SCLA مجلة التشخيص المخبري - هيئة مخابر التحاليل الطبية

المجلد 4 , العدد 8 , ذو الحجة 1428 - كانون الثاني (يناير) 2008

تطبيقات البيولوجيا الجزيئية في مختبر الفيروسات

Applications of Molecular Biology in Virology Laboratory

د. فرج بارة، كلية الصيدلة

Faraj Barah

جامعة القلمون الخاصة
College of Pharmacy- Private University of Kalamoon

الملخص Abstract

أدى تطور طرق البيولوجيا الجزيئية (الكشف عن الأحماض النووية الريبية RNA والأحماض النووية الريبية منزوعة الأكسجين DNA وتضخيمها (مثل تفاعل سلسلة البوليميراز) بالإضافة إلى طرق تحديد التتالي النيكليوتيدي)، إلى إحداث تغيير كبير في الطرق المخبرية التقليدية المتبعة في مختبر الفيروسات، والمعتمدة إما على الكشف المباشر عن الفيروسات، أو على الكشف عن التغيرات الخلوية عند الزرع الخلوي للفيروسات أو على الاختبارات المصلية.
في السنوات الأخيرة، تقدمت وبشكل ملحوظ طرق البيولوجيا الجزيئية التي يمكن استخدامها في مختبر الفيروسات حتى أصبح استخدامها روتينياً في كثير من الحالات، ليس فقط للكشف الكيفي عن العوامل الفيروسية، وإنما لمراقبة النظام العلاجي لكثير من العداوى الفيروسية، بالإضافة إلى التنميط الجيني للعديد من الفيروسات، والذي ساعد في تحديد المقاومة الفجائية الناشئة ضد العقاقير المستخدمة في العلاج.
في هذا المقال، سيتم استعراض أهم تطبيقات البيولوجيا الجزيئية في مختبر الفيروسات وتوضيح مدى الاستفادة من هذه الطرق في محاور ثلاثة هي: الكشف عن العداوى الفيروسية، مراقبة علاج وتقييم تدبير العداوى الفيروسية، التنميط الجيني للفيروسات واختبارات المقاومة للعقاقير المستخدمة في علاج تلك العداوى.

The development of molecular biological methods (as detecting and amplification of DNA and RNA, and genome sequencing) have revolutionised the methods applied in the diagnostic virology laboratory that used to depend mainly on viral cell culture or serological tests.
Recently, the molecular-based techniques that can be used in virology lab have developed to an extent that made their use a routine procedure not only in the detection of the viral agents but also in monitoring responses to antiviral therapies and ability to genotype many viruses and therefore helping in detecting any emerging resistance against the drugs used in the treatment regimes.
This article will focus on the most important current clinical applications of molecular biology in virology laboratory; particularly in diagnosis of viral infections, treatment monitoring of viral infections and viral genotyping and resistance testing.

المقدمة Introduction

منذ زمن بعيد، كان تشخيص العداوى الفيروسية متأثراً بالتكلفة العالية، والوقت الطويل اللازم لإجراء الاختبارات، والحاجة إلى التدريب المكثف للمخبريين من أجل الإتقان الصحيح للتقنيات المطبقة مثل الزرع الخلوي للفيروسات؛ بالإضافة إلى الحساسية المنخفضة والنمو البطيء للعديد من الفيروسات ضمن أوساط الزرع الخلوي. أما الطرق المصلية التي ظهرت لاحقاً فهي غالباً ما تكون غير مفيدة في المراحل الأولى من الإصابة (حيث تحتاج الأضداد للظهور أسبوعاً على أقل تقدير) أو في حالة الأشخاص المثبطي المناعة (لا تظهر الأضداد) بالإضافة إلى صعوبة الحصول أو صعوبة إنتاج المصول الضدية، وأخيراً الحساسية الضعيفة للكشف عن الأضداد للعديد من الفيروسات. لذلك كان من الضروري تطوير طرق بديلة تتلافى فيها هذه العوائق وبالتالي فقد كان لظهور الطرق المبنية على البيولوجيا الجزيئية الأثر الكبير في إحـداث ثورة في تشـخيص وتدبير العداوى والأمراض الفيروسية (1).

