SCLA مجلة التشخيص المخبري - هيئة مخابر التحاليل الطبية

المجلد 4 , العدد 3 , رمضان 1427 - تشرين الأول (أكتوبر) 2006

مقارنة مقايسات الغلوبولينات المناعية M وG للبروسيلا بالجريان الخلوي مع
اختبارات التراص المصلي و2- ميركابتوإيثانول في تشخيص داء البروسيلات

Comparison of Brucella Immunoglobulin M and G Flow Assays with
Serum Agglutination and 2-mercaptoethanol Tests in the Diagnosis of Brucellosis

ترجمة د. راما عياش عن

Aysin Zeytinoglu, Ajda Turhan, Imre Altuglu, Altinay Bilgic, Theresia H. Abdoel and Henk L. Smits
Clinical chemistry and laboratory medicine (IFCC Journal) 44, 2, 180-184, 2006

الملخص Abstract

قُيّمت القيمة التشخيصية لمعايرات الغلوبولينات المناعية IgG و IgM للبروسيلا بطريقة الجريان (وهي عبارة عن تقنية تعتمد على التعرف على الخلايا حسب حجمها أو تحبحبها وسطوع تألقها وتعتمد على مرور الخلايا ضمن وسط سائل إلى نقطة معينة في الجهاز حيث تعرض الخلايا واحدة تلو الأخرى ويتم فحصها ثم فرزها) مقارنة مع اختبارات التراص المصلي و 2- ميركابتوإيثانول (2-ME) بفحص مجموعة منتقاة من عينات المصل أحيلت إلى المخبر بسبب الشك السريري بداء البروسيلات. أبدت الـ 39 عينة المقبولة وكذلك 11 عينة ملحقة ايجابية التراص في اختبار التراص المصلي اختباراً إيجابياً في المقايسة بالجريان. بينما أبدت 20 عينة سلبية التراص مع شك سريري بداء البروسيلات و 23 عينة مراقبة من أشخاص أصحاء و 20 عينة من إصابات بالتهاب كبد مزمن اختباراً سلبياً بطريقة الجريان الخلوي.
تعد مقايسة IgG و IgM للبروسيلا بطريقة الجريان أكثر حساسية نوعاً ما من اختبارات التراص في التمييز بين الأضداد الـنوعية IgG، IgM.
تتميز مقايسة IgG و IgM للبروسيلا بطريقة الجريان الخلوي بأنها سهلة الإجراء وسريعة حيث يمكن أن تستخدم في تشخيص داء البروسيلات. إن المقايسات بالجريان مفيدة جداً خاصة في المناطق الريفية حيث يكون داء البروسيلات منتشراً بشكل كبير.

The diagnostic value of Brucella IgM/IgG flow assays was evaluated in comparison with serum agglutination and 2-mercaptoethanol tests by testing a selec¬tion of serum samples submitted to the laboratory because of clinical suspicion of brucellosis. All 39 admission and 11 follow-up samples that agglutinated in the serum agglutination test tested positive in the flow assay, whereas all 20 serum agglutination negative samples with clinical suspicion of brucellosis, 23 control samples from healthy individuals and 20 control samples from cases with chronic hepatitis tested negative in the flow assay. The Brucella IgM and IgG flow assays were slightly more sensitive than the agglutination tests in discriminating between specific IgM and IgG antibodies. The Brucella IgM and IgG flow assays are easy-to-perform and quick assays that can be used for the diagnosis of brucellosis. The flow assays are very useful, especially in rural settings where brucellosis is widespread and where well-equipped laboratories to perform the laboratory tests are not readily available.
Keywords: brucellosis; Brucella IgM flow assay; Brucella IgG flow assay; point-of-care test; serology.

المقدمة Introduction

داء البروسيلات مرض يصيب عدة أجهزة مع مدى واسع من الأعراض السريرية ويتطلب اختبارات مخبرية لتأكيد الإصابة.
وهو مرض حيواني جرثومي ينتقل من الحيوانات المصابة بالعدوى إلى الإنسان من خلال تناول الحليب الطازج ومنتجات الحليب المحضرة من حليب غير مبستر ومن خلال التماس مع مفرزات ومنتجات الحيوانات الملوثة (1).
وهو مرض وخيم severe له أثر اقتصادي كبير في منطقة حوض المتوسط. ففي تركيا تتراوح الايجابية المصلية بين 2% و 17.6% في مجموعات دراسة مختلفة (2-4).

