بحث في أعداد المجلة
الجملة  
المؤلف   
 

المجلد 5 , العدد 10 , المحرم 1432 - كانون ثاني (يناير) 2011
 
استخدام التبئير الكهرساوي والتلطيخ المناعي لتشخيص التصلب المتعدد
Using of Isoelectric Focusing and Immunoblotting for the diagnosis of Multiple Sclerosis
د. ميس بحبوح، أ.د. فايزة القبيلي و أ.د. عماد الدين أبو خميس
Bahbouh M; Alquobaili F. and Abou KHamis I.
كلية الصيدلة، جامعة دمشق
Faculty of pharmacy, Damascus University
الملخص Abstract
يعد مرض التصلب المتعدد Multiple Sclerosis (MS) أحد أمراض المناعة الذاتية الرئيسية والمزيلة للميالين Myelin في الجملة العصبية المركزية (CNS) central nervous system. حيث تظهر أضداد من نمط خاص هي الأضداد قليلة النسائل Oligoclonal IgG في السائل الدماغي الشوكي لمرضى التصلب المتعدد، مما يُظهر نشاطاً التهابياً للمفاويات ضمن الجملة العصبية المركزيةCNS . يمكن استقصاء وجود هذه الأضداد باستخدام طريقة التبئير الكهرساوي Isoelectric Focusing المتبوع بالتلطيخ المناعي Immunoblotting، حيث تظهر عصابات IgGs Oligoclonal Bands في السائل الدماغي الشوكيCSF، وليس في مصل المريض في كل مراحل المرض.
هدفت دراستنا إلى فحص حساسية ونوعية اختبار Oligoclonal Bands IgG عند مرضى التصلب المتعدد، بالمقارنة مع مجموعة مرضى مصابين بأمراض عصبية أخرىOther neurologist diseases (OND)، ومقارنة هذه الطريقة مع الطرق التشخيصية الشائعة مثل فحص الكمونات المثارة واختبار منسب .IgG Index
ضمت هذه الدراسة مجموعتين من المرضى: تألفت المجموعة الأولى مرضى التصلب المتعدد MS وعددهم 50 مريضاً (منهم 28 أنثى و 22 ذكراً). بينما تألفت المجموعة الثانية من 25 مريضاً من المصابين بأمراض عصبية أخرى (15 أنثى و 10 ذكور).
أظهرت النتائج أن هذا الاختبار لا يتأثر بالجنس أو بالفئة العمرية أو بعمر بدء الإصابة، بينما يتأثر بنمط المرض وخصوصاً النمط الناكس الهاجع "RR" Relapsing Remitting، ولقد بلغت حساسية الطريقة 90% ونوعيتها 92%.  
Multiple Sclerosis (MS) is one of the major autoimmune and demyelination diseases of the central nervous system (CNS). This shows a particular pattern of antibodies, it is Oligoclonal IgG in cerebrospinal fluid of multiple sclerosis patients, it shows an inflammatory activity of the lymphocytes within the CNS. The presence of these antibodies can be investigated using Isoelectric Focusing method, followed by Immunoblotting, where Oligoclonal Bands appear in the CSF and not in the serum of the patient of MS in all stages of the disease.
Our study aimed to examine the sensitivity and specificity of Oligoclonal Bands IgG test in patients with multiple sclerosis, compared with patients with other neurological diseases (OND), and compare this method with the common diagnostic methods such as evoked potential and IgG Index test.
This study included two groups of patients: The first group consisted of 50 MS patients (28 females and 22 males). While the second group consisted of 25 patients with OND diseases (15 females and 10 males).
The results showed that age, gender, and age of onset has no influence on the the disease, while the type of the disease, specially Relapsing Remitting "RR" type, has the susceptible affect on it. The sensitivity of the method was to a level of 90% while, the specificity of was at 92%.  