أولاً: الكشف عن العداوى والأمراض الفيروسية

التهاب الدماغ الفيروسي والتهاب السحايا الفيروسي
يعد التهاب الدماغ الفيروسي والذي يسببه غالباً فيروس الحلأ البسيط من النمط الأول Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) خطيراً على حياة المريض، حيث أن 70% من الحالات غير المعالجة تقود إلى الوفاة، وقد كان التشخيص معتمداً في الماضي على أخذ خزعة من الدماغ في بعض الأحيان وذلك بسبب الحساسية المنخفضة لزرع السائل الدماغي الشوكي والاختبارات المصلية. يعد تفاعل سلسلة البوليميرازPolymerase chain reaction (PCR) الآن الوسيلة الأفضل للكشف المبكر عن مجين الفيروس في السائل الدماغي الشوكي بحساسية قدرها 98%، وبنوعية قدرها 94% (2). يسمح الكشف المبكر للإصابة بالتهاب الدماغ الفيروسي الحلئي ببدء العلاج مبكراً بالاسيكلوفير Acyclovir الوريدي (10 ملغ/ كغ كل 8 ساعات لمدة 21 يوماً) مانعاً بالتالي حدوث السبات والوفاة (3). يتوفر حالياً العديد من العتائد التجارية لاختبار الـ PCR للكشف عن HSV-1 نذكر منها Artus HSV-1/2 PCR Qiagen, HSV1/2 Detection Kit Roche Diagnostics، قادرة على كشف حد أدنى من مجين الفيروس يصل حتى نسخة واحدة/ مكل من العينة (4).
أما التهاب السحايا الفيروسي الذي تسببه مجموعة متنوعة من الفيروسات مثل الفيروسات الحلئية Herpesviruses والفيروسات المعوية Enteroviruses فيمكن الآن كشفه ضمن السائل الدماغي الشوكي بوساطة اختبار الـ PCR بمصداقية أكبر وبوقت أقصر وذلك مقارنة بالزرع الخلوي، حيث يتم استخدام تفاعل سلسلة البوليميراز المتعدد Multiplex Polymerase Chain Reaction للكشف عن فيروس الحلأ البسيط بنمطيه الأول والثاني، فيروس الحماق وداء المنطقة Varecillaa Zoster virus (VZV)، الفيروس المضخم للخلايا Cytomegalovirus (CMV)، فيروس ايبشتاين بار Epstein Bar virus (EPV) وفيروس الحلأ البشري نمط 6 Human herpes virus type 6 (HHV 6) بالإضافة إلى الفيروس المعوي نمط 71 Enterovirus type 71 كلها في اختبار واحد (5، 6). يوفر استخدام اختبار Multiplex PCR الوقت مقارنة مع إجراء اختبار الـ PCR لكل فيروس على حدة، مما يجعل تطبيقه أمراً سهلاً وروتينياً في المختبر.

العداوى الفيروسية المُتنقلة عبر الدم
تشخص الإصابة الحادة بالتهاب الكبد الفيروسي من النمط C Hepatitis C virus (HCV) حالياً بالكشف عن الحمض النووي الريبي RNA للفيروس في مصل المريض لأن ظهور الأضداد Anti HCV يتأخر (هناك بروتينات متعددة تستخدم كمستضدات مثل البروتين C100-3 ولكن الأضداد تظهر متأخرة بعد 8 أسابيع من الطور الحاد بالإضافة إلى بروتينات C33c, C22-3, SOD التي يمكنها الكشف عن الأضداد بشكل مبكر نسبياً وان كان متأخراً مقارنة بالكشف عن مجين الفيروس والذي يظهر خلال أسبوعين من حصول الإصابة) (7)، وبسبب تأخر ظهور الأضداد فإنه من الصعوبة إثبات دور الفيروس في حالات التهاب الكبد الخاطف Fulminant hepatitis لأن هذه الإصابة تسبب الموت السريع قبل ظهور الأضداد وبالتالي عدم إمكان تأكيد الانقلاب المصلي ويمكن فقط إثبات تلك الحالة بالتحري عن مجين الفيروس بوساطة تفاعل سلسلة البوليميراز بالنسخ العكسي Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT PCR) (7، 8). من ناحية أخرى، يعد فقط الأشخاص الذين يكشف عن تواجد RNA الفيروس في مصولهم ناقلين له عبر طرق الانتقال المختلفة (نقل الدم، وخزات الإبر الملوثة، عبر المشيمة من الحامل المصابة إلى جنينها)، مما يجعل استخدام المقايسة الكيفية لمجين الفيروس Qualitative HCV RNA assay ضرورياً خصوصاً عند التبرع بالدم وتكون النتيجة إيجابية عندما يكشف عن ما يزيد عن 102 نسخة فيروسية/ مل (أو ما يعادل 50 وحدة دولية/ مل) (8). من العتائد التجارية المتوفرة نذكرAMPLICOR® HCV v2.0 Roche Diagnostics.
على الرغم من أن الكشف عن فيروس عوز المناعة البشريHuman Immuno-deficiency Virus (HIV) يتم روتينياً بوساطة الاختبارات المصلية (طريقة الامتزاز المناعي المرتبط بالإنزيم ELISA)، لكن الكشف المبكر (وقبل ظهور الأضداد) يمكن أن يتم بالبحث عن مجين الفيروس باختبار RT PCR (AMPLICOR® HIV-1 Test Roche Diagnostics) (9). إن انتقال الـ HIV عبر المشيمة من الحامل المصابة إلى جنينها يمكن أيضاً أن يكشف بالتحري عن مجين الفيروس ضمن السائل الامينوسي (10).
تتعدد خطط العمل المستخدمة في التحري عن خلو عينات الدم المتبرع بها من HCV و HIV، ففي استراليا يتم حالياً استخدام العتيدة التجارية Procleix® HIV-1/HCV Chiron. واستخدام هذا الاختبار يقلل من فترة العدوى الكامنة من 22 يوماً في حالة الإصابة بالـ HIV إلى 9 أيام فقط، ومن 66 يوماً في حال الإصابة بالـ HCV إلى 7 أيام فقط (11).

العداوى الفيروسية المنتقلة عبر المشيمة
أصبح من الممكن الآن الكشف عن إصابة الجنين بفيروس VZV (12)، وفيروسCMV (13) وذلك بالتحري عن الدنا DNA في السائل الامينوسي بوساطة تفاعل سلسلة البوليميراز.

القرحات التناسلية الفيروسية
أصبح اختبار الـ PCR من الاختبارات الروتينية في العديد من مختبرات الفيروسات للتحري عن العوامل المسببة للقرحات التناسلية التي غالباً ما يكون سببها الفيروسي إما فيروس الحلأ البسيط من النمط الثاني أو فيروس الحلأ البسيط من النمط الأول وإن كان بدرجة أقل وذلك بسبب الحساسية الأفضل للـ PCR مقارنة مع طرق الزرع الخلوي الفيروسي (14).

