بحث في أعداد المجلة
الجملة  
المؤلف   
 

المجلد 5 , العدد 6 , محرم 1431 - كانون الثاني (يناير) 2010
 
المستويات البلازمية للـ esRAGE لدى مرضى الداء السكري من النمط الثاني وعلاقتها مع ضبط الغلوكوز لديهم
Plasma Levels of esRAGE in Type 2 Diabetes Patients and Relationship with Glucose Control in Those Patients
د. أدهم شمه، د. وفاء حمود و أ.د. سحر الشماع
Shamma A; Hamoud W. and Al-Shamaa S.
كلية الصيدلة، جامعة دمشق
Faculty of Pharmacy, Damascus University
الملخص Abstract
الخلفية: تلعب جملة المنتجات النهائية للغلكزة المتقدمة advanced glycation end products (AGEs) ومستقبلاتها advanced glycation end products receptors (RAGE) دوراً هاما في تطور الاختلاطات الوعائية السكرية. تم التعرف حديثاً على الـ RAGE المفرز داخلي المنشأendogenous secretory RAGE (esRAGE) كتنوع جديد من الـ RAGE، والذي ينقصه الميدان عبر الغشائي ويفرز في المصل البشري. ومن المثير للاهتمام أنه كان قد تبين أن esRAGE يربط لجائن AGE وهو قادر على تعديل أفعال AGEs على الخلايا البطانية في المزارع.
المواد والطرق: شملت دراستنا 88 فرداً موزعين إلى ثلاثة مجموعات: مجموعة المرضى السكريين (33 فرداً)، مجموعة البدينين (33 فرداً)، المجموعة الشاهدة (22 فرداً). تم تعيين مستويات esRAGE لدى هؤلاء الأفراد باستخدام طريقة الامتزاز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)، كما استقصينا الارتباط بين esRAGE والهيموغلوبين السكري HbA1c، لدى كل من مجموعة المرضى السكريين ومجموعة البدينين.
النتائج: كانت المستويات البلازمية للـ esRAGE أخفض لدى مرضى الداء السكري من النمط الثاني (0.26±0.06 نغ/ مل) والأفراد البدينين (0.27±0.07 نغ/ مل) مقارنة مع المجموعة الشاهدة (0.37±0.13 نغ/ مل). كما أظهرت الدراسة وجود ارتباط عكسي يعتد به إحصائياً بين الـ esRAGE والهيموغلوبين السكري لدى كل من مجموعتي المرضى السكريين والبدينين.
الاستنتاج: كانت المستويات البلازمية للـ esRAGE أخفض عند مرضى الداء السكري من النمط الثاني والمرضى البدينين مقارنة مع المجموعة الشاهدة، وكانت هذه المستويات مرتبطة ارتباطاً عكسياً مع درجة ضبط السكر لدى هاتين المجموعتين.
Background: Advanced glycation end products (AGEs) and their receptor (RAGE) system play an important role in the development of diabetic vascular complications. Recently, an endogenous secretory RAGE (esRAGE) has been identified as a novel variant, which lacks the transmembrane domain and is secreted in human sera. Interestingly, it was reported that esRAGE binds AGEs ligands and is capable of neutralizing the actions of AGEs on endothelial cells in cultures.
Material and Methods: 88 subject were involved in this study, they were divided into three groups: type 2 diabetes patients group (n=33), obesity group (n=33), control groups (n=22). We determined plasma esRAGE levels of this subjects using ELISA, and then we investigated the relationship between esRAGE and HbA1c in both diabetic patients and obesity subjects.
Results: plasma esRAGE levels were significantly lower in type 2 diabetes patients (0.26±0.06 ng/ml) and obesity subjects (0.27±0.07 ng/ml) compared to control group (0.37±0.13 ng/ml). The study also showed significantly an inversely correlated between esRAGE and HbA1c in both diabetic patients and obesity subjects.
Conclusion: plasma esRAGE levels were lower in type 2 diabetes patients an obesity group compared to control group, and were inversely correlated with glucose control in those groups.  
المقدمة Introduction 
يعد الداء السكري Diabetes Mellitus (DM) أحد أكثر المتلازمات الاستقلابية انتشاراً على مستوى العالم، وهو يتصف بفرط سكر الدم hyperglycemia وتبدلات استقلابية قصيرة الأمد في استقلاب البروتين والشحوم وتبدلات وعائية غير عكوسة طويلة الأمد وتبدلات في النسج الضامة (1).
أظهرت الدراسات التي أجريت على مر السنين مشاركة طرق استقلاب الغلوكوز المتعددة في تطور المضاعفات الوعائية وهي (1، 2):
1- الغلكزة غير الإنزيمية nonenzymatic glycation للبروتينات التي تؤدي إلى إنتاج مركبات تسمى advanced glycation end products (AGEs)، والتي بدورها تفعّل إرسال إشارة مستقبل الـ (RAGE) AGE؛
2- زيادة فعالية سبيل الـ Polyol؛
3- تنشيط البروتين كيناز C؛
4- تدفق سبيل الـ hexosamine الزائد؛
5- إنتاج فوق الأكاسيد superoxide بوساطة سلسة ناقلة الإلكترون الميتوكوندرية.
تقترح التجارب على الحيوانات وفي المختبر in vitro أن جملة AGE ومستقبله RAGE تحتل جزءاً هاماً في تطور المضاعفات القلبية الوعائية (3)، مما يسمح لنا بدراستها وبيان أهميتها في تطور هذه المضاعفات.