تتضمن الفحوصات التشخيصية للبروسيلا:
ـ الزرع
ـ تثبيت المتممة.
ـ المقايسات المناعية الإنزيمية.
ـ اختبارات التراص مثل التراص المصلي (SAT) و 2 ميركابتوإيثانول (2-ME).
ـ اختبار ضد الغلوبولين البشري (تفاعل كومبس).
يؤمن الزرع إثباتا قاطعاً لداء البروسيلات ولكن زرع المكروب يستغرق وقتاً حيث إن النمو الجرثومي بطيء نسبياً ويحتاج إلى خبرة مخبرية وعينات مجموعة بشكل ملائم. وعلى الرغم من أن الزرع هو الاختبار المعياري لداء البروسيلات ومعدل إيجابية الزرع مرتفع في الحالات الحادة إلا أن مستوى العزل يتناقص بشكل ملحوظ في الإصابات المزمنة وأكثر من ذلك يتثبط الزرع عندما تستخدم المضادات الحيوية.
ولهذا فإن التشخيص يعتمد عادة على الطرق المصلية غير المباشرة (5).
كما يمكن أن يستخدم اختبار وردية البنغال Rose Bengal (RB) كفحص تحرٍ سريع ولكنه يتطلب التأكيد باختبار أكثر حساسية.
ـ في المعايير السريرية الروتينية يستخدم SAT غالباً في تأكيد الإصابة، مع معدلات أعلى من عتبة معينة تعتبر متوافقة مع
إصابة حادة للبروسيلا.
ـ يستخدم 2-ME بالمشاركة مع SAT للتميز بين الأضداد الراصة النوعية IgG و IgM (6).
ـ يعد اختبار 2-ME تعديلاً لاختبار SAT ويعد كشف الأضداد النوعية IgM هاماً لتشخيص المرضى المصابين بداء البروسيلات الحاد ولتمييز المصابين بداء البروسيلات المزمن.
تكون أضداد IgM النوعية موجودة في العدوى الباكرة و تبقى عادة قابلة للكشف لعدة أسابيع إلى أشهر. في بعض الحالات يمكن أن تستمر أضداد IgM سنة بعد العدوى.
تتطور أضداد IgG النوعية بشكل متأخر في العدوى وتوجد في المصل أشهراً أو حتى سنين بعد شفاء المريض.
لا تملك جميع المخابر خبرة كافية لإجراء مثل هذه الاختبارات بشكل روتيني لذلك لابد من طرق سريعة وبسيطة مثل أشرطة الغمائس dipsticks (8، 9).
إن معايرات IgG و IgM للبروسيلا بطريقة الجريان الخلوي هي اختبارات تشخيصية سريعة وبسيطة جداً فهي لا تتطلب تدريباً خاصاً ولا أداة غالية الثمن ويمكن أن تجرى في أي مكان حتى في الحقل (10).
قيمت سابقاً مقايسات IgM و IgG البروسيلا باستخدام عينات مراقبة منتقاة ايجابية وسلبية من اسبانيا وتركيا (10، 11). ولتحديد القيمة التشخيصية لمعايرات الجريان الخلوي في مختبر تشخيصي روتيني في تركيا تمت مقارنة النتائج مع نتائج اختبار SAT و 2-ME للمرضى المحالين إلى المختبر بسبب الشك السريري بالإصابة بداء البروسيلات.