إصابات الجهاز التنفسي الفيروسية
إن التشـخيص الجزيئي لإصابـات الجهاز التنفسي الفيروسية سواء كانت علوية أو سفلية يخفف من الكلفة المالية بشكل غير مباشر بسبب التقليل من عدد الداخلين للمستشفيات والتقليل من الاختبارات غير اللازمة بالإضافة إلى التقليل من الاستخدام غير الضروري للمضادات الحيوية وذلك عند تأكيد الإصابة بأحد هذه الفيروسات وبالتالي نفي الإصابة الجرثومية (15). تم تطوير العديد من الاختبارات المعتمدة على تفاعل سلسلة البوليميراز المتعدد وبالزمن الحقيقي Multiplex Real Time PCR للتحري عن الفيروسات الأكثر شيوعاً في العداوى التنفسية مثل فيروس الأنفلونزا البشرية نمط A Human Influenza virus A، فيروس الأنفلونزا البشرية نمط B (Human Influenza virus B)، الفيروس التنفسي المخلوي Respiratory syncytial virus (RSV) والفيروسات الأنفية Rhinoviruses (16). إن حساسية هذه الاختبار تقارب الـ 400 نسخة من مجين كل فيروس ضمن التفاعل الواحد.
خلال وباء متلازمة الجهاز التنفسي الحادة الشديدةSevere Acute respiratory Syndrome (SARS) الذي بدأ عام 2003 والذي يسببه فيروس من الحمات التاجية Coronavirus يسمى SARS-COV، كان استخدام Multiplex Real Time PCR ضروريا لنفي الإصابة بالفيروسات السابقة التي قد تعطي الأعراض السريرية نفسها. لاحقا تم تطوير تفاعل تسلسلي بوليميرازي نوعي وخاص بالـ SARS-COV بحساسية تصل إلى 85% في بداية الإصابة (17) وعلى الرغم من أن حساسية الطرق المصلية اكبر (تصل إلى 100%) ولكنها ذات قيمة تشخيصية محدودة في أول الإصابة عندما يكون خطر العدوى هو الأكبر (18).
إن الوباء الحاصل في جنوب شرق آسيا بأنفلونزا الطيور نمط H5N1 (Avian Influenza virus H5N1) قد أعطى الدافع الرئيس لتطوير طرق البيولوجيا الجزيئية للكشف عن العداوى بأسرع وقت ممكن وقد تم تطوير الطريقة الأساسية في الكشف بعد وباء هونغ كونغ عام 1997. من أهم الطرق الجزيئية للكشف عن العداوى بأنفلونزا الطيور من النمط H5N1 تفاعل سلسلة البوليميراز بالتناسخ العكسي وبالزمن الحقيقي Real Time RT PCR (19، 20).

إصابات الإسهال الفيروسية
إن إسهالات الأطفال من أهم المشكلات الصحية التي تواجه العالم حتى يومنا هذا، وقد تبين أن فيروسات روتا Rotaviruses مسؤولة عن 50-30% من هذه الحالات عند الأطفال والتي تستدعي إدخالهم إلى المستشفى. تم اكتشاف هذه الفيروسات في السبعينات وذلك بكشفها بشكل مباشر في عينات البراز بوساطة المجهر الإلكتروني حيث تظهر على شكل عجلة الدولاب. مازال الكشف بالمجهر الإلكتروني مستخدما ولكن في مراكز الأبحاث كما يمكن البحث عن مستضدات الفيروس في البراز بوساطة طريقة الـ ELISA. إن الطريقة المثلى حالياً لتشخيص الإصابة بالفيروسات روتا هي الـ PCR (21).
إن فيروس الـ Norovirus يعد المسؤول عن كثير من حالات الاسهالات الوبائية التي يمكن أن تكشف بالمجهر الإلكتروني، المقايسات المناعية الإنزيمية، RT PCR (22)، Real Time RT PCR (23)، والاختباران الأخيران هما الأكثر حساسية والأكثر سرعة. ينطبق الأمر نفسه على الفيروسات الكاسية Caliciviruses والفيروسات النجمية Astroviruses والفيروسات الغدية المعوية نمط 40 و41 (Enteric Adenoviruses types 40, 41) (21).