Advanced glycation end products (AGEs) هي صنف من المنتجات المعقدة. تنتج عبر سلسلة من التفاعلات الكيميائية المعقدة تدعى تفاعل Maillard.
الخطوة الأولى في هذه التفاعلات هي تكثف بين مجموعة أمينية ومجموعة كربونيلية لتشكيل أساس شيف Schiff base. يُتبع هذا التفاعل بإعادة ترتيب جزيئي وتشكل غلكوزيل أمين مستبدل الـ N N-substituted glycosylamine الذي يقود إلى منتجات أميدورية Amadori products (1- أمينو، 1- ديوكسي، 2- كيتوز). ينشأ الـ AGEs من المنتجات الأميدورية (4).
الـ AGEs هي مركبات سامة. تتشكل بإفراط مع التقدم في السن، وفي الداء السكري، والفشل الكلوي (5). أكثر مركبات الـ AGEs المميزة كيميائياً الموجودة عند البشر هي الـ pentosidine (6) والكربوكسي ميثيل ليزين carboxy methyl lysine (CML) (7).
يتراكم AGEs في الدم الجائل وفي أنسجة متنوعة، وسرعة تشكله مرتبطة بالحالة السكرية للمريض، وهو يشارك في تطور مضاعفات الداء السكري الوعائية. يعتقد أن الآليات المعتمدة على المستقبل هي التي تؤدي إلى الفشل الوظيفي النسيجي المحدث بالـ AGEs، ومستقبل الـ AGEs الأكثر تمييزاً هو RAGE (Receptor for AGE) (8).
إن Receptor for advanced glycation end-products (RAGE) هو بروتين سطح خلوي متعدد الأربطة multiligand cell-surface protein عزل لأول مرة من رئة البقرة في عام 1992 من قبل مجموعة Schmidt and Stern (9، 10).
ينتمي الـ RAGE إلى طائفة الغلوبولينات المناعية وهو يملك جزء خارج خلوي يحتوي على منطقة غلوبولين مناعي من النمط V one "V" – type immunoglobulin domain ومنطقتي غلوبولين مناعي من النمط C tow type-"C' immunoglobulin domain (الشكل 1) (10). كما يمتد المستقبل ضمن الغشاء الخلوي بقطب كاره للماء ليصل إلى السيتوبلازما حيث تكون نهايته مشحونة وهذا ضروري لإرسال الإشارة (8).
يعبّر عن الـ RAGE في خلايا مختلفة: الوحيدات monocyte، البالعات macrophage، اللمفاويات التائية T-lymphocytes، الخلايا البطانية endothelial cells، الخلايا العضلية الملساء smooth muscle cells، خلايا مسراق الكبيبية mesangial cells، الخلايا العصبونية neuronal cells.
تبين حديثاً أن الخلايا الوعائية البشرية تعبر بشكل أساسي عن ثلاث تنوعات مضفرة للـ RAGE three RAGE splice variants (11):
الأول: هـو الـ RAGE كامـل الطـول المعروف full-length RAGE؛
الثاني: يشفر شكل مشذب النهاية الأمينية amino-terminally truncated form لوظيفة غير معروفة حالياً؛
الثالث: يشفر شكلاً ذواباً جديداً مشذب النهاية الكربوكسيلة carboxy-terminally truncated soluble form (الشكل 1). يشفر الشكل مشذب النهاية الكربوكسيلة من الـ mRNA RAGE بوساطة بروتين مكون من 347 حمضاً أمينياً ويتحرر من الخلايا. من المعروف حالياً أن هذا الشكل موجود في الدوران البشري ويسمى الـ RAGE المفرز داخلي المنشأ endogenous secretory RAGE (esRAGE) (12).
تبيـن أن بروتيـن الـ RAGE الــذواب (esRAGE) المنتج بشكل صنعي بوساطة تقانة الجين المأشوب recombinant gene technology يمكن أن يربط الـ AGEs ويمنع ترقي الاعتلال الوعائي السكري diabetic vasculopathy والتصلب العصيدي atherosclerosis في حيوانات التجربة (13).
كما يربط الـ esRAGE المنتج بشكل طبيعي أيضاً لجائن الـ AGEs ويملك فعالية تعدل neutralizes فعل الـ AGEs (12).
تشير هذه النتائج أن الـ esRAGE هو محصن خلوي cytoprotective ضد تأثيرات الـ AGEs (14).
 