المواد والطرق Materials and Methods

يؤمن قسم المكروبيولوجيا السريري لكلية الطب في أزمير خدمات مخبرية لعدد من العيادات الطبية حيث جمعت 70 عينة مصل من 59 مريضاً أحيلوا إلى المخبر بين أكتوبر 2002 وديسمبر 2003 بسبب الشك السريري بداء البروسيلات وتم الحصول على 23 عينة مصل من أشخاص أصحاء، 10عينات من مرضى مصابين بالتهاب الكبد المزمن B (HBV) و 10 عينات من مرضى مصابين بالتهاب كبد مزمن HCV عُدت كمجموعات مراقبة سلبية.
أجري اختبار التراص المصلي على تمديدات متسلسلة مضاعفة بدءاً من 80/1 وعُد التفاعل إيجابياً عند معدل وأجري اختبار 2- ميركابتوإيثانول 2-ME بدءاً من التمديد للعينات إيجابية SAT. إن تناقص العيار في 2-ME مقارنة مع SAT عُدّ متوافقاً مع وجود الأضداد النوعية IgM. حيث عُد 2-ME إيجابياً من أجل عيار أكبر أو تساوي 80/1 مظهراً وجود أضداد IgG النوعية.
تتألف مقايسة الجريان الخلوي من شريطين للمقايسة ضمن أدوات بلاستيكية، واحدة لتحري أضداد الـ IgG النوعية وأخرى من أجل كشف أضداد الـ IgM النوعية. أجريت هذه المقايسة بإضافة 5 مكرولتر من عينة المصل إلى حامل العينة في أداة الفحص البلاستيكية ثم إضافة 130 مكرولتر من سائل الغسل المزود بالاختبارات. تقرأ نتائج المقايسة بعد 10 – 15 دقيقة وتحدد الإيجابية على مدرج من 1 – 4 عندما يلاحظ تلوّن ضعيف (+1) على الأقل عند موضع المستضد في منطقة الاختبار من جهيزة المقايسة.

النتائج Results

إن نتائج الأضداد IgM, IgG للبروسيلا بطريقة الجريان الخلوي والاختبار التشخيصي الروتيني في SAT و 2-ME موضحة في الجدول 1.
ووفقاً لنتائج SAT و 2-ME فإن الأرقـام
هي 25، 7، 7 على الترتيب. وبالاعتماد على شدة كثافة التلوّن اعتباراً من +2 سواء في مقايسة الـ IgG أو في مقايسة الـ IgM بطريقة الجريان فقد أعطت 19 عينة مدخلة نتيجة إيجابية في مقايسة IgM وفقط سبع عينات لدى مقايسة IgG وهنا نلاحظ مدى الحساسية والنوعية في التمييز بين أضداد الـ IgG و IgM بطريقة الجريان لدى مقارنتها مما هي عليه عند إجرائها بطريقة SAT و 2-ME.
ولدى تحري عينات المتابعة المجموعة بعد 1-4.5 شهر من العينة المدخلة فقد أبدت تناقصاً ضعيفاً في شدة التلوّن سواء في مقايسة الـ IgG أو IgM بطريقة الجريان لثمانية مرضى. كذلك نلاحظ تبدل نتيجة مقايسة الـ IgG بطريقة الجريان نحو السلبية في ثلاث عينات من المرضى كما هو ملاحظ في الجدول 2. أيضاً كانت شدة التلون نفسها للعينات المدخلة في مريضين آخرين. وزادت شدة التلون في معايرة الـ IgM بطريقة الجريان لعينة مجموعة بعد أسبوع من العينة المدخلة.
تعد شدة التلوّن إيجابية بدءاً من +2: يبين الجدولين A3 و B3 تحري الأضداد النوعية IgM و IgG. ويبين توافق نتائج مقايسة الـ IgM بطريقة الجريان مع اختبارات التراص في 88% من العينات إيجابية SAT (الجدول 3A) وأيضاً توافق نتائـج مقايسة الـ IgG مع طـريقة 2-ME في 84% من العينات إيجابية SAT (الجدول 3B).
كذلك تم الحصول على نتائج لا متوافقة بين طريقة الجريان واختبارات التراص لعشر عينات مدخلة وثلاث عينات متابعة مع الأخذ بعين الاعتبار تحري الأضداد النوعية IgG وIgM. وفي عشر من هذه العينات اكتشفت مقايسة الجريان وجود كلا الأضداد النوعية IgG و IgM، بينما أظهرت نتائج اختبارات التراص إما أضداد IgM النوعية (6 عينات) أو أضداد IgG النوعية (4 عينات).