المقدمة Introduction 
يعد مرض التصلب المتعدد من أصعب الأمراض العصبية تشخيصاً، وذلك لتشابه أعراضه السريرية ومعطيات التصوير بالرنين المغناطيسي، مع الكثير من الأمراض العصبية الأخرى. وهو من أمراض المناعة الذاتية التي تصيب الجملة العصبية المركزية (الدماغ والنخاع الشوكي)، ويعد ظهور بؤر من مناطق إزالة الميالين المسؤول الرئيسي عن الفيزيولوجية الإمراضية للتصلب المتعدد ويعد التحري النوعي عن أضداد Oligoclonal IgG التي تهاجم غمد الميالين في السائل الدماغي الشوكي من أهم اختبارات التشخيص المبكر للتصلب المتعدد MS، على الرغم من أن المستضدات الهدف لهذه الأضداد لا تزال مجهولة. إن هذا الاختبار نوعي جداً وحساس، ولقد تم اعتباره المعيار الذهبي لتشخيص التصلب المتعدد MS) multiple sclerosis) (1).
إن سبب هذا المرض غير معروف، لكـن هنالك نظريات عدة لتفسير الإصابة به، منها:
النظرية الجينية: حيث تبين أن الأشخاص الذين لديهم نمط HLA- DR2 أكثر عرضة للإصابة من الأشخاص العاديين، كما يزداد احتمال الإصابة عند الأقارب وخصوصاً التوأم أُحادِيُّ الزَّيْجُوْت (2) monozygote.
النظرية البيئية: قد تكون عدوائية مثل فيروس ابشتن بار EBV، أو مرتبطة ببيئة جغرافية، حيث تزداد الإصابة في أوروبا وأمريكا بشكل كبير (3، 4).
أما السبب المباشر للتصلب المتعدد فهو نشاط لمفاويات تائية متفاعلة مع الميالين (CD4)، عند مضيف ذي استعداد جيني، ثم تقوم اللمفاويات البائية بإنتاج الأضداد بعد عبورها الحاجز الدموي الدماغي، مما يؤدي إلى تخرب غمد الميالين وظهور لويحات من مناطق إزالة المياليـن على امتداد العصبون.
إن الـ MS مرض تتواسطه المناعة الذاتية ويلاحظ فيه وجود غلوبلينات مناعية تصطنع داخل الـ CNS هي Oligoclonal IgG، وتعد إزالة الميالين الواصم الإمراضي اللافت للنظر في الحالات الحادة والمزمنة (1).
لهذا المرض أربعة مسارات أو أنماط سريرية حسب تدهور الحالة وهي:
• الناكس الهاجع Relapsing Remitting (RR) ويتميز بوجود هجمة واضحة سريرياً.
• المترقي الأولي Primary Progressive (PP) ويتميز بتدهور الحالة منذ البداية دون حدوث هجمة واضحة.
• المترقي الثانوي Secondary Progressive (SP) وتكون بدايته مثل النمط الناكس الهاجع Relapsing Remitting، ثم يترقى بشكل تدريجي مع أو بدون حدوث هجمات واضحة.
• المتدهور الناكس (PR) Progressive Relapsing يتميز بتدهور للحالة منذ البداية مع وجود هجمات واضحة حادة. و يوضح الشكل1 ترقي الأنماط مع الزمن (5).
أما أهم أعراض هذا المرض فهي التهاب العصب البصري، ازدواج في الرؤية، الرأرأة، شلل الأطراف، أعراض حسية، رنح وعدم توازن في المشي والحركة، تعب، دوار، مشاكل بولية، مشاكل معوية (4).
أما التدابير العلاجية لهذا المرض فتشمل: علاج الأعراض المرافقة للمرض من تشنج ومغص ومشاكل معوية والتهاب. بالإضافة إلى العلاج المعدل لسير المرض، وهدفه تخفيف الهجمات والمباعدة بينها وتأخير وتخفيف حدوث الإعاقة، ومن هذه الأدوية نذكر الإنترفيرون بيتا، ميتاكسانترون، غلاتيرامير أسيتات، نتاليزوماب (6، 7).
يعد هذا المرض من أصعب الأمراض تشخيصاً، حيث تتشابه أعراضه السريرية مع الكثير من الأمراض العصبية. ولقد وضعت معايير عديدة لتشخيص المرض على أساس التصوير بالرنين المغناطيسي و تحليل الـCSF . ويفيد التشخيص المبكر والمؤكد للمرض في البدء المبكر بالعلاج وبالتالي تلافي حدوث تطور للحالة وتخفيف حدوث الهجمات (1).
هدفت دراستنا إلى تعيين حساسية ونوعية اختبار Oligoclonal IgG في تشخيص الـ MS ودراسة العوامل التي تؤثر على الاختبار، ومقارنة هذه الطريقة مع وسائل التشخيص التقليدية مثل فحص الكمونات المثارة واختبار منسب IgG Index.  