الشكل 1: الأشكال المختلفة للـ RAGE
المواد والطرق Material and Methods  
شملت دراستنا 88 فرداً موزعين إلى ثلاثة مجموعات:
المجموعة الشاهدة: شملت أفراداً أسوياء ظاهرياً (12 ذكراً، 10 إناث) لا يعانون من السمنة أو الداء السكري ولا يتناولون أية أدوية، متوسط أعمارهم 40±11 عاماً.
مجموعة مرضى الداء السكري من النمط الثاني: شملت مرضى مصابين بالداء السكري من النمط الثاني (16 ذكراً، 17 أنثى) يتناولون أحد خافضات السكر الفموية على الأقل، متوسط أعمارهم 47±10عاماً.
مجموعة الأفراد البدينين: شملت أفراداً بدينين (17 ذكراً، 16 أنثى)، أسوياء ظاهرياً ولا يتناولون أياً من خافضات السكر الفموية، متوسط أعمارهم 41±12عاماً.  
الاعتيانSampling  
جمعت العينات في الفترة مابين 2/5/2008 و 25/9/2008 من مراجعي المراكز الطبية التالية: 1- الجمعية السورية لرعاية السكريين.
2- مركز العيادات الشاملة التابع لوزارة الصحة.
3- تم جمع معظم عينات المجموعة الشاهدة من متطوعين أصحاء لا يراجعون أي مركز طبي.
أخذت عينات الـدم (5 مل دم وريـدي على أنبوب جاف و 1 مل دم وريدي على أنبوب حاوٍ على مضاد تخثر EDTA) على الريق بعد صيام ليلة كاملة في الفترة مابين الساعة الثامنة والعاشرة صباحاً، ونُبِّذ الأنبوب الجاف مباشرة (3000 دورة في الدقيقة مدة 10 دقائق) ووزع المصل الناتج على أنبوبي إيبندورف، في كل أنبوب 500-300 مكل مصل باستخدام ممص ميكروي Micropipete، حفظت العينات في الدرجة -?80م إلى وقت إجراء المقايسات، أي حوالي ستة أشهر كحد أقصى. استخدمت القسيمة الأولى لكل عينة لمقايسة الـ esRAGE والقسيمة الثانية بقيت قسيمة احتياطية. في حين استخدم أنبوب الـ EDTA لمقايسة الهيموغلوبين السكري حيث حفظ في البراد بدرجة 2-8?م مدة يومين حتى وقت إجراء المقايسة.
أجريت مقايسة الـ esRAGE بطريقة الامتزاز المناعي المرتبط بالإنزيم ELISA بوساطة عتيدة لشركةPhoenix pharmaceutical. أجريت مقايسة الهيموغلوبين السكري بطريقة الاستشراب على العمود مبادل الأيونات باستخدام عتيدة لشركة Human.
أجريت الدراسة الإحصائية باستخدام اختبار T-Student لمقارنة المتوسطات الحسابية بين مجموعات الدراسة وعدّ الفارق معتداً به إحصائياً عند مستوى دلالة p<0.05، واختبار Pearson لدراسة علاقة الارتباط بين المتثابتات المدروسة.