المناقشة Discussion

لقد تم تشخيص 39 مريضاً بطريقة الجريان الخلوي والتي كانت إيجابية SAT، كذلك تم الحصول على نتيجة سلبية لـ 63 عينة مراقبة، لذلك تعد طريقة الجريان الخلوي ذات حساسية ونوعية جيدة.
ويعد اكتشاف المسـتويات المرتفعة من الأضداد النوعية IgM مشعراً جيداً للمرض أو للإصابة الحادة أو تحت الحادة كذلك يعد اكتشاف مستويات مرتفعة من أضداد الـ IgG متوافقاً مع مرحلة مستمرة للمرض أو حالة نكسة (10، 11). وفي الدراسات الحديثة للمرضى فإن معظم الدراسات بينت توافق نتائج اختبار المقايسة بالجريان مع تحديد مرحلة المرض الحاد أو تحت الحاد للعينات المدخلة من 19 مريضاً حيث تراوحت شدة التلوّن من +2 إلى +4 لدى مقايسة أضداد الـ IgM بطريقة الجريان بينما وجدت شدة تلوّن ضعيفة +1 لدى مقايسة IgG بطريقة الجريان. أما في مرحلة المرض الطويلة فإن نتيجة الاختبار لـ 4 مرضى كانت متوافقة مع مرحلة مستمرة للمرض حيث أعطت مقايسة الـ IgG بطريقة الجريان +2 ومقايسة الـ IgM +1.
ولكن كما هو ملاحظ في الجدول 2 ففي بعض الحالات لم تحدد نتيجة الاختبار مرحلة العدوى حيث أعطت مقايسة IgM (+1) وكانت مقايسة الـ IgG سلبية أو كلا المعايرتين ذات نتيجة متماثلة (+1) أو نتيجة مقايسة IgM سلبية ومقايسة الـ IgG (+1) ولكن لدى اختبار عينات المتابعة المجموعة بعد أسبوع من جمع العينة الأولى فقد ساعدت في تحديد مرحلة العدوى في بعض الحالات من خلال توضيح بدء الانقلاب المصلي أو زيادة في شدة التلوّن. إن حدوث الانقلاب المصلي أو زيادة في مستوى أضداد الـ IgM النوعية يكون متلائماً مع مرحلة العدوى الحادة. أما ملاحظة زيادة في أضداد الـ IgG النوعية في العينات سلبية الـ IgM فيمكن أن تلاحظ في المرضى المصابين بنكسة، ولكن تلاحظ زيادة في التلوّن في عينات المتابعة المجموعة بعد أسبوع من العينة الأولى أما العينات المجموعة بعد شهر أو أكثر فلم تبد أي تبدل في التلون (حالتين) أو تناقص التلون (8 حالات). ولكن خلال المعالجة تتناقص مستويات أضداد IgM النوعية بشكل أسرع من مستويات أضداد الـ IgG النوعية (10).
وبما أن داء البروسيلات مستوطن في تركيا فإن عيار 160/1 بطريقة SAT يعد متوافقاً مع داء البروسيلات (12). وأظهرت إحدى دراسات الانتشار المصلي أن الايجابية المصلية في AST للعيارات المساوية 160/1 أو التي تزيد عنها لدى السكان ذوي الاختطار العالي والتي لم تعط علامات داء البروسيلات كانت بين 0.8% و 1.0% (13).
لهذا نستنتج بأن مقايسة أضداد الـ IgG و IgM للبروسيلا بطريقة الجريان الخلوي هي أكثر حساسية في اكتشاف المستويات المنخفضة لأضداد IgG و IgM النوعية من اختبارات التراص 2-ME و SAT حيث أن نتائج اختبارات التراص أظهرت وجود أضداد الـ IgM النوعية أو أضداد الـ IgG النوعية فقط. كما أن اكتشاف أضداد IgM النوعية بطريقة التراص يتطلب مقايسة دقيقة للمصل ومقارنة العيارات بين طريقة 2-ME و SAT. كذلك وجود أضداد الـ IgA النوعية يمكن أن يقود إلى تناقص في العيار في اختبار التراص المجرى بوجود 2-ME (14). حيث لا يتم اكتشاف أضداد الـ IgA بمقايسات الجريان. وهذا يفسر الحصول على نتيجة متناقضة لعينة واحدة حيث وجدت سلبية لدى مقايسة الـ IgM بالمقايسة بالجريان بينما أبدت تناقصاً في عيار 2-ME، وداء البروسيلات هو سبب هام للمرضى في تركيا، وفي المناطق الريفية بشكل خاص (15). لذلك فإن وجود طريقة سهلة الإنجاز لتشخيص مصلي سريع لداء البروسيلات سيكون مساعداً جداً في الوحدات الصحية الصغيرة في المناطق الريفية حيث لا يتوفر مختبر مجهز بشكل جيد، بالإضافة إلى كونها اختباراً للأطباء يطبق إلى جانب سرير المريض.

