيضاً في أن المستضدات يجب أن يكون فيها على الأقل موقعان مستضديان، حيث أن كلاً من الضدين المُلتقِط والمتحري يجب أن يرتبطا بالمستضد، وهذا ما يجعل المقايسة مقتصرة على المعقدات المستضدية الكبيرة نسبياً.
يمكن أن يكون الضدان المُلتقط والمتحري موجهين ضد حواتم مختلفة على معقد المستضد، وهذا قد يكون مساعداً في توجيه الجزيئات المستضدية بحيث تزداد فرصة ارتباط الأضداد المتحرية، ويمكن أن تكون مفيدة في تقصي الاختلافات الصغيرة بين المستحضرات المستضدية باستخدام أضداد متحرية مختلفة وضد ملتقط عام.
الـ ELISA ذات الشطيرة – غير المباشرة:
تتضمن هذه الطريقة الارتباط المنفعل للأضداد الملتقِطة على الطور الصلب، ثم ترتبط هذه الأضداد مع المستضدات التي تكون ممددة في دارئة محصرة blocking buffer لتجنب الارتباط غير النوعي على الطور الصلب، هنا لا يجب أن تحوي الدارئة على مستضدات قد ترتبط مع الأضد الملتقطة.
بعد الحضن والغسل يبقى معقد ضد- مستضد مثبتاً على الطور الصلب (الشكل 8)، يتضمن تحري المستضد إضافة أضداد غير موسومة. بعد الحضن والغسل فإن الأضداد المتحرية نفسها يتم تحريها بإضافة ضد الضد الموسوم بإنزيم. ثم يتابع العمل كما في الطرق السابقة. محاسن هذه الطريقة أن أي عدد من العينات الحاوية على الأضـداد يمكن إضـافتها إلـى المستضد المُلتقط، كما أن النوع الذي تم فيه تحضير الأضداد ليس نفسه كما هي الحال مع الضد المُلتقط. وبشكل أكثر تحديداً فإن الضد المرتبط مع الإنزيم لا يتفاعل مع الأضداد المستخدمة للالتقاط المستضد (10).
المقايسات التنافسية/ التثبيطية
Competition/Inhibition Assays
إن مصطلحي تنافس "Competition" وتثبيط "Inhibition" يصفان المقايسات التي يتضمن القياس فيها التحديد الكمي لمادة بقدرتها على التداخل مع جملة معروفة العيار. تتضمن الجمل كل أشكال الـ ELISA الموصوفة سابقاً. ويمكن استخدام المقايسات لقياس ضد أو مستضد. ويمكن أن نجد مصطلح blocking-ELISA لوصف هذا النوع من المقايسات.
إن الاختصار C-ELISA للـ ELISA التنافسية والاختصار I-ELISA للـ ELISA التثبيطية يستخدمان عادة لوصف المقايسات التنافسية أو التثبيطية للجمل المختلفة التي يتم فحصها.
لابد من وضع مرجع للأوصاف السابقة للجمل الأساسية للـ I-ELISA المباشرة وغير.
المباشرة وذات الشطيرة والتي هي أساس المقايسات التنافسية والتثبيطية
|
الشكل 7: الخطوات الرئيسية للـ ELISA ذات الشطيرة المباشرة.
الشكل 8: الخطوات الرئيسية للـ ELISA ذات الشطيرة غير المباشرة.
الشكل 9–أ: الـ ELISA التنافسية المباشرة (اختبار المستضد).
الشكل 9-ب: الـ ELISA التنافسية المباشرة (اختبار المستضد). |
الـ ELISA التنافسية المباشرة (اختبار المستضد):
في هذه المقايسة تكون كمية المستضد على الطور الصلب معروفة وكذلك كمية الضد الموسوم التي تضاف بالتزامن مع المستضد المنافس (الشكل 9-أ)، إذا كان المستضد هو نفسه المثبت على الطور الصلب أو مشابهاً له فإن الضد الموسوم يرتبط معه، وعندما تكون كمية المستضد المنافس كبيرة فإنه يمنع الضد الموسوم من الارتباط مع المستضد المثبت على الطور الصلـــــب (المنافسة 100%)، وعندما تنقص كمية المستضد المنافس (بالتمديد مثلاً) يلاحظ تناقص المنافسة، وهكذا فإن تأثير إضافة أي عينة يقاس بتناقص اللون المتوقع للجملة المعروفة العيار (المستخدمة كشاهد).