النتائجResults
كانت المستويات البلازمية للـ esRAGE لدى مجموعات الدراسة على النحو التالي: المجموعة الشاهدة (0.37±0.13 نغ/ مل)، مجموعة مرضى الداء السكري (0.27±0.07 نغ/ مل)، مجموعة البدينين (0.26±0.06 نغ/ مل). وبتطبيق اختبار T-Student لوحظ انخفاض يعتد به إحصائياً في متوسط مستويات الـ esRAGE البلازمية لدى مجموعة الداء السكري مقارنة مع المجموعة الشاهدة، كما لوحظ انخفاض يعتد به إحصائياً في متوسط مستويات الـ esRAGE البلازمية لدى مجموعة البدينين مقارنة مع المجموعة الشاهدة، بينما لم يلاحظ فارق يعتد به إحصائياً بين في قيم الـ esRAGE بين مجموعة الداء السكري ومجموعة البدينين (الشكل 2).
وكانت قيم الهيموغلوبين السكري HbA1c لدى مجموعات الدراسة على النحو التالي: المجموعة الشاهدة (5.26±0.63%)، مجموعة مرضى الداء السكري (7.84±0.8%)، مجموعة البدينين (5.72±0.67%). وبتطبيق اختبار T-Student لوحظ ارتفاع يعتد به إحصائياً في متوسط قيم HbA1c لدى مجموعة الداء السكري مقارنة مع المجموعة الشاهدة، كما لوحظ ارتفاع يعتد به إحصائياً في متوسط قيم HbA1c لدى مجموعة البدينين مقارنة مع المجموعة الشاهدة، ولوحظ أيضاً ارتفاع يعتد به إحصائياً في متوسط قيم HbA1c لدى مجموعة الداء السكري مقارنة مع مجموعة البدينين.
وبدراسة علاقة الارتباط بين الـ esRAGE والهيموغلوبين السكري HbA1c لدى مجموعة مرضى الداء السكري من النمط الثاني لاحظنا وجود علاقة ارتباط عكسي يعتد بها إحصائياً حيث كانت قيمة الارتباط (r=- 0.344، p<0.05) (الشكل3).
أيضاً بدراسة علاقة الارتباط بين الـ esRAGE والهيموغلوبين السكري HbA1c لدى مجموعة البدينين لاحظنا وجود علاقة ارتباط عكسي يعتد بها إحصائياً حيث كانت قيمة الارتباط (r=- 0.327، p<0.05) (الشكل 4).  
المناقشة Discussion 
وجدنا من خلال الدراسة التي أجريناها انخفاضاً واضحاً في المستويات البلازمية للـ esRAGE لدى مرضى الداء السكري النمط الثاني مقارنة مع المجموعة الشاهدة. وهذا يعود إلى ارتفاع مستويات الغلوكوز لدى المرضى السكريين. وبما أن الغلوكوز هو المصدر الأساسي لتشكيل الـ AGEs فإن التراكيز المرتفعة من الغلوكوز ولفترة مديدة تسمح بتشكيل زائد للـ AGEs، الأمر الذي يؤدي إلى زيادة مستوياته وبالتالي ازدياد ارتباطه مع الـ esRAGE مما يؤدي إلى انخفاض مستويات هذا الأخير. 