الجدول 1: نتائج مقايسات IgM, IgG البروسيلا بطريقة الجريان الخلوي والاختبار التشخيصي الروتيني في SAT و 2-ME.

No. of sample according to SAT titers						RB+	Brucellosis status
≥1:2560	1:1280	1:640	1:320	1:160	≤ 1:80
3	1	15	9	11	-	39	Admission
-	-	3	5	3	-	11	Follow-up
-	-	-	-	-	63	-	Controls
No. of samples according to 2-ME titers
≥1:640	1:320	1:160	1:80	1:40	≤ 1:20
1	15	8	8	6	1		Admission
-	1	2	3	1	4		Follow-up
staining intensity in Brucella IgM flow assay
Pos.	4+	3+	2+	1+	Neg.
35	1	9	9	16	4		Admission
11	-	2	4	5	-		Follow-up
-	-	-	-	-	63		Controls
staining intensity in Brucella IgG flow assay
Pos.	4+	3+	2+	1+	Neg.
35	-	-	7	28	4		Admission
7	-	-	2	5	4		Follow-up
-	-	-	-	-	63		Controls

الجدول 2: نتائج مقايسات IgM, IgG البروسيلا بطريقة الجريان الخلوي واختبار التراص لمرضى عينات المتابعة.

IgG Flow assay	IgM flow assay	2-ME	SAT	وقت جمع العينة	عدد المرضى
2+	1+	1/320	1/640	0	1
2+	1+	1/80	1/320	3 months	1
2+	2+	1/320	1/640	0	4
2+	3+	1/160	1/320	1 week
1+	2+		1/320	3 months
1+	3+	1/320	1/640	0	10
1+	1+	1/80	1/320	4.5 months	10
1+	1+	1/160	1/320	0	13
N	1+	1/160	1/160	4 months	13
N	2+	1/40	1/160	0	14
N	1+	1/20	1/160	3 months	14
1+	3+	1/1280	1/2560	0	15
1+	2+	1/320	1/640	4 months	15
1+	3+	1/320	1/1230	0	17
1+	3+	1/80	1/640	3 months	17
1+	3+	1/80	1/640	0	22
N	2+	1/20	1/320	1.5 months	22
1+	2+	1/320	1/640	0	28
N	1+	1/20	1/160	4 months	28
2+	3+	1/320	1/5120	0	39
1+	2+	1/40	1/640	1 month	39

الجدول 3A: اكتشاف أضداد الـ IgM النوعية للبروسيلا بطريقة الجريان ومقارنة العيارات بطريقة SAT و 2ME.

Assay IgM flow			IgM SAT-2-ME
	Negative	Positive	IgM SAT-2-ME
	1	41	Positive
	3	5	Negative

الجدول B3: اكتشاف أضداد الـ IgG النوعية للبروسيلا بطريقة الجريان وطريقة 2-ME.

IgM flow Assay		2-ME (≥ 1/80)
Negative	Positive	2-ME (≥ 1/80)
2	36	Positive
6	6	Negative

الاستنتاج Conclusion

تعتبر مقايسة أضداد الـ IgG وIgM للبروسيلا بطريقة الجريان الخلوي مناسبة كاختبار بسيط وسريع للتشخيص المصلي لداء البروسيلات وللتمييز بين وجود أضداد الـ IgM النوعية وأضداد الـ IgG النوعية من أجل تقييم مرحلة المرض.