ثانياً: مراقبة علاج العداوى الفيروسية

أصبحت مراقبة الحمل الفيروسيViral load من الدعائم الأساسية في مراقبة تطور السير المرضي للعديد من العداوى الفيروسية المزمنة وتقييم درجة الاستجابة للبرامج العلاجية المطبقة. يمكن مراقبة الحمل الفيروسي بوساطة طرق مختلفة منها تفاعل سلسلة البوليميراز الكمي Quantitive PCR أو Real Time PCR. إن توافر هذه الاختبارات بشكل عتائد تجارية ما زال محدوداً نسبياً (سيرد ذكر الأمثلة لاحقاً في المقال)، وعلى العكس، فإن هذه الاختبارات المطورة ضمن المختبرات In-House protocols تتواجد بكثرة وتنشر بشكل كثيف في الدوريات العلمية. ولكي تعطي هذه الاختبارات نتائج ذات معنى، يجب أن يتم إدخال معيار كمي (عدد معروف من النسخ من مجين الفيروس) Quantitation Standard في كل عينة حيث سيقوم هذا المعيار الكمي بمراقبة كفاءة مختلف المراحل المطبقة في هذه الاختبارات وبالتالي ضمان الحصول على نتائج ذات مصداقية (24).
تعد مراقبة الحمل الفيروسي لفيروسHIV الأساس في تحديد درجة نجاح العلاج المطبق والكشف عن الظهور المفاجئ للمقاومة الفيروسية للعلاج المستخدم (والتي تتظاهر بارتفاع قيمة الحمل الفيروسي على الرغم من استمرار المعالجة). يمكن أيضا الاستفادة من الحمل الفيروسي لمراقبة تطور سير المرض وتحديد درجة الإنذار Prognosis. إن العتائد التجارية متوفرة ومن أحدثها المعتمدة على اختبارات فائقة الحساسية وقادرة على كشف حد أدنى من مجين الفيروس يصل حتى 50 نسخة/ مل موضحة في الجدول 1 (25، 26).
يوجد حالياً 6 أنماط جينية لفيروس التهاب الكبد C موزعة جغرافياً في كل أنحاء العالم (أنظر لاحقاً). إن مراقبة الحمل الفيروسي للإصابات المزمنة لالتهاب الكبد الفيروسـي C من النمط الجيني رقم 1 تساهم بشكل أساسي في تقييم درجة الاستجابة للعلاج المشترك بالبيغ انترفيرون ألفا Peginterferon alpha والريبافيرين Ribavirin (27). يعد المرضى الذين يكون عندهم مجين الفيروس سلبياً لمدة 6 أشهر بعد إكمال العلاج المشترك أنهم حققوا استجابة فيروسية مستمرة Sustained viral response وأصبحوا خالين من الفيروس. في حين يمكن اعتبار أن هناك فرصة قدرها 75% لتحقيق استجابة فيروسية مستمرة للعلاج المشترك إذا لم يتم الكشف عن مجين الفيروس بعد 12 أسبوع من بدء العلاج. بالإضافة لذلك يمكن اعتبار أن هناك فرصة قدرها 33% لتحقيق استجابة فيروسية مستمرة للعلاج المشترك إذا حصل نقص في مجين الفيروس بمقدار 100 مرة بعد 12 أسبوع من بدء العلاج. أما إذا لم يحدث الانخفاض في الحمل الفيروسي بعد 12 أسبوع من بدء العلاج فيوقف العلاج، حيث بينت الدراسات أن ما يزيد عن 97% من هؤلاء المصابين الذين لا تحدث لديهم استجابة فيروسية مبكرة Early viral response يفشلون في تحقيق استجابة فيروسية مستمرة (27، 28).
إذا حدثت استجابة فيروسية سريعة Rapid viral response أثناء علاج الأشخاص المصابين بالنمط الجيني 2 (المتظاهرة بسلبية اختبار Qualitative HCV RNA assay بعد 4 أسابيع من بدء العلاج) فيمكن إيقاف العلاج بعد 14 أسبوع، أما بالنسبة للأشخاص المصابين بالنمط الجيني 3 والمتظاهرين بحمل فيروسي عالٍ High viral load (أكثر من 800000 وحدة دولية/ مل) فينصح بمتابعة العلاج حتى سنة. أما بالنسبة للأشخاص المصابين بالنمط الجيني 4 (وهو النمط الأكثر شيوعاً في سورية) فإن هناك عادة استجابة فيروسية مستمرة تصل إلى 66% بعد 36 أسبوعاً من بدء العلاج و70% بعد 48 أسبوعاً من بدء العلاج (28، 29). يوضح الجدول 2 أهم العتائد التجارية المستخدمة لتحديد الحمل الفيروسي لالتهاب الكبد الفيروسي C (30).
إن معرفة الحمل الفيروسي للأفراد المصابين بالتهاب الكبد الفيروسي B المزمن يعد عنصراً أساسياً من أجل تقييم حاجة المريض للعلاج، فحالة الالتهاب المزمن غير الفعال Inactive chronic carrier (والتي تتظاهر بسلبية أو انخفاض عدد نسخ مجين الفيروس عن 510 نسخة/ مل) لا تحتاج إلى علاج وإنما إلى مراقبة، أما في حالة الالتهاب المزمن الفعال Active chronic carrier (والتي تتظاهر بارتفاع عدد نسخ مجين الفيروس عن 510 نسخة/ مل في حالة سلبية المستضدات البائية HBeAg أو 610 نسخة/ مل في حالة إيجابية HBeAg) فتحتاج إلى علاج خوفاً من الانتقال إلى حالة التشمع الكبدي أو السرطان الكبدي (31). يستخدم أيضاً الحمل الفيروسي في حالة الأفراد المصابين بالتهاب الكبد الفيروسي B كمؤشر على ظهور المقاومة لعقار اللاميفودين Lamivudine نتيجة الاستخدام الطويل والمنفرد لهذا العقار والذي قد يترافق مع حدوث الطفرات والتي من أهمها طفرة YMDD mutation (32). تحدث هذه الطفرة النقطية في الموقع الفعال لجين البوليميراز بتواتر متزايد عبر سنوات الاستخدام للعقار (32% بعد سنة من الاستخدام، 42% بعد سنتين، 52% بعد 3 سنوات) (33). يوضح الجدول 3 أهم العتائد التجارية المستخدمة لتحديد الحمل الفيروسي لالتهاب الكبد الفيروسي B (34).
تعد الإصابة بـ CMV من العداوى الخطيرة لدى الأشخاص الذين يخضعون لزراعة الأعضاء مثل زرع نقي العظام، والأشخاص المصابون بالعوز المناعي وقد كان الكشف عن الفيروس بالطرق التقليدية ذا حساسية ضعيفة (35). إن معرفة الحمل الفيروسي بوساطة تفاعل سلسلة البوليميراز الكمي هو الطريقة المرجعية لمراقبة ظهور إصابة بالفيروس خلال فترة التثبيط المناعي وبالتالي تسمح بالعلاج البدئي pre-emptive قبل ظهور الإصابة السريرية وذلك بحساسية كبيرة مقارنة مع الزرع الخلوي (36).