الشكل 1: ترقي الأنماط الأربعة للـ MS مع الوقت (5).
المواد والطرق Materials and Methods 
بلغ عدد الحالات المدروسة منذ بداية شهر أيار من عام 2008 حتى نهاية شهر أيار من عام 2009 خمسة وسبعون مريضاً يراجعون شعبة الأمراض العصبية في كل من مستشفى الأسد الجامعي بدمشق، ومستشفى المواساة بدمشق، تتراوح أعمارهم بين 17 - 72 عاماً، المتوسط الحسابي لأعمارهم ± الانحراف المعياري (37.29±14.91).
وجرى تقسيم المرضى إلى مجموعتين رئيسيتين:
مجموعة مرضى التصلب المتعدد: و شملت 50 مريضاً (28 أنثى و 22 ذكراً).
مجموعة شاهدة Control ضمت مرضى لأمراض عصبية أخرى other neurologist diseases ((OND للمقارنة وشملت 25 مريضاً (15 أنثى و10 ذكور).
قمنا، في الوقت نفسه، بجمع نوعين من العينات من كل مريض
عينة سائل دماغي شوكي بدون تنبيذ أو تركيز أو تمديد. عينة مصل من كل مريض تمدد 300:1 مرة بالمصل الفيزيولوجي عند إجراء التحليل.
تعتمد الطريقة على تحري أضداد Oligoclonal IgG في السائل الدماغي الشوكي والمصل بطريقة التبئير الكهرساوي Isoelectric Focusing و التلطيخ المناعي Immuno-blotting.
استخدمنا عتيدة IgG IEF Plus Kit SAS من شركة Helena BioSciences التي تعتمد على فصل بروتينات المصل والسائل الدماغي الشوكي حسب نقطة التعادل الكهربائي على هلامة أغاروز وضمن 3) pH – (10، ثم نقلت البروتينات إلى غشاء نتروسلولوز الذي يجرى عليه تلطيخ مناعي Immunoblotting لرؤية عصابات IgG التي تفسر نوعياً بواسطة مقارنة وجود أو غياب عصابات Oligoclonal bands IgG في المصل أو السائل الدماغي الشوكي.  
أما خطوات العمل باختصار فهي:
• تجهيز العينات والهلام؛
• إجراء عملية التبئير الكهرساوي؛
• إجراء مرحلة التلطيخ المناعي؛
• مرحلة التلوين وإظهار النتائج، حيث تبدو عصابات أضداد Oligoclonal Bands مرئية بلون أحمر إلى بني محمر على الغشاء، ويبدي مريض التصلب المتعدد النموذجي عصابات Oligoclonal Bands في السائل الدماغي الشوكي CSF بدون أية عصابات في المصل.
النتائج Results 
يبين الجدول 1 نتائج الدراسة.
ولقد قمنا بتحليل النتائج إحصائياً، بحساب كلٍ من: حساسية الاختبار Sensitivity = وكانت 90%، ونوعية الاختبار Specificity = وبلغت 92%.
1- دراسة قدرة الاختبار OCB على التمييز بين المصابين بالـ MS وغير المصابين بالـ MS
 لدراسة قدرة الاختبار على التمييز بين المصابين بالتصلب المتعدد وغير المصابين (مجموعة الشاهد) أُجري اختبار فيشر المضبوط (فحص ثنائي الطرف بمستوى الدلالة α = 0.05 و قوة التحليل = 0.95)، ولقد تبين أن هذه الطريقة المخبرية قوية بشكل كاف إحصائياً للتمييز بين المصابين وغير المصابين (الشكل2).
2- دراسة تأثر نتيجة اختبار OCB بجنس المريض أو عمر المريض أو عمر بدء المرض عند مرضى الـ MS
لدراسة تأثر نتيجة الاختبار OCB بالجنس، أو العمر، أو عمر بدء المرض، أو نمط المرض عند مرضى الـ MS، أُجري اختبار فيشر المضبوط (فحص ثنائي الطرف بمستوى الدلالة α = 0.05 وقوة التحليل = 0.95) لكل صفة على حده، ولقد تبين أن نتيجة الاختبار لا تتأثر بجنس المريض (الشكل 3)، ولا تتأثر بعمر المريض (الشكل 4)، ولا تتأثر بعمر بدء المرض (الشكل 5).
3- دراسة تأثر نتيجة الاختبار OCB بنمط المرض عند مرضى الـMS
لدراسة تأثر نتيجة الاختبار OCB بنمط المرض عند مرضى الـ MS، استخدم اختبار كاي مربع (فحص ثنائي الطرف بمستوى الدلالة α = 0.05 وقوة التحليل = 0.95)، ولقد تبين أن نتيجة الاختبار تتأثر بنمط المرض خصوصاً النمط R-R (الشكل 6).
4- دراسة توافق نتيجة الاختبار OCB وفحص الكمونات المثارة EVP
لدراسة توافق نتيجة هذين الاختبارين، استخدم اختبار ميكنمار المضبوط (فحص ثنائي الطرف بمستوى الدلالة α = 0.05 و قوة التحليل = 0.95)، ولقد تبين عدم توافق نتيجة الاختبارين OCB و EVP (الشكل 7).
5- دراسة توافق الاختبارين OCB ومنسب IgG index لدراسة توافق نتيجة الاختبارين، استخدم فحص ميكنمار المضبوط (فحص ثنائي الطرف بمستوى الدلالة α = 0.05 و قوة التحليل = 0.95)، ولقد تبين عدم توافق نتيجة الاختبارين OCB ومنسب IgG index (الشكل 8).  
الجدول 1: اختبار الـOCB  لدى مجموعة المرضى ومجموعة الشاهد