يتوافق هذا مع دراسة Koyama H. وزملائه عام 2005 (15)، ودراسة Katakami N. وزملائه عام 2006 (16)، ومع دراسة Nishizawa Y. زملائه عام 2008 (17)، ودراسة Choi KM. وزملائه عام 2008 (18)، مع دراسة Koyama H. وزملائه عام 2007 (19). حيث أظهرت هذه الدراسات وجود فارق يعتد به إحصائياً في مستويات الـ esRAGE بين مجموعة الداء السكري من النمط الثاني والمجموعة الشاهدة.
كما وجدنا في هذه الدراسة وجود ارتباط عكسي يعتد به إحصائياً بين esRAGE والهيموغلوبين السكري HbA1c لدى مجموعة الداء السكري من النمط الثاني يعود ذلك إلى ارتفاع مستويات الغلوكوز التي تساهم بدورها في زيادة تشكل الـ AGEs وبالتالي تعمل على خفض مستويات الـ esRAGE كما ذكرنا سابقاً.
هذا يتوافق مع دراسة Katakami N. وزملائه 2006 (16)، ومع دراسة Choi K.M. وزملائه 2008 (18). التي أظهرت وجود ارتباط عكسي يعتد به إحصائياً بين الـ esRAGE والهيموغلوبين السكري HbA1c.
ولا يتوافق مع دراسة Koyama H. وزملائه عام 2005 (15)، ومع دراسة Humpert Per. M. وزملائه عام 2007 (20)، ومع دراسة Koyama H. وزملائه عام 2007 (19). التي لم تظهر وجود ارتباط عكسي يعتد به إحصائياً بين الـ esRAGE والهيموغلوبين السكري HbA1c.
عزت مجموعة Koyama H. عدم وجود ارتباط بين الـ esRAGE والهيموغلوبين السكري HbA1c، إلى أن قيم الـ esRAGE ترتبط عكسياً مع قيم الهيموغلوبين السكري فقط في بداية المرض لكن مع تقدم المرض لا يكون هناك علاقة. وردوا ذلك إلى تأثيرات الفشل الكلوي أو اعتلال الأوعية الدقيقة microangiopathy على مستويات esRAGE البلازمية.
أما مجموعة Humpert per. M. فقد عزت ذلك إلى تصميم مجموعة الدراسة لديها. والتي كانت مرضى سكريين لديهم بيلة ألبومينية الأمر الذي يؤثر على تصفية الـ esRAGE، حيث أن تصفيته تجري عن طريق الكلية، وبالتالي يؤثر ذلك على مستويات الـ esRAGE البلازمية.
أما بالنسبة لمجموعة البدينين فقد أظهرت دراستنا انخفاضاً واضحاً في المستويات البلازمية للـ esRAGE لدى هذه المجموعة مقارنة مع المجموعة الشاهدة ويعتقد أن ذلك يعود إلى زيادة استقلاب الشحوم المتوسطة لدى البدينين وحيث أنه من المعروف أن جزء من AGEs يتشكل من أكسدة الشحوم فإن ذلك يؤدي إلى تشكيل زائد للـ AGEs وبالتالي زيادة الارتباط مع esRAGE ونقص في مستويات هذا الأخير.
كما أظهرت دراستنا أيضاً وجود ارتباط عكسي يعتد به إحصائياً بين esRAGE والهيموغلوبين السكري HbA1c لدى مجموعة البدينين، يعتقد أن سبب ذلك ربما يعود إلى أن أغلب المرضى البدينين قد يكون لديهم عدم تحمل الغلوكوز IGT، والذي لم نختبره في دراستنا، وبالتالي اضطراب في سكر الدم وزيادة في تشكل الـ AGEs ومن ثم نقص في الـ esRAGE.