الجدول 1: أهم العتائد التجارية المستخدمة لتحديد الحمل الفيروسي لفيروس HIV

اسم العتيدة	الشركة التجارية	الطريقة الرئيسية المستخدمة	ملاحظات
Amplicor HIV-1 Monitor® Test, v1.5	Roche Diagnostics	Quantitative RT-PCR	الحساسية 50 نسخة/ مل الخطية ومجال الكشف 50-75x104
VERSANT® HIV-1 RNA 3.0 Assay (bDNA)	Bayer Diagnostics	Branched Chain DNA (bDNA)	الحساسية 50 نسخة/ مل
NucliSens EasyQ® HIV-1	Biomerieux	Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)	الحساسية 50 نسخة/ مل

الجدول 2: أهم العتائد التجارية المستخدمة لتحديد الحمل الفيروسي لالتهاب الكبد الفيروسي C

اسم العتيدة	الشركة التجارية	الطريقة الرئيسية المستخدمة	ملاحظات
Amplicor HCV Monitor® Test v2.0	Roche Diagnostics	Quantitative RT-PCR	الحساسية 600 وحدة دولية/ مل الخطية ومجال الكشف 6x102-8.5x105
VERSANT® HCV RNA 3.0 Assay (bDNA)	Bayer Diagnostics	Branched Chain DNA (bDNA)	الحساسية 615 وحدة دولية/ مل الخطية ومجال الكشف 615-7.7x106
HeptimaxTM Hepatitis C Viral RNA Quantitative TMA	Quest Diagnostics	Transcription mediated amplification (TMA)	الحساسية 5 وحدة دولية/ مل الخطية ومجال الكشف 5-7.5x102

الجدول 3: أهم العتائد التجارية المستخدمة لتحديد الحمل الفيروسي لالتهاب الكبد الفيروسي B.

اسم العتيدة	الشركة التجارية	الطريقة الرئيسية المستخدمة		ملاحظات
Amplicor HBV Monitor® Test v2.0	Roche Diagnostics		Quantitative PCR	الحساسية 104 نسخة/ مل الخطية ومجال الكشف 104-4x107
VERSANT® HBV DNA 3.0 Assay (bDNA)	Bayer Diagnostics		Branched Chain DNA (bDNA)	الحساسية 2x103 نسخة/ مل الخطية ومجال الكشف 2.0x103 - 1.8x108

