| المقدمة Introduction |
داء المقوسات مرض حيواني المصدر, منتشر في كافة أنحاء العالم, سببه طفيلي المقوسة الغوندية Toxoplasma gondii, تنقل النساء المصابات بهذا الطفيلي العدوى إلى أجنتهن إما عن طريق المشيمة أو أثناء الولادة الطبيعية (1). قد تبقى النساء اللاتي يصبن بالطفيلي في نهاية الحمل سلبيات المصل seronegative عند الولادة (2). يتراوح المرض عند الجنين من شكل مستتر إلى مميت, ويعتمد ذلك على الوقت الذي حصلت فيه العدوى من العمر وفوعة virulence ذرية المقوسة الغوندية والحالة المناعية للمضيف (3).
على الرغم تشابه ذراري المقوسة الغوندية من الناحية الجينية إلا أنها تبدي ثلاث سلالات نسيلية مميزة type I, type II, type III (4), وفيما يتعلق بالخلفية الجينية فإن ذراري النمط (type I) I مفوعة عند الفئران, أما ذراري النمطين II, I فغير مفوعتين.
|
| الطرق Methods |
|
أخذت العينات من مستشفى التوليد والأمراض النسائية التعليمي في ولاية الجزيرة وسط السودان, شملت مجموعة الدراسة 94 امرأة حامل في حالة إجهاض بين الشهرين الثاني والرابع (متوسط العمر29.1 ± 6 سنة), أما المجموعة الشاهدة فشملت 94 امرأة حاملاً, أكملن فترة الحمل وأنجبن أطفالاً سالمين بولادة طبيعية (متوسط العمر27.2 ± 5.5 سنة), كانت جميع النساء غير سكريات ولا يعانين من ارتفاع الضغط. جمعت نماذج النسيج المجهض وحفظت مباشرة في الإيثانول 70% للدراسات الجزيئية, وجمعت من المجموعة الشاهدة الأنسجة المشيمية (الجزء المتصل بالحبل السري) وحفظت بالطريقة نفسها. أجريت الاختبارات في مخبر البيولوجيا الجزيئية, جامعة الملك سعود, السعودية.
|
| التفاعل السلسلي للبوليميراز (PCR)
Polymerase Chain Reaction |
أجري تحليـل PCR لتضخيـم الجينB1
للمقوسة الغوندية باستخدام المشرعين primers التاليين:
B1F1(5´GGAACTGCATCCGTTCATGAG3´)
B1R1(5´TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC3´)
وهذان المَشْرعان يقابلان نوكليوتيدات الجين B1 714-694 و 868-887 على التتالي. ولتجنب التلوث المحتمل فقد استخدمت شواهد سلبية (لا تحوي DNA) وشواهد إيجابية (من ذرارٍ مختلفة للمقوسة الغوندية). اختبرت كفاءة التضخيم بالرحلان الكهربائي في هلامة الأغاروز 2%.
|
| Nested PCR |
استخدم 1مكرولتر من منتجات الـ PCR (الممدة 10 :1) من التضخيم الأول كمرصاف للدورة الثانية واستبدلت بالمشارع المجموعة الداخلية من المشارع primers:
B1F2(5´TGCATAGGTTGCAGTCACTG3´)
B1R2(5´GGCGACCAATCTGCGAATACACC3´)
وهي تقابل نوكليوتيدات الجين 757B1- 776 و 853-831 على التتالي, وتم تضخيم منتجات الـ DNA باستخدام شروط الـ PCR نفسها ماعدا حرارة الالتحام (التطويع) التي كانت 59°م مدة دقيقتين, واستخدمت الشواهد الإيجابية والسلبية أيضاً, وتم تحليل منتجات الـ PCR باستخدام الرحلان الكهربائي على هلامة الأغاروز 2%.