 

مجموعة مرضى MS

مجموعة الشاهد

المجموع

OCB (+)

45

2

47

OCB (-)

5

23

28

المجموع

50

25

75



الشكل 2: قدرة اختبار OCB على التمييز بين المصابين وغير المصابين بالتصلب المتعدد.


الشكل 3: العلاقة بين اختبار OCB  وجنس المريض.




الشكل4: العلاقة بين نتيجة اختبار OCB وعمر المريض.



الشكل 5: العلاقة بين نتيجة اختبار OCB وعمر بدء المرض.



الشكل 6: العلاقة بين نتيجة اختبار OCB ونمط المرض.



الشكل 7: عدم توافق اختباريEVP  و OCB .



الشكل 8: عدم توافق اختباري منسب IgG Index و OCB .
المناقشة Discussion 
أعطت دراستنا نتائج جيدة من حيث الحساسية والنوعية لاختبار OCB في تشخيص مرض التصلب المتعدد، حيث كانت الحساسية 90% وهي تتوافق مع دراسة فورتيني وزملائه عام 2003 (8)، عندما استخدم طريقة الـ Isoelectric Focusing، وتخالفت الحساسية في دراستنا مع الحساسية في دراسة Harirchian عام 2004 (9)، والتي تبلغ 70%، لكنه استخدم طريقة الرحلان على هلامة البولي أكريلاميد، لتحري عصابات OCB . ويعود هذا الاختلاف برأينا إلى اختلاف طريقة العمل. ولقد بلغت النوعية 92% وهي تتوافق مع دراسة Villar وزملائه عام 2005(10).
أعطت دراسـتنا قيماً سـلبية كاذبة لاختبار الـ OCB عند مرضى الـ MS المؤكد تساوي 10%، وهي تشابه القيمة التي أعطتها دراسة Rudick وزملاؤه عام 1987 (11)، وهي أكبر من القيمة التي أعطتها دراسة Zeman وزملاؤه عام 1996 (12)، والتي كانت 3%، وقد عزاها Zeman إلى حالات حميدة للمرض لا يترافق معها إعاقة.
وفي دراسـة Jose وزملائه عام (13) 2005، هذه القيمة تساوي 16%.
وفي دراسة Rot 2003 وزملائه عام 2003(14) كانت هذه القيمة تساوي 12.8%.
لدراسة قدرة اختبار الـ OCB على تشخيص مرض الـ MS (التمييز بين المصابين وغير المصابين) أجري اختبار فيشر الإحصائي بمستوى دلالة α = 0.05، ولقد تبين أن الاختبار قوي بشكل كاف للتمييز بين المصابين وغير المصابين، وهذا يتفق مع دراسة Rot وزملائه عام 2003 (14)، ودراسة Jose عام (13) 2005.
وعند دراسة تأثر نتيجة اختبار الـ OCB بجنس المريض باستخدام اختبار فيشر الإحصائي المضبوط بمستوى دلالة α = 0.05، تبين عدم تأثر نتيجة الاختبار بجنس المريض، وهذا يوافق دراسة Rot وزملائه عام 2003 (14) ودراسة Jose وزملائه عام (13) 2005ودراسة Zeman وزملائه عام 1996 (12)، ويخالف دراسةHarirchian عام 2004 (9)، حيث وجد أن اختبار OCB كان إيجابياً عند الإناث أكثر من الذكور بفارق يعتد به إحصائياً.