يمكن إضافة المستضد المنافس مباشرة إلى الطور الصلب إذا تم تمديده في دارئة محصرة قبل إضافة الضد الموسوم. تعتمد درجة التنافس على التركيز النسبي لجزيئات الاختبار ومستضد الطور الصلب (ودرجة التشابه المستضدي).
بعد الحضن والغسل فإن كمية الأضداد الموسومة في الاختبار تحدد كمياً بعد إضافة الركازة. وحيثما لا يوجد مستضد في عينة الاختبار أو التشابهات المستضدية محدودة فلا يوجد ارتباط مع الأضداد الموسومة هكذا فإنه لا يوجد ما يمنع (يتنافس مع) الأضداد الموسومة من الارتباط.
النتيجة النهائية هي أنه في العينات التي تحتوي مستضداً هناك تنافس يؤثر على اللون المتوقع، بينما في العينات السلبية لا يوجد تأثير على اللون (11، 12).
ويمكن أن تأخذ شكلاً آخر (الشكل 9-ب):
هذا الشكل مشابه لشكل المقايسة المناعية الشعاعية لأن اللجين (الربيطة) ligand في العينة تتنافس مع لجين مرتبطة على كمية محدودة من المواقع الضدية الرابطة المثبتة على الطور الصلب وبعد حصول تفاعل الربط يغسل الطور الصلب بدارئة لإزالة اللجين الموسومة غير المرتبطة وبذلك لا تشارك في الإشارة. إن كمية الإنزيم المرتبطة مع الطور الصلب تكون متناسبة مع امتصاص أو تألق أو لمعان المنتج المتشكل بعد إضافة الركازة وتتناسب عكسياً مع تركيزاللجين غير الموسومة. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على المواد ذات الوزن الجزيئي المرتفع أو المنخفض المراد تحليلها(13) .
الـ ELISA التنافسية المباشرة (اختبار الضد)
ويمكن تلخيصها بالجدول 4: هذه الطريقة كالسابقة لكن هنا يتم اختبار الأضداد، وهنا
توجد حاجة لوجود جملة معروفة العيار، وتتم المنافسة بإضافة أضداد الاختبار، الجانب التنافسي هنا بين الأضداد الموجودة في عينة الاختبار والأضداد الموسومة النوعية للمواقع المستضدية للمستضد المثبت على الطور الصلب. تمزج عينة الاختبار مع الأضداد الموسومة المعروفة العيار قبل الإضافة إلى المستضد المثبت على الطور الصلب.
الـ ELISA التنافسية غير المباشرة (اختبار الضد)
ويمكن تلخيصها بالجدول 5:
العينات المحتمل احتواؤها على الأضداد النوعية للمستضد المثبت على الطور الصلب تضاف بالتزامن مع الأضداد المعروفة العيار Ab بطريقة تنافسية.
ملاحظة: يمكن استخدام الجملة المعروفة العيار لمعايرة الضد والمستضد.
|
الجدول 4: الـ ELISA التنافسية المباشرة (اختبار الضد).
لا يوجد ضد منافس |
يوجد ضد منافس |
المرحلة |
I-Ag-Ab*Enz
(جملة معايرة مسبقاً) |
I-Ag-Ab*Enz
(جملة معايرة مسبقاً) |
|
I-Ag + O +Ab*Enz
إضافة شاهد سلبي من Ag |
I-Ag + AB +Ab*Enz
إضافة ضد منافس AB في دارئة معيق ثم الحضن مع Ab*Enz لدى الإضافة إلى الطور الصلب |
1 |
°C |
°C |
2 |
Wash |
Wash |
3 |
I -Ag- Ab*Enz
يرتبط الضد الموسوم مع I -Ag |
I-Ag-AB
يتم شطف المعقد Ab -Ab*Enz بالغسل |
4 |
I –Ag- Ab*Enz
يتطور لون |
I-Ag-AB
لا يتطور لون |
5 |
stop |
stop |
6 |
المنافسة معدومة
|
المنافسة %100 Read |
7 |
الجدول 5: الـ ELISA التنافسية غير المباشرة (اختبار الضد).