ثالثاً: التنميط الجيني الفيروسيViral genotyping واختبارات المقاومة

إن النظام العلاجي الأمثل سوف يقود حتماً إلى نجاح طويل الأمد في التخلص من العامل الممرض ويقلل من فرص تطور المقاومة للعقاقير المستخدمة. لذلك لابد أن تتوفر الاختبارات اللازمة للكشف عن تطور المقاومة للعقاقير ومعرفة إن كنا بحاجة إلى ضرورة تبديل البروتوكول العلاجي المتبع. من أهم الطرق المستخدمة لتحقيق هذا الغرض هي التنميط الظاهري Phenotyping والتنميط الجيني Genotyping. يعتمد التنميط الفيروسي الظاهري على قدرة الفيروس على التكاثر في المزارع الخلوية بوجود أو عدم وجود العقار في حين يعتمد التنميط الفيروسي الجيني على التحري عن الطفرات الوراثية المسببة للمقاومة ضد عقار معين. ولما كان التنميط الفيروسي الظاهري يتطلب زمناً طويلاً، كلفة كبيرة، بالإضافة إلى الصعوبة في تفسير نتائجه وضرورة توفر الخبرة لتحليل النتائج، فإن التنميط الفيروسي الجيني سريع، وأقل كلفة وبالتالي فقد اخذ يزداد انتشاراً في السنوات الأخيرة. تتوفر العديد من طرق التنميط الجيني الفيروسي نذكر منها: مقايسة تحديد التتالي النيكليوتيدي بالحلقة المنتهية Dideoxynucleotide Terminator Cycle Sequencing (DTCS)، مصفوفة قليلات النكليوتيدات عالية الكثافة High-density Oligo-nucleotide arrays، مقايسات الطفرات النقطية Point mutations assay، بالإضافة إلى مقايسات أخرى تم تطويرها ضمن المختبرات (37).
إن معرفة الأنماط الجينية لفيروس الـ HIV للتحري عن المقاومة الناشئة ضد العقاقير المستخدمة في العلاج يعد أساسياً في توجيه العلاج وبالتالي يكمل تقييم الحمل الفيروسي الذي ذكر سابقاً. من العتائد التجارية المتوفرة والمعتمدة في معظمها على تقنية DTCS نذكر اختبارTRUGENE™ HIV-1 Genotyping Kit Visible Genetics واختبارViroSeq™ HIV-1 Genotyping System ABI (38) ولتفسير النتائج يتوفر العديد من قواعد البيانات Database التي يمكن الاستفادة منها في تحليل ومقارنة المتتاليات النيكليوتيدية التي يتم الحصول عليها في الاختبارات السابقة بالسلالات الفيروسية المختلفة للفيروس. من مصادر البيانات هذه نذكر المواقع التالية على الشبكة العنكبوتية: http://hivdb.stanford.edu, resdb. lanl.gov/resist-DB default.htm.
يعد التنميط الجيني الفيروسي أساسياً لتدبير التهابات الكبد الفيروسية. إن تحديد النمط الجيني هو أقوى موجه لنجاح العلاج بأكثر من عقار وبالتالي فانه لابد أن يحدد النمط الجيني للفيروس المسبب للإصابة قبل بدء العلاج. أظهر تحليل المتتاليات النيكليوتيدية للسلالات الفيروسية لفيروس التهاب الكبد C المعزولة من مختلف أنحاء العالم إلى وجود 6 أنماط جينية تختلف عن بعضها البعض في التدبير العلاجي. إن الأشخاص المصابين بالنمطين 2 و 3 هم عادة الأكثر استجابة للمعالجة ويحتاجون 6 أشهر من العلاج (البيغ انترفيرون ألفا والريبافيرين) أو 12 شهر من العلاج (الانترفيرون ألفا والريبافيرين) بنسبة نجاح 76% مقارنة مع 12 شهر علاج (البيغ انترفيرون ألفا والريبافيرين) وبنسبة نجاح 56% فقط للنمط 1 (27، 28)، أما بالنسبة للنمط الجيني رقم 4، الأكثر شيوعاً في سورية، فقد وجد إن الاستجابة تكون عادة ضعيفة للعلاج المشترك بالانترفيرون ألفا والريبافيرين (أقل من 28%) في حين تصل الاستجابة الفيروسية المستمرة عند استخدام البيغ الانترفيرون ألفا والريبافيرين إلى 69% بعد 48 أسبوعاً من المعالجة (28). من العتائد التجارية نذكرINNO-LiPA HCV Bayer Diagnostics، ومن الطرق التقليدية ضمن المختبرات تحديد تتالي الرنا المباشر Direct Sequencing (39).
أما بالنسبة لالتهاب الكبد الفيروسي B فتجدر الإشارة هنا إلى أن الالتهاب المزمن الفعال قد يتطور بعدم وجود المستضد البائي HBeAg، ويعود السبب في ذلك إلى حدوث إحدى الطفرتين التاليتين (Precore mutation أو Core promoter mutation) واللتين تؤديان إلى عدم إنتاج المستضد البائي e-Ag من قبل الفيروس مع استمرار فعالية التناسخ الفيروسي وقدرة المريض على إنتاج الأضداد Anti-HBe. لا يمكن الكشف عن هذه الطفرات بمصداقية إلا بطرق التنميط الجزيئي، وقد أظهرت الدراسات أن حالات الالتهاب المزمن الفعال مع سلبية وجود المستضد البائي e-Ag هي الأكثر شيوعاً في سورية بنسبة تصل إلى 70%، وأن 30% من هذه الحالات تتطور نحو التشمع الكبدي (31). وهذا ما يقودنا مجدداً إلى التذكير بأهمية تحديد الحمل الفيروسي للتفريق بين حالات الازمان الفعالة وغير الفعالة.
يعد فيروس الأورام الحليمية البشرية Human Papilloma virus (HPV) حالياً العامل الأساسي لسرطانات عنق الرحم Cervical cancer، وتصنف الأنماط الجينية لهذا الفيروس كعوامل خطورة منخفضة أو مرتفعة بحسب درجة تسببها بهذه السرطانات. إن التحري عن التبدلات الخلوية قبل الورمية في عنق الرحم كان يجرى تاريخياً بوساطة المسح المعروف بلطاخة بابانيكولاوPAP smear ولكن الكشف الحالي عن الأنماط الجينية للفيروس العالية الخطورة يعد عاملاً مساعداً ومفيداً في التنبؤ بحدوث السرطان مستقبلاً وبالتالي محاولة منع حدوثه والوقاية منه، كما يمكن أن يساعد في تقييم الحالات الصعبة التفسير عند تطبيق لطاخة بابانيكولاو، ومن جهة أخرى فإن لطاخة بابانيكولاو الطبيعية المترافقة مع عدم وجود الأنماط الجينية العالية الخطورة خلال الفحص الجزيئي يشير إلي إمكان إعادة الاختبار ولكن بعد فترة زمنية طويلة نسبياً (40). من العتائد التجارية المستخدمة حالياً (41) اختبار Amplicor HPV Assay Roche Diagnostics، واختبار Hybrid Capture 2 HPV DNA Assay Digene Corporation والذي يعتمد على استخدام مسابير نوعية من الـ RNA التي سترتبط مع سلاسل الـ DNA العائدة للأنماط الجينية العالية الخطورة (عدد 15) مشكلة في المرحلة الأولى الهجين DNA-RNA، والذي يمكن كشفه في المرحلة الثانية بوساطة التألق الكيميائي المناعي بعد الارتباط بأضداد الهجين المحضرة تجارياً (41). هناك أيضاً بعض الطرق المنشورة حديثاً (لا تتوفر منها عتائد تجارية حتى الآن) نذكر منها اختبار تفاعل سلسلة البوليميراز العشي المتعدد Multiplex Nested PCR (42)، والاختبار المعتمد في المرحلة الأولى على استخدام تفاعل سلسلة البوليميراز العُشِّي بالحرارة المنخفضة LoTemp Nested PCR متبوعاً باختبار تحديد تتالي الدنا DNA sequencing ومن ثم مقارنة التتالي الذي حصلنا عليه بالتتاليات المحفوظة في البنوك الجينية المتوفرة في الشبكة العنكبوتية مثل الـ BLAST (42).