|
| تضخيم الموضع الجيني SAG2
Amplification of SAG2 |
تم تحليل العينات التي ثبتت إيجابيتها بالتضخيم بـ Nested PCRللجين B1 للمقوسة الغوندية وذلك باستخدامNested PCR التي تضخم بشكل منفصل النهايتين 5´ و3´ حيث تم تضخيم النهاية 5´ للموضع الجيني SAG2 باستخدام المشرعين:
SAG2F4(5´GCTACCTCGAACAGGAACAC3´)
SAG2R4(5´GCATCAACAGTCTTCGTTGC3´)
بدرجة حرارة التحام (تطويع) 61°م. وأجري تضخيم ثان باستخدام 1 مكرولتر من منتجات الـ PCR (الممددة10 :1) من تفاعل التضخيم الأول كمرصاف للدورة الثانية بالشروط نفسها باستثناء المشارع التي استبدلت بها مشارع المجموعة الداخلية:
SAG2F (5´GAAATGTTTCAGGTTGCTGC3´)
SAG2R2 (5´GCAAGAGCGAACTTGAACAC3´)
وتم تضخيم النهاية3´ باستخدام المَشْرعين:
SAG2F3 (5´TCTGTTCTCCGAAGTGACTCC3´)
SAG2R3
(5´TCAAAGCGTGCATTATCGC3´)
بحرارة التحام (تطويع) 60°م, ومن أجل التضخيم الثاني استخدم 1 مكرولتر من منتجات الـPCR الممددة 10 :1 كمرصاف
لتفاعل التضخيم الثاني مع مشارع داخلية:
SAG2F2 (5´ATTCTCATGCCTCCGCTTC3´)
SAG2R (5´AACGTTTCACGAAGGCACAC3´)
باستخدام شروط الـ PCR لدورة التضخيم الأولى. تم تحليل منتجات الـ PCR المضخمة باستخدام هلامة الأغاروز 2%.
|
تنقية المنتجات المضخمة Purification of the amplified products
تمت تنقية المنتجات المضخمة من المشرعات والنوكليوتيدات والأملاح المستخدمة باستخدام عتيدة Q1Aquick PCR purification.
|
| تحليل النمط الجيني Genotype analysis |
|
تم تحليل النمط الجيني باستخدام PCR-RFLP )تعدد أشكال طول شدفة التقييد (Restriction Fragment Length Polymorphism) تم هضم النهاية 5´ باستخدام إنزيم نوكلياز داخليةSau3AI endonuclease بينما هضمت النهاية 3´ من الموضع SAG2 باستخدام إنزيم نوكلياز داخلية HhaI endonuclease. تم تحليل المنتجات باستخدام هلامة الأغاروز 2%, وقد استخدمت عينات إيجابية شاهدة من الذراري الثلاث للمقوسة الغوندية كمعياري لتحديد الأنماط الجينية.
|
| النتائجResults |
اختبارالتفاعل السلسلي للبوليميراز PCR Test
أظهر تطبيق اختبار PCR في مجموعة الدراسة نسبة إيجابية 19.1% (18 من أصل 94) بينما كانت النسبة في المجموعة الشاهدة 23.2% (21 من أصل 94) ولم يكن هناك فرق إحصائي ذو دلالة حيث كانت P = 0.55.
وقد أظهرت نتائج تضخيم الجين B1 للمقوسة الغوندية باستخدام PCR، إيجابية العينات1 ، 2، 4، 11 وسلبية العينات 3، 5، 6، 7، 8، 9، 10.
التنميط الجيني Genotyping
تم تحديد الأنماط الجينية للمقوسة الغوندية باستخدام تقنية PCR-RFLP، وتم تحديد نمط الذرية في كل عينة. ويُظهر البحث التضخيم الأول للنهاية 5´ للموضع الجيني SAG2 ولتضخيم الثاني للنهاية 5´ (Nested PCR) للموضع SAG2.
هضم التقييدRestriction Digestion
كانت 2 من أصل 18 من العينات إيجابية الـ PCR من النمط III (11.11%) مقارنة مع 4.7% في المجموعة الشاهدة (1 من أصل 21). كل العينات الباقية الإيجابية PCR في المجموعتين كانت من ذراري النمط II (88.89% و 95.24% على التتالي).