لا يوجد ضد منافس |
يوجد ضد منافس |
المرحلة |
I-Ag-Ab-AntiAb*Enz
جملة معروفة العيار |
I-Ag-Ab-AntiAb*Enz
جملة معروفة العيار |
|
I-Ag + O + Ab
إضافة عينة سلبية وضد Ab معروف العيار |
I-Ag + ABc + Ab
إضافة ضد منافس ABc وضد Ab معروف العيار معاً |
1 |
°C then wash |
°C then wash |
2 |
I-Ag -Ab |
I-Ag -ABc |
3 |
I-Ag –Ab + AntiAb*Enz |
I-Ag –ABc+ AntiAb*Enz |
4 |
°C then wash |
°C then wash |
5 |
I-Ag –Ab -AntiAb*Enz |
I-Ag –ABc |
6 |
I-Ag –Ab -AntiAb*Enz+ S/C |
I-Ag –ABc + S/C |
7 |
Stop |
Stop |
8 |
Read |
Read |
9 |
يتطور لون |
لا يتطور لون |
10 |
لا توجد منافسة |
توجد منافسة |
11 |
|
التثبيط Inhibition:
يمكن إضافة الضد AB أولاً إلى الآبار المغللة ثم الحضن ويمكن بعدها غسل الآبار أو تفريقها دون غسلها ثم يضاف الضد المتحري Ab.
في هذه الطرق فإن الأولوية فيما يتعلق بالارتباط مع المستضد على الطور الصلب تعطى لعينة الاختبار، الأضداد المرتبطة عندئذ تثبط ارتباط الأضداد الموسومة التي تضاف لاحقاً.
المقايسات التنافسية والتثبيطية في الـ ELISA ذات الشطيرة:
تنجز هذه المقايسات بالطريقة المباشرة وغير المباشرة، وكلاهما تتضمنان استخدام ضد مثبت على الطور الصلب لالتقاط المستضد. في الشطيرة المباشرة يوسم الضد المتحري بإنزيم بينما في الطريقة غير المباشرة لا يوسم الضد المتحري الذي يتم تحريه بضد آخر موسوم.
كلا الطريقتين أكثر تعقيداً وبالتالي يزداد إمكان تنويع خطوات المنافسة أو التثبيط. ويمكن تصنيف هذه المقايسات إلى:
الشطيرة المباشرة: يستخدم فيها ضدان أحدهما ملتقط والآخر متحرّ موسوم.
الشطيرة غير المباشرة: يستخدم فيها ثلاثة أضداد، ضد ملتقط وآخر متحرّ غير موسوم يتم تحريه بضد ثالث موسوم.
ففي الشـطيرة المباشـرة تضاف العينة المراد
اختبارها إلى المستضد الملتَقط ممزوجة مع الضد المتحري الموسوم (تفاعل تنافسي). بعد الحضن والغسل يتطور اللون حسب كمية الضد الموسوم المرتبط. وعندما لا يوجد منافس يكون اللون شديداً (الشكل 10).
إذا أضيفت العينة وتم حضنها فترة من الزمن قبل إضافة الضد الموسوم تسمى المقايسة عندئذ مقايسة تثبيطية. يتبع هذا الحضن إما إضافة أضداد موسومة معروفة العيار مباشرة إلى مزيج التفاعل ثم الحضن أو غسل الآبار لشطف زيادة أضداد الاختبار قبل إضافة الأضداد الموسومة.