المراجع References

1-Speers DJ.
Clinical Applications of Molecular Biology for Infectious Diseases.
The Clinical Biochemst Reviews, 27: 39-51, 2006.

2-Garcia de Tena J, de Pablo Sanchez R, Daguerre Talou M, Lopez Matamala B. and Martinez Diaz C.
The value of the polymerase chain reaction in cerebrospinal fluid for the diagnosis of herpetic encephalitis: A report of 2 cases and a
review of the literature.
Anales de Medicina Interna, 2: 81-83, 2000.

3-Whitley RJ.
Herpes simplex encephalitis: adolescents and adults.
Antiviral Research, 71: 141-148, 2006.

4-Altuglu I, Zeytinoglu A, Sirin H, Yuceyar N. and Erensoy S.
Comparison of different polymerase chain reaction methods for detection of herpes simplex virus types 1 and 2 encephalitis.
European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 25: 669-671, 2006.

5-Yamamoto T. and Nakamura Y.
A single tube PCR assay for simultaneous amplification of HSV-1/-2, VZV, CMV, HHV-6A/-6B, and EBV DNAs in cerebrospinal fluid from
patients with virus-related neurological diseases.
Journal of Neurovirology, 6: 410-417, 2000.

6-Read SJ and Kurtz JB.
Laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system by using a single multiplex PCR screening assay. Journal
of Clinical Microbiology, 37: 1352-1355, 1999.

7-C?runtu FA. and Benea L.
Acute Hepatitis C Virus Infection: Diagnosis, Pathogenesis, Treatment.
Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases, 15: 249-256, 2006.

8-Scott JD. and Gretch DR.
Molecular diagnostics of hepatitis C virus infection: a systematic review.
The Journal of the American Medical Association, 297: 724-732, 2007.

9-Dax EM. and Arnott A.
Advances in laboratory testing for HIV.
Pathology, 36: 551-560, 2004.

10-Luzuriaga K. and Sullivan JL.
Pathogenesis of vertical HIV-1 infection: implications for intervention and management.
Pediatric Annals, 23: 159-166, 1994.

11-Seed CR, Cheng A, Ismay SL, Bolton WV, Kiely P, Cobain TJ. and Keller AJ.
Virology Subcommittee of the National Donor and Product Safety Committee, Australian Red Cross Blood Service. Assessing the accuracy of three viral risk models in predicting the outcome of implementing HIV and HCV NAT donor screening in Australia and the implications
for future HBV NAT.
Transfusion, 42:1365-1372, 2002.

12-Heuchan A. and Isaacs D.
Varicella zoster virus. In: Management of Perinatal Infections. Palasanthiran P, Starr M, Jones C editors.
Australasian Society for Infectious Diseases, 45-50, 2002.

13-Palasanthiran P, Jones C. and Garland S.
Cytomegalovirus. In: Management of Perinatal Infections. Palasanthiran P, Starr M, Jones C editors.
Australasian Society for Infectious Diseases,1-4, 2002.

14-Agius E, Arthur G, Mandhyan K. and Mercey D.
Polymerase chain reaction for
diagnosis of genital herpes: a missed opportunity?
International Journal of STD & AIDS, 16: 579-581, 2005.

15-Henrickson KJ.
Cost-effective use of rapid diagnostic techniques in the treatment and prevention of viral respiratory infections.
Pediatric Annals, 34: 24-31, 2005.

16-Freymuth F, Vabret A, Cuvillon-Nimal D, Simon S, Dina J, Legrand L, Gouarin S, Petitjean J, Eckart P. and Brouard J.
Comparison of multiplex PCR assays and conventional techniques for the diagnostic of respiratory virus infections in children admitted
to hospital with an acute respiratory illness.
Journal of Medical Virology, 78: 1498-1504, 2006.

17-Ng EK, Hui DS, Chan KC, Hung EC, Chiu RW, Lee N, Wu A, Chim SS, Tong YK, Sung JJ, Tam JS. and Lo YM.
Quantitative analysis and prognostic implication of SARS coronavirus RNA in the plasma and serum of patients with severe acute
respiratory syndrome.
Clinical Chemistry, 49: 1976-1980, 2003.

18-Ho PL, Chau PH, Yip PS, Ooi GC, Khong PL, Ho JC, Wong PC,
Ko C, Yan C. and Tsang KW.
A prediction rule for clinical diagnosis of severe acute respiratory syndrome.
The European Respiratory Journal, 26: 474-479, 2005.

19-Whiley DM. and Sloots TP.
A 5’-nuclease real-time RT-PCR assay for the detection of a broad range of influenza A subtypes, including H5N1.
Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 53: 335–337, 2005.

20-Ng EKO, Cheng PKC, Ng AYY, Hoang TL. and Lim WWL.
Influenza A H5N1 Detection.
Emerging Infectious Diseases, 11: 1303-1305, 2005.

21-Clark B. and McKendrick M.
Review of viral gastroenteritis.
Current Opinion in Infectious Diseases, 17: 461-469, 2004.