عند دراسة تأثر نتيجة اختبار الـ OCB بعمر المريض باستخدام اختبار فيشر الإحصائي المضبوط بمستوى دلالة α = 0.05، تبين عدم تأثر نتيجة الاختبار بالفئة العمرية للمريض وهذا يوافق ما ورد في دراسة Rot عام 2003 (14)، ودراسة Harirchian عام 2004 (9)، ودراسة Zeman عام 199(12).
عند دراسة تأثر نتيجة اختبار الـ OCB بعمر بدء المرض باستخدام اختبار فيشر الإحصائي المضبوط بمستوى دلالة α = 0.05 ضمن مجموعة مرضى الـ MS، تبين عدم تأثر نتيجة الاختبار بالعمر الذي بدأ فيه المرض، وهذا يتوافق مع دراسة Rot عام (14) 2003.
جرت دراسة توزع الأنماط الأربعة للمرض حيث لوحظ سيطرة نمط RR بنسبة 68%، وهي قريبة إلى حد ما من دراسات أخرى: 65% في دراسة Jose عام 2005 (13)، و 80% في دراسة John H. عام 2000 (2)، وقد درسنا تأثر نتيجة الفحص بنمط المرض بشكل عام باستخدام اختبار كاي مربع الإحصائي المضبوط بمستوى دلالة α = 0.05، ولقد جرى قبول تأثر الاختبار بنمط المرض RR.
كما بينت دراستنا عدم وجود علاقة أو توافق بين اختبار الـ OCB واختبار الـ IgG Index باستخدام اختبار مكنيمار الإحصائي المضبوط بمستوى دلالة α = 0.05. وهذا يتوافق مع دراسة Mares وزملائه عام 2008 (15). وقد يعود ذلك إلى أن النتائج الإيجابية لاختبار الـ OCB عند مرضى التصلب المتعدد أكثر بكثير من النتائج الإيجابية لاختبار منسب IgG Index عند المرضى أنفسهم.  
الاستنتاج 
إن اختبار الـ OCB مهم وأساسي في تشخيص التصلب المتعددMS ، ولا يقل أهمية عن الأعراض السريرية أو التشخيص بالتصوير بالرنين المغناطيسي.
ومن المفيد تحري وجود عصابات الـ OCB لتشخيص الـ MS في مراحل مبكرة (عند بدء الشك بوجود المرض)، وذلك لإدخال الدواء في الوقت المناسب لمنع ترقي الحالة لمريض التصلب المتعدد، بالإضافة لتلافي حالات الخطأ في التشخيص وتعريض المريض المشخص خطأ على أنه MS لعلاج مكلف لا يحتاجه له.  
المراجع References 
1-Kevin A.B; Haffler D. et al.
multiple sclerosis in : SAMTERs immunological diseases.
ed: K. Frank Austen Michael M. Frank; (56): 711-738, 2005.