بعد ذلك هناك مرحلة حضن للأضداد الموسومة ثم غسل ثم إضافة محلول الركازة/ حامل اللون. وكلما كان تركيز الأضداد في العينة أكبر ازدادت درجة تثبيط الأضداد الموسومة.
الشطيرة التنافسية غير المباشرة (تحري الضد):
يمكن إيجازها بالجدول 6:
نماذج من تطبيقات الـ ELISA
1- تحري وتشخيص الإيدز:
يعد كشف أضداد الـ HIV (Human Immunodeficiency Virus) النوعية حجر الزاوية في اختبار وتشخيص الـ HIV ومن اختبارات كشف أضداد الـ HIV:
اختبارات التحري بالـ ELISA:
تجري هذه الاختبارات لتحري وحدات الدم المتبرع به ومنتجات الدم، وتشمل هذه الاختبارات عددا كبيراً من أشكال الـ ELISA التي تستغرق عادة 3-2 ساعات لإعطاء النتيجة، أما في الاختبارات السريعة فإنها تستغرق نصف ساعة أو أقل (14).
إن مقايسات التحري يجب أن تكشف كل المصول الإيجابية، أي أنها يجب أن تكون عالية الحساسية حتى وإن حصلت بعض الإيجابية الكاذبة، وعلى أية حال فإن نتائج اختبار التحري لا يجب أن تستخدم للتقييم النهائي لحالات الـ HIV ولا يجب أن يتم التشخيص استنادا إلى اختبار التحري لأنه قد تحصل أخطاء تقنية فلابد من إجراء اختبارات تأكيدية.
إن الـ ELISA هي اختبار التحري الأكثر شيوعا حيث تجرى بسهولة، ويمكن تكييفها مع عدد كبير من العينات وهي حساسة ونوعية ورخيصة.
يتوفر تجارياً عدة أنماط من عتائد الـ HIV حسب نمط مستضد الفيروس:
أول جيل تم تطويره للـ ELISA كان حساساً جداً لكنه غير نوعي لأن كل الحلالات الفيروسية (viral lysates) استخدمت كمستضد. هذه الحلالات تحتوي عادة كميات قليلة من مكونات خلايا المضيف وتعطي زيادة في التفاعلات الإيجابية الكاذبة. تطورت تقنيات الـ ELISA وتم تطوير الجيلين الثاني والثالث باستخدام الببتيدات المأشوبة والصنعية كمستضدات، لذا فإن مقايسات الـ ELISA المتوفرة في السوق يمكن أن تكون من :
1- الجيل الأول: باستخدام مستضدات مأخوذة من أشلاء الفيروسات التي تم زرعها في اللمفاويات البشرية.
2- الجيل الثاني: باستخدام مستضدات صنعية
مأشوبة تم التعبير عنها في الجراثيم والفطور.
3- الجيل الثالث: باستخدام قليلات ببتيد oligopeptides مصنعة كيميائيا مكونة مــــن 40-15 حمضاً أمينياً.
- التحري عن أضداد الـ HIV النوعية بـ Indirect ELISA:
حيث ترتبط مستضدات الـ HIV تكافؤياً إلى وسط صلب، يسمح لأضداد الـ HIV الموجودة في العينة بالارتباط، وهذه الأضداد المرتبطة تكشف باستخدام أضداد ضد الغلوبولينات البشرية الموسومة بإنزيم وركازة نوعية، فإذا كانت عينة الاختبار حاوية على أضداد يحصل تفاعل لوني. يعد اختبار الـ Indirect ELISA الأكثراستخداما (15، 16). ويتم كالتالي (الشكل 11):
* تمدد العينة وتضاف للطور الصلب وتحضن لفترة معينة بدرجة حرارة معينة.
* يغسل الطور الصلب لإزالة الأضداد غير المرتبطة.
* يضاف مركب الاقتران (ضد الضد الموسوم بإنزيم) ويحضن لفترة معينة.
* يغسل الطور الصلب لإزالة الفائض من مركب الاقتران.
* تضاف الركازة الملائمة.
* يقاس اللون الناتج بعد فترة معينة باستخدام قارئ الـ ELISA .