يُظهر البحث أيضاً الهضم التقييدي لمنتجات
النهاية 5´ المضخمة باستخدامSau3AI endonuclease واستناداً إلى الطراز المأخوذ من هضم الذراري المرجعية (النمط I، II، III) فإن عينة واحدة قد هضمت وبالتالي فهي من النمط III (الشريط 11) والعينات الأخرى لم تهضم وبالتالي فهي من النمط I أو II.
هضمت المنتجات المضخمة للنهاية 3' للموضع الجيني SAG2 باستخدام إنزيم التقييد HhaI كما أوضح الباحث، وقد هضمت كل العينات باستثناء عينة الشريط 11 وكان للعينات المهضومة طراز يشبه طراز النمط II الشاهد لذا فهي من النمط II والعينة غير المهضومة في الشريط 11 هي من النمط III لأنها هضمت بـ Sau3AI كما حدد سابقاً.
|
| المناقشة Discussion |
|
أكثر أنماط المقوسة الغوندية شيوعاً هو النمط II (5)، وإن وجود نسبة عالية منه في دراستنا قد يشرح جزئياً أن بعض النساء المصابات بالمقوسات في المجموعة الشاهدة أنجبن أطفالاً أصحاء، حيث أن النمطين II و III لم يكونا مفوعين في الفئران (6)، بينما كان النمط I مفوعاً وهو يسبب مرضاً شديداً في الجنين أو الولدان (7).
في دراسة وبائية سابقة أجريت على مجموعة الدراسة والمجموعة الشاهدة وجدنا أن تناول الأحشاء النيئة للحيوانات العاشبة وكبد الخروف النيئة قد ترافقت مع معدل انتشار عال للمقوسات الغوندية وقد يكون مترافقاً مع ازدياد معدل انتشار النمط II في أفراد دراستنا.
|
| الاستنتاج Conclusion |
|
أكثر ذراري المقوسات الغوندية بين النساء الحوامل هو النمط II ثم النمط III ولم يكن النمط I موجوداً.
|
| المراجع References |
1-Hennequin C; Dureau P; Nguyen L; Thulliez P; Gagelin B. and Dufier JL.
Congenital toxoplasmosis acquired from immuned women.
Pediatr Infect Dis J; 16: 75-77, 1997.
2-Widern M; Botterel F; Romand S; Ithier G. and Bouree P.
Congenital toxoplasmosis following primary maternal infection acquired during late pregnancy Relevance of serological screening
after delivery.
J Obstet Gynaecol Biol Reprod, 28: 566-567, 1999.
3-Pinon JM; Dumon H. and Chemla C.
Strategy for diagnosis of congenital toxoplasmosis: evalution of methods comparig mothers and newborns and standard methods for
postnatal detection of Immunoglobulin G, M, and A antibodies.
J Clin Microbiol; 39: 2267- 2271, 2001.
4-Robben PM; Mordue DG; Truscott SM.; Takeda K.; Akira S. and Sibley LD.
Production of 1L-12 by macrophages infected with Toxoplasma gondii depends on the parasite denotype.
J Immunol, 172: 3686-3694. 2004.
5-Ajzenberg D; Congne N; Paris L; Bessieres MH; Thulliez P; Filisetti D; Pelloux H; Marty P. and Darde ML.
Genotype of 86 Toxoplasma gondii isolates associated with human congenital toxoplasmosis and correlation with clinical findings.
J Infect Dis; 186: 684-689, 2002.
6-Parmley SF; Gross U; Suchaeczuk A. Windeck T. Sgarlato GD. and Remington JS.
Two alleles of the gene encoding surface antigen p22 in 25 strains of Toxoplasma gondii.
J Parasitol; 80: 293-301, 1994.
7-Luder CG. and Gross U.
Toxoplasmosis: from clinics to basic science.
Parasitol Today; 14: 43-45, 1998.
|
| |