22-Fankhauser RL, Monroe SS, Noel JS, Humphrey CD, Bresee JS, Parashar UD, Ando T. and Glass RI.
Epidemiologic and molecular trends of “Norwalk-like viruses” associated with outbreaks of gastroenteritis in the United States.
Journal Infectious Diseases, 186: 1–7, 2002

23-Kageyama T, Kojima S, Shinohara M, Uchida K, Fukushi S, Hoshino FB, Takeda N. and Katayama K.
Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR.
Journal of Clinical Microbiology, 41: 1548–1557, 2003.

24-Ratcliff RM, Chang G, Kok T. and Sloots TP.
Molecular diagnosis of medical viruses.
Current Issues in Molecular Biology, 9: 87-102, 2007.

25-Katzenstein TL.
Molecular biological assessment methods and understanding the course of the HIV infection.
acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica, 114(S): 1-37, 2003.

26-Berger A, Scherzed L, Sturmer M, Preiser W, Doerr HW. and Rabenau HF.
Comparative evaluation of the Cobas Amplicor HIV-1 Monitor Ultrasensitive Test, the new Cobas AmpliPrep/Cobas Amplicor HIV-1 Monitor
Ultrasensitive Test and the Versant HIV RNA 3.0 assays for quantitation of HIV-1 RNA in plasma samples.
Journal of Clinical Virology, 33: 43-51, 2005.

27-Fried MW, Shiffman ML, Reddy KR, Smith C, Marinos G, Goncales FL Jr, Haussinger D, Diago M, Carosi G, Dhumeaux D, Craxi A, Lin A,
Hoffman J. and Yu J.
Peginterferon alpha-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection.
The New England journal of medicine, 347: 975-982, 2002.

28-Syrian Society for Gastroenterology. Management of Hepatitis C: National guidelines, 2006.

29-Zeuzem S, Hultcrantz R, Bourliere M, Goeser T, Marcellin P, Sanchez-Tapias J, Sarrazin C, Harvey J, Brass C. and Albrecht J.
Peginterferon alfa-2b plus ribavirin for treatment of chronic hepatitis C in previously untreated patients infected with HCV genotypes
2 or 3.
Journal of Hepatology, 40: 993-999, 2004.

30-Caliendo AM, Valsamakis A, Zhou Y, Yen-Lieberman B, Andersen J, Young S, Ferreira-Gonzalez A, Tsongalis GJ, Pyles R, Bremer JW. and
Lurain NS.
Multilaboratory Comparison of Hepatitis C Virus Viral Load Assays.
Journal of Clinical Microbiology, 44: 1726–1732, 2006.

31-Syrian Society for Gastroenterology. Management of Hepatitis B: National guidelines, 2006.
32-Dixon JS. and Boehme RE.
Lamivudine for the treatment of chronic hepatitis B.
Acta gastro-enterologica Belgica, 63: 348-358, 2000.

33-Allen MI, Deslauriers M, Andrews CW, Tipples GA, Walters KA, Tyrrell DL, Brown N. and Condreay LD. Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine. Lamivudine Clinical Investigation Group.
Hepatology, 27: 1670-1677, 1998.

34-Ronsin C, Pillet A, Bali C. and Denoyel G.
Evaluation of the COBAS AmpliPrep-Total Nucleic Acid Isolation-COBAS TaqMan Hepatitis B Virus (HBV) Quantitative Test and Comparison to the VERSANT HBV DNA 3.0 Assay.
Journal of Clinical Microbiology, 44: 1390-1399, 2006.

35-Long CM, Drew L, Miner R, Jekic-McMullen D, Impraim C. and Kao SY. Detection of cytomegalovirus in plasma and cerebrospinal fluid specimens from human immunodeficiency virus-infected patients by the AMPLICOR CMV test.
Journal of Clinical Microbiology, 36: 2434-2438, 1998.

36-Emery VC, Sabin CA, Cope AV, Gor D, Hassan-Walker AF. and Griffiths PD.
Application of viral-load kinetics to identify patients who develop cytomegalovirus disease after transplantation.
Lancet, 355: 2032-2036, 2000.

37-MacArthur RD.
An updated guide to genotype interpretation.
The AIDS reader, 14: 256-266, 2004.

38-Gunthard HF, Wong JK, Ignacio CC, Havlir DV. and Richman DD.
Comparative performance of high-density oligonucleotide sequencing and dideoxynucleotide sequencing of HIV type 1 pol from clinical samples.
AIDS research and human retroviruses, 14: 869-876, 1998.

39-Gargiulo F, De Francesco MA, Pinsi G, Pollara C, Terlenghi L, Perandin F. and Manca N.
Determination of HCV genotype by
direct sequence analysis of quantitative PCR products.
Journal of Medical Virology, 69: 202-206, 2003.

40-Hubbard RA.
Human papillomavirus testing methods.
Archives of Pathology Laboratory Medicine, 12:940-945, 2003

41-Sandri MT, Lentati P, Benini E, Dell'Orto P, Zorzino L, Carozzi FM, Maisonneuve P, Passerini R, Salvatici M, Casadio C, Boveri S. and Sideri M.
Comparison of the Digene HC2 assay and the Roche AMPLICOR human papillomavirus (HPV) test for detection of high-risk HPV genotypes in
cervical samples.
Journal Clinical Microbiology, 44: 2141-2146, 2006.

42-Brestovac B, Harnett GB, Smith DW, Frost F. and Shellam GR.
Multiplex nested PCR (MNP) assay for the detection of 15 high risk genotypes of human papillomavirus.
Journal of Clinical Virology, 33: 116-122, 2005.

المجلد 4 , العدد 8 , ذو الحجة 1428 - كانون الثاني (يناير) 2008

SCLA

By Platinum Inc.