ويتناسب تغير اللون طرداً مع كمية أضداد الـ HIV النوعية في العينة.
|
الشكل 10: الشطيرة التنافسية المباشرة (اختبار الضد).
الجدول 6: الشطيرة التنافسية غير المباشرة (اختبار الضد):
لا يوجد تنافس |
يوجد تنافس |
المرحلة |
I-Ab-Ag-AB-AntiAB*Enz
جملة معروفة العيار |
I-Ab-Ag-AB-AntiAB*Enz
جملة معروفة العيار |
1 |
I-Ab-A
إضافة عينة سلبية ممزوجة مع الضد المعروف العيار AB |
I-Ab-Ag
إضافة الضد المنافس Abc ممزوجاً مع الضد المعروف العيار AB |
2 |
°C then wash |
°C then wash |
3 |
I-Ab-Ag- AB
يرتبط AB |
I-Ab-Ag- Abc
Abc يمنع ارتباط AB |
4 |
I-Ab-Ag- AB+ AntiAB*Enz
إضافة AntiAB الموسوم بإنزيم |
I-Ab-Ag- Abc + AntiAB*Enz
إضافة AntiAB الموسوم بإنزيم |
5 |
°C then wash |
°C then wash |
6 |
I-Ab-Ag- AB- AntiAB*Enz
يرتبط AntiAB*Enz |
I-Ab-Ag- Abc
لا يرتبط AntiAB*Enz |
7 |
+ S/C |
+ S/C |
8 |
I-Ab-Ag- AB- AntiAB*Enz |
I-Ab-Ag- Abc |
9 |
يتطور لون |
لا يتطور لون |
10 |
Stop |
Stop |
11 |
Read |
Read |
12 |
لا يوجد تنافس |
يوجد تنافس |
13 |
|
- التحري عن أضداد الـ HIV النوعية بـ Competitive ELISA:
في هذه المقايسة تتنافس أضداد الـ HIV الموجودة في العينة مع الأضداد الموسومة بإنزيم في الكاشف على الارتباط مع المستضد المثبت على الطور الصلب.
فإذا احتوت عينة الاختبار على أضداد الـ HIV فإنها ستتنافس مع الأضداد الموسومة في الكاشف على الارتباط مع المستضد فيظهر لون ضعيف أو لا يظهر لون عند إضافة الركازة. وخلافا لما هو عليه في الـ Indirect ELISA فإن النقص في شدة اللون أو غيابه يشير إلى وجود أضداد الـ HIV النوعية في العينة، واللون الشديد يعني غياب أضداد الـ HIV في العينة. تستغرق الـ Competitive ELISA وقتاً أقل من الـ Indirect ELISA.
- التحري عن أضداد الـ HIV النوعية بـ Antigen and antibody sandwich ELISA
هي تعديل للـ Indirect ELISA لتحسين حساسية ونوعية الاختبار حيث يربط المستضد المثبت على الطور الصلب الضد في عينة الاختبار في المرحلة الأولى وبما أن جزيئات الضد ثنائية التكافؤ فإنها ما تزال قادرة على ربط جزيء آخر هو مستضد الـ HIV الموسوم بإنزيم (مطابق للمستضد المثبت على الطور الصلب) وهكذا تتشكل شطيرة مكونة من معقد مستضد – ضد – مستضد موسوم بإنزيم.
الخطوة التالية هي إضافة ركازة ملائمة مما يؤدي إلى تطور لون يقاس بقارئ الـ ELISA. أحد محاسن الـ sandwich ELISA هي أن كل صفوف أضداد الـ HIV يمكن كشفها.
خطوات الـ sandwich ELISA هي نفسها خطوات الـ Indirect ELISA لكن الخلاف هو أن المستضد الموسوم بإنزيم يضاف محل ضد الغلوبولين البشري الموسوم بإنزيم.