الشكل 2: متوسط تركيز esRAGE لدى مجموعات الدراسة.
المراجع References 
1-Brownlee M.
Biochemistry and molecular cell biology of complications.
Nature, 414: 813-820, 2001.

2-Stern DM; Yan SD; Yan SF. and Schmidt AM.
Receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) and the complications of diabetes.
Ageing Res Rev; 1: 1-15, 2002.

3-Yamamoto Y; Yamagishi S; Yonekura H; Doi T; Tsuji H. and Kato I.
Roles of the AGE-RAGE system in vascular injury in diabetes.
Ann NY Acad Sci; 902: 163-170, 2000.

4-Wautier J-L. and Guillausseau P-J.
Advanced Glycation End Products, Their Receptors And Diabetic Angiopathy.
Diabetes Metab; 27: 535-542, 2001.

5-Schleir ED; Wagner E. and Nerlich AG.
Increased accumulation of the glycoxidation product N2 (carboxymethyl) lysine in human tissues in diabetes and aging.
J Clin Invest; 99: 457-468, 1997.

6-Sell DR. and Monnier V.
Structure elucidation of a senescence cross-link from human extracellular matrix, Implication of pentoses in the aging process.
J Biol Chem; 264: 21597-21602, 1989.

7-Ikeda K; Higashi T. and Sano H.
N2 (carboxymethyl) lysine protein adducts is a major immunological epitope in proteins modified with advanced glycation end products of the Maillard reaction.
Biochem; 35: 8075-8083, 1996.

8-Huttunen HJ. and Rauvala H.
Amphoterin as an extracellular regulator of cell motility: from discovery to disease.
J Intern Med; 255: 351-366, 2004.

9-Schmidt AM; Vianna M. and Gerlach M.
Isolation and characterization of two binding proteins for advanced glycosylation end products from bovine lung which are present on the endothelial cell surface.
J. Biol. Chem; 267: 14987-14997, 1992.

10-Neeper M; Schmidt AM. and Brett J.
Cloning and expression of a cell surface receptor for advanced glycosylation end products of proteins.
J. Biol. Chem; 267: 14998-15004, 1992.

11-Sakurai S; Yonekura H; Yamamoto Y; Watanabe T; Tanaka N. and Li H.
The AGE-RAGE system and diabetic nephropathy.
J Am Soc Nephrol 14 Suppl; 3: S259-S263, 2003.
12-Yonekura H; Yamamoto Y. and Sakurai S.

Novel splice variants of the receptor for advanced glycation end-products expressed inhuman vascular endothelial cells and pericytes, and their putative roles in diabetes-induced vascular injury.
Biochem. J. 370: 1097-109, 2003.

13-Naka Y; Bucciarelli LG; Wendt T; Lee LK; Rong LL. and Ramasamy R.
Animal models and novel insights into the vascular complications of diabetes.
Arterioscler Thromb Vasc Biol; 24: 1342-1349, 2004.

14-Yonekura H; Yamamoto Y; Sakurai S; Watanabe T. and Yamamoto H.
Roles of the Receptor for Advanced Glycation Endproductsin Diabetes-Induced Vascular Injury.
J Pharmacol Sci; 97: 305-311, 2005.

15-Koyama H; Shoji T. and Yokoyama H.
Plasma level of endogenous secretory RAGE is associated with components of the metabolic syndrome and atherosclerosis.
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25: 2587-93, 2005.

16-Katakami N. et al.
Endogenous Secretory Receptor for Advanced Glycation End Product Levels Are Inversely Associated With HbA1c in Type 2 Diabetic Patients.
Diabetes Care, 29(2): 469, 2006.

17-Nishizawa Y. and Koyama H.
Endogenous secretory receptor for advanced glycation end-products and cardiovascular disease in end-stage renal disease.
J Ren Nutr; 18: 76-82, 2008.

18-Choi KM. et al.
Association between endogenous secretory RAGE, inflammatory markers and arterial stiffness.
Int J Cardiol; 132: 96-101, 2009.

19-Koyama H; Shoji T. and Fukumoto S.
Low circulating endogenous secretory receptor for AGEs predicts cardiovascular mortality in patients with end-stage renal disease.
Arterioscler Thromb Vasc Biol; 27: 147-153, 2007.

20-Humpert Per M.
Soluble RAGE but not endogenous secretory RAGE is associated with albuminuria in patients with type 2 diabetes.
Cardiovascular Diabetology, 6, 9, 2007.  
 
 
المجلد 5 , العدد 6 , محرم 1431 - كانون الثاني (يناير) 2010

 
 
SCLA