المراجع References

1-Young EJ.
Brucella species. In: Mandell Gl, Douglas R. and Bennett J.
Principles and practice of infectious diseases.
New York: Churchill Livingstone, 2053-2060, 1995.

2-Cetin ET, Coral B, Bilgic A, Bilgehan H, Sipahioglu U, Gurel M, et al.
Determination of brucellosis incidence in Turkey.
Turk J Med Sci, 14:324-334, 1990.

3-Colak H, Usluer G, Karaguven B, Kose S. and Ozgunes I.
Seroepidemiologic screening for brucellosis in rural are¬as.
Turk J Infect, 5: 83-86, 1991.

4-Celebi S, Babacan M, Tuncel E,. and Ayyildiz A.
The inappa¬rant brucellosis in the Erzurum region, East Turkey.
Turk J Infect 1991;5:175-176.

5-Shapiro DS, Wong JD. Brucella. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. and Yolkan RH.
Manual of clinical microbiology. Washington, DC: ASM Press, 625-631, 1999.

6-Kerr WR, Mccaughy WJ, Coghlan JD, Payne DJ, Quaife RA, Robertson L, et al.
Techniques and interpretation in serodiagnosis of brucellosis in man.
J Med Microbial, 1; 181-193, 1968.

7-Buchanan TM, Sulzer CR, Frix MK. and Feldman RA.
Brucel¬losis in the United States, 1960-1972: an abattoir-asso¬ciated disease. II. Diagnostic aspects.
Medicine, 53: 415-426, 1974.

8-Smits HL, Basahi MA, Diaz R, Maradon T, Douglas JT, Rocha A, et al.
Development and evaluation of a rapid dipstick assay for serodiagnosis of acute human brucel¬losis.
J Clin Microbiol, 37: 4179-4182, 1999.

9-Altuglu I, Zeytinoglu A, Bilgic A, Kamcioglu S, Karakartal G. and Smits HL.
Evaluation of Brucella dipstick assay forthe diagnosis of acute brucellosis.
Diagn Microbiol Infect Dis, 44: 241-243, 2002.

10-Smits HL, Abdoel TH, Solera J, Clavijo E. and Diaz R.
Immu¬nochromatographic Brucella-specific immunoglobulin M and G lateral flow assay for rapid serodiagnosis of human.
Clin Diagn Lab Immunol, 10: 1141-1146, 2003.

11-Irmak H, Buzgan T, Evirgen 0, Akdeniz H, Demiroz AP, Abdoel TH, et al.
Use of a new, simple and rapid diag¬nostic test, the Brucella IgM and IgG flow assays in the serodiagnosis of human brucellosis in
an endemic area in eastern Turkey.
Am J Trop Med Hyg, 70: 688-694, 2004.

12-Mert A, Ozaras R, Tabak F, Bilir M, Yilmaz M, Kurt C, et al.
The sensitivity and the specificity of Brucella agglu¬tination tests.
Diagn Microbiol Infect Dis; 46: 241-243, 2003.

13-Durmaz R, Durmaz B, Rafiq M. and Sِonmez E.
Seropositivity of brucellosis in Malatya, Turkey.
Turk J Med Sci; 27: 125-128, 1997.

14-Marodan E, Nenova-Poliakova R, Rubio M, Ariza J, CIa¬vijo E, Smits HL, et al.
Evaluation of three serological methods to measure Brucella IgM antibodies and inter¬ference of IgA in the interpretation of mercaptan-based tests.
J Med Microbiol; 50: 663-666, 2001.

15-Aydin N, Minbay A, Izgur M. and Yardimci H.
Brucellosis in sheep and goats (in relation to epidemiology and human infection). In: Tumbay E, Hilmi S, Ang O, editors. Bru¬celIa and brucellosis in man and animals.
Izmir: Ege Uni¬versity Press, 51-65, 1996.

المجلد 4 , العدد 3 , رمضان 1427 - تشرين الأول (أكتوبر) 2006

SCLA

By Platinum Inc.