- التحري عن أضداد الـ HIV النوعية بـ :Antigen capture ELISA
حيث يثبت ضد وحيد النسيلة إلى الطور الصلب موجه ضد مستضد الـ HIV. ثم يضاف مستضد الـ HIV الذي يلتقطه الضد الوحيد النسيلة المثبت على الطور الصلب ثم تضاف عينة الاختبار الممددة، فإذا كانت أضداد الـ HIV موجودة في العينة فإنها سترتبط مع مستضد الـ HIV المثبت على الطور الصلب وبقية التفاعل تشبه الـ Indirect ELISA. تتميز هذه الطريقة بأنها أكثر نوعية من الـ Indirect ELISA.
:Antibody capture ELISA
طورت هذه الطريقة لاختبار عينات تكون فيها مستضدات الـ HIV ذات تراكيز منخفضة مثل البول واللعاب أو لكشف صف معين من الأضداد IgA، IgM، IgG وفي هذا الاختبار يثبت ضد الغلوبولين المناعي البشري على الطور الصلب ثم تضاف عينة المريض. يرتبط الغلوبولين المناعي البشري في عينة المريض إلى الغلوبولينات المناعية البشرية الضدية على الطور الصلب. يضاف المستضد الموسوم والذي يرتبط مع أضداد الـ HIV للمريض المرتبطة إلى الطور الصلب ثم تضاف الركازة وتقرأ الكثافة الضوئية على قارئ الـ ELISA (15، 16).
|
2- تحري وتشخيص الحصبة:
تنصح منظمة الصحة العالمية ((WHO عند التحري عن أضداد IgM النوعية للحصبة استخدام اختبار الـ ELISA للأسباب التالية:
• العينات المطلوبة عينة مصل واحدة، ويفضل أن يتم جمعها بين اليوم 3- 28 من حدوث المرض، ولأسباب عملية تجمع العينة حالما تشاهد الحالة.
• الحساسية والنوعية العاليتان.
• سهولة الأداء من الناحية التقنية فمقايسات أضداد IgM النوعية للحصبة مشابهة لتلك المستعملة عند إجراء مسح للـ HIV والتي تطبق عالميا على نطاق واسع.
• بإمكان المخبر إعطاء النتيجة خلال ساعتين من وصول العينة إلى المختبر (17، 18).
- التحري عن أضداد IgM النوعية للحصبة بـ Capture ELISA:
يتم ذلك وفق الخطوات التالية (الشكل 12):
• يرتبط IgM في مصل المريض مع ضد
الضد IgM البشري على الطور الصلب.
• تغسل الصفيحة ليتم التخلص من الغلوبولينات المناعية المصلية .
• يضاف المستضد الفيروسي فيرتبط مع أي ضد IgM نوعي للحصبة يمكن أن يوجد.
• بعد الغسل تكشف المستضدات الفيروسية المرتبطة باستعمال أضداد موسومة للحصبة.
• تضاف ركازة مولدة للون تكشف عن وجود أو غياب أضداد IgM النوعية للحصبة في العينة (19-21).
- التحري عن أضداد IgM النوعية للحصبة بـ Indirect ELISA:
يتم ذلك وفق الخطوات التالية:
• يستعمل العامل الرثياني الممتز للتخلص من أضداد IgG من العينة.
• في الخطوة الأولى يتم امتزاز المستضد الفيروسي على الطور الصلب.
• يضاف مصل المريض وعندها ترتبط أضداد الحصبة النوعية مع المستضد.
يتم كشف أضداد IgM باستعمال أضداد موسومة بإنزيم ضد أضداد IgM ثم تضاف ركازة مولدة للون تكشف عن وجود أو غياب أضداد الحصبة IgM في العينة (19-21).
- التحري عن أضداد IgG النوعية للحصبة بـ Indirect ELISA:
يتم ذلك وفق الخطوات التالية:
• تمتز المستضدات الفيروسية إلى الطور الصلب.
|
الشكل11: التحري عن أضداد الـ HIV النوعية باستخدام Indirect ELISA .
الشكل 12: التحري عن أضداد IgM النوعية للحصبة باستخدام الـ Capture ELISA .
|
• يضاف مصل المريض فترتبط أضداد الحصبة مع المستضد.