2-John HN; Oseworthy MD; Lucchinetti C. et al.
Multiple Sclerosis Review Article.
The New England Journal of Medicine, 1-15, 2000.

3-Pohl D.
Epstein–Barr virus and multiple sclerosis.
Journal of the Neurological Sciences. 3, 28, 2009.

4-Olek JM.
Epidemiology, risk factors, and clinical features of multiple sclerosis in adults, up to date, October 2008.

5-Lublin FD. and Reingold SC. Defining the clinical course of multiple sclerosis: results of an international survey. National Multiple Sclerosis Society (USA) Advisory Committee on Clinical Trials of New Agents in Multiple Sclerosis.
Neurology; 46: 907, 1996.

6-Lavlle P; Macdonell R. et al.
Multiple sclerosis fact file, Health Matters Library.
Austin and Repatriation Medical Centre, 2006.
7-Calabresi PA.
Diagnosis and Management of Multiple Sclerosis.
American family physician. 2004.

8-Fortini AS. et al.
Cerebrospinal Fluid Oligoclonal Bands in the Diagnosis of Multiple Sclerosis Isoelectric Focusing With IgG Immunoblotting Compared With High-Resolution Agarose Gel Electrophoresis and Cerebrospinal Fluid IgG Index.
Am J Clin Pathol; 120: 672-675, 2003.

9-Harirchian MH. et al.
An Estimation of oligoclonal bands in patients with Multiple Sclerosis.
Acta Medica Iranica, 42(4): 235-239, 2004.

10-Villar LM.
Early Differential Diagnosis of Multiple Sclerosis Using a New Oligoclonal.
Band Test, Arch Neurol; 62: 574-577, 2005.

11-Rudick RA. and Whitaker JN.
Cerebrospinal fluid tests for multiple sclerosis. In Scheinberg, P (Ed).
Neurology/neurosurgery update series, 7, 1, 1987.

12-Zeman AJ; Kidd D; McLean BN; et al.
Astudy of oligoclonal band negative multiple sclerosis.
J Neurol Neuro surg Psychiatry; 60: 27-30, 1996.

13-José S? M; Sequeira L. et al.
Oligoclonal IgG bands in the cerebronal fluid of portuguese patient with multiple sclerosis.
Arq Neuropsiquiatr, 63: 375-379, 2005.

14-Rot U et al.
Multiple Sclerosis with Uncommon Cerebrospinal Fluid Findings.
Croat Med J; 44: 697-701, 2003.

15-Mares J. et al.
Correlation of the IgG index and oligoclonal band in the CSF of patient with Multiple Sclerosis.
Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 152(2): 247-249, 2008.  
 
المجلد 5 , العدد 10 , المحرم 1432 - كانون ثاني (يناير) 2011

 
 
SCLA