• يتم كشف أضداد IgG النوعية للحصبة باستعمال أضداد ضد IgG البشري.
• يتم كشف التفاعل باستعمال ركازة مولدة للون (19-21).
3- التحري الكيفي عن محتوى أنواع الأغذية
ير المطبوخة:
هناك منتجات لعتائد حيوية تستخدم مبادئ الـ
ELISA لتقديم اختبارات حساسة ونوعية، وأكثرها انتشاراً وتوفراً عتائد التعرف على المواد الخام التي تساعد في معرفة محتوى أنواع المنتجات الغذائية غير المطبوخة. يتم التعرف على منتجات الأنواع الحيوانية لأسباب متعددة منها ما هو اقتصادي ومنها ما هو عرقي، لمنع تبديل اللحم بأنواع غير ملائمة أو دون المستوى المطلوب أو بأنواع لحوم خاصة محرمة دينياً (22). ومن الأمثلة على ذلك التحري الكيفي عن الألبومين في المنتجات الغذائية غير المطبوخة (أبقار، خنازير، دواجن، خراف).
مبدأ المقايسة: تستعمل أضداد نوعية ضد الألبومين تغلل على جدران الآبار الميكروية. حيث يرتبط الألبومين المستخلص من العينة إلى الأضداد المغللة على الجدران. وأية مادة غير مرتبطة يتم التخلص منها بالرشف والغسيل. ترتبط أضداد الأضداد النوعية الموسومة بإنزيم البيروكسيداز إلى الألبومين المُلتقط من العينة لإكمال الشطيـرة ‘sandwich’ ويتم التخلص من الفائض بالغسيل وتقاس فعالية البيروكسيداز بإضافة ركازة TMB (رباعي ميثيل البينزيدين) التي تولد لونا أزرق، ويطبق الاختبار وفق المراحل التالية (الشكل 13):
* تُستخلص العينات باستعمال محلول ملحي 0.9%.
* تُضاف الخلاصات الممددة إلى الآبار الميكروية وتتفاعل (مع الأضداد المغللة على الجدران) خلال ثلاث فترات حضن متعاقبة مدة 10 دقائق تتخللها خطوات الغسيل.
* تُضاف أضداد الأضداد النوعية الموسومة بإنزيم البيروكسيداز وركازة TMB على الترتيب.
* مما يؤدي إلى توليد لون أزرق يتحول إلى أصفر عند إضافة محلول التوقف وهذا اللون يتناسب مع كمية الألبومين في العينة.
* يمكن مقارنة النتيجة الكيفية مع عتائد شاهدة (استعراف أنواع اللحم النيء Raw Meat Species Identification Kit).
|
الشكل 13: التحري الكيفي عن الألبومين في المنتجات الغذائية غير المطبوخة.
|
| الاستنتاج: |
|
باستخدام المبادئ السابقة مازالت الـ ELISA تجد لها تطبيقات متزايدة في تحري وتشخيص الأمراض الفيروسية والجرثومية والطفيلية، وفي معايرة الهرمونات والواصمات الورمية والأدوية والسيتوكينات وعوامل النمو وغيرها.
كما وجدت الـ ELISA أيضاً تطبيقات في صناعة الأغذية لتحديد المُسْتَأرِجات allergens الغذائية الكامنة مثل الحليب والفول السوداني والبيض وكذلك للتحري عن محتوى أنواع الأغذية غير المطبوخة وتحري وجود مبيدات الحشرات ومبيدات الأعشاب في الأغذية.
|
| المراجع References |
1-Engvall E. and Perlmann P.
Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA): quantitive assay of immunoglobulin G.
Immunochem 8: 871, 1971.
2-Kemeny DM. and Chaldacombe SJ.
ELISA and other solid phase immunoassays.
New Yourk, Wiley and Sons; 1988.
3-Clark B.R. and Engval E.
Enzyme Immunoassay.
CRC Press, Inc., Boca Raton, FL. 1980.
4-Voller A; Bidwell D.E. and Bartlett A.
The Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), A Guide With Abstracts of Microplate Applications.
Dynatech Laboratories Inc. Alexandria, VA; 1979.
5-Porstmann T. and Kiessig S.T.
Enzyme immunoassay techniques. An overview.
J. Immunol. Meth. 150; 5-21, 1992.
6-Fleming J.O. and Pen L.B.
J. Immunol. Methods, 1110: 11-18, 1988.
7-Carolyn S. Feldkamp.
Immunochemical Techniques.
In: Lawrence A. Kaplan. Amadeo J. Pesce. Steven C. Kazmierczak. Clinical Chemistry 4th ed.Mosby; 238-241,2003.
8-Fujinami A; Obayashi H; Ohta K; Ichimura T; Nishimura M; Matsui H; Kawahara Y. et al.
Enzyme-linked immunosorbent assay for circulating human resistin: resistin concentrations in normal subjects and patients with type 2 diabetes.
Clin Chim Acta; 339(1-2): 57-63, 2004.
9-Youn BS; Yu KY; Park HJ; Lee NS; Min SS. et al.
Plasma resistin concentrations measured by enzyme-linked immunosorbent assay using a newly developed monoclonal antibody are elevated
in individuals with type 2 diabetes mellitus.
J Clin Endocrinol Metab; 89(1): 150-6, 2004.
10-Formento J.L; Berra E; Ferrua B; Magne´ N; Simos G. et al.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Pharmacological Studies Targeting Hypoxia-Inducible Factor.
Clin and Diagnos Lab Immunol. 12 (5): 660-664, 2005.
11-Nugent P.
Enzyme-linked competitive immunoassay.
in: Emerging Strategies for Pesticide Analysis, Cairns T; Sherma J; eds; CRC Press, Boca Raton, Florida. 247-258, 1992.
12-Stephan G. Thompson.
Principles for Competitive Binding Assays.
In: Lawrence A. Kaplan, Amadeo J. Pesce and Steven C. Kazmierczak.
Clinical Chemistry 4th ed. Mosby; 256-257, 2003.
13-Susan Orton
Immunoassays and Nucleic Acid Probe Techniques. In: Michael L. Bishob, Edward P. Fody and Larry Schoeff.
Clinical Chemistry 5th. Lippincott Williams and Wilkings.145-160, 2005.
14-Hirsch M. and Curran J.
Human immunodeficiency viruses: biology and medical aspect.
In: Fields BN; Knipe DM; Chanock RM; Hirsch MS; Melnick JL; Monath TP. and Roizman B, eds. Virology. 2nd ed. New York: Raven
Press,1545-1570,1990.
15-Operational Characteristics of Commercially available Assays to Determine Antibodies to HIV-1 and/or HIV-2 in Human Sera.
Document No. WHO/BLS/98.1 UNAIDS/98.14.
16-Revised Recommendations for the Selection and use of HIV antibody tests. WHO/UNAIDS, 1998.
17-World Health Organization, EPI information system global summary, September (document WHO/EPI/GEN/98.10) 1998.
18-World Health Organization. Standardization of the nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-type measles
viruses.
Weekly Epidemiological Record, 73:265-272, 1998.
19-Erdman DD; Anderson LJ. et al.
Evaluation of monoclonal antibody-based capture enzyme immunoassays for detection of specific antibodies to measlesvirus.
J. Clin. Microbiol, 29: 1466-1471, 1991.
20-Arista S et al.
Detection of IgM antibodies specific for measles virus by capture and indirect enzyme immunoassays.
Res. Virol. 146(3): 225–232,1995.
21-Kleimann MB; Blackburn CKL; Zimmermann SE. and French MLV.
Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay for acute measles with haemagglutination inhibition, complement fixation, and
fluorescent-antibody methods.
J. Clin Microbiol. 14: 147-152, 1981.
22-Bennett G.A; Nelsen T.C. and Miller B.M.
Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of zearalenone in corn, wheat, and pig feed: Collaborative study,
J. AOAC Internat. 77, 1500-1509. 1994.
|
| |
