تعد الوحيدة CK2β أساسية من نواح عديدة لوظيفة CK2 مثل: تعزيز الفعالية والثبات، انتخاب الركازة، تخفيض الركائز أو المنظمات الفعالة. أظهرت دراسات الترسيب المناعي Immunoprecipitation والفحص المجهري المبائر (المتشارك بالبؤرة) confocal microscopy بأن CK2β تتوضع في مكونات الخلية مجردة من الوحيدات التحفيزية وتتصرف كشريك لبروتينات كيناز متنوعة (2).

من ناحية أخرى، تبدي CK2α و CK2ά خواصاً إنزيمية متشابهة في المختبر بسبب الهوية المتقاربة بنسبة %90 في الميدان domain التحفيزي على الرغم من أنها تنشأ عن جينات مختلفة (11). وبشكل مغاير للتشابه الإنزيمي العالي فإن النهاية الكربونية C-terminal لكل من CK2α و CK2ά غير مرتبطة مطلقاً، مما يقترح وجود وظائف هامة لهذا الميدان domain مثل التوضع أو الفسفرة. وفي الحقيقة ينشأ الاختلاف الوظيفي بين CK2α و CK2ά في خلايا الثدييات عن بروتينات التآثر نوعية الأشكال المتماثلة isoform-specific (17). يقدم التشابه مع CK2β دليلاً أوضح بأن الوحيدات التحفيزية قد تكون لها وظيفة مستقلة عن عميم الإنزيم holoenzyme CK2. تتفسفر بعض الركائز بوساطة CK2α أو β CK2 وليس بوساطة عميم الإنزيم holoenzyme CK2، والعكس بالعكس vice versa، كما في حالة الكالمودلين Calmodulin و P27^KIP (8). يعتقد أن عدداً من الوحيدات التحفيزية المستقلة تتنظم بشكل مباشـر أو غير مباشـر بوساطة التآثـر مع البروتينات داخل الخلوية.

أشارت الدراسات السابقة بأن الوحيدة CK2α يعبر عنها في النسج المتنوعة للثدييات بشكل واسع وغزير (13). تكون الفئران التي لديها CK2α غائب knockout mice (ko) غير عيوشة نتيجة فشل تطور القلب والأنبوب العصبي (17). كما أشارت الدراسات المطبقة على الفئران بأن غياب CK2β يؤدي إلى عيب استقلال الخلية cell-autonomous defect وإلى موت المضغة مبكراً (4، 5). من جهة أخرى، يعبر عن CK2ά في الفئران بشدة في الخصى والدماغ (18). تكون الذكور التي لديها طفرة في CK2ά عقيمة، بينما تبدي الإناث الطافرة خصوبة طبيعية. لوحظ في مرحلة تكون النطاف بأن الفئران التي لديها حذف في ترميز الجين CK2ά لديها عدة خلايا تعاني الاستماتة، بينما الخلايا القليلة الباقية على قيد الحياة تكون قادرة على تشكيل البربخ وتبدي شذوذات في الرأس مشابهة لتلك الملاحظة في متلازمة تكور رأس النطفة globozoospermia لدى البشر (1). يعد الجسيم الطرفي (الأكروزوم) acrosome حويصلة مفرزة متصلة برأس النطفة تلعب دوراً في الإخصاب عبر تحرير إنزيمات تساعد في حل المنطقة الشفافة zona pellucid للبويضة (24). توصف متلازمة تكور رأس النطفة globozoospermia بأنها اضطراب عائلي يؤدي إلى إنتاج نطاف لها رأس مدور بشكل شاذ ولا تتحرك بشكل مغزلي (25)، تكون النطاف مدورة الرأس غير قادرة على إلقاح البويضة وفي الحالات الشديدة يكون الجسيم الطرفي (الأكروزوم) غائباً (22).

استخدمت في هذه الدراسة طريقة التألق المناعي immunoflourescence ولطخة ويسترن western blot لدراسة التعبير عن الوحيدات CK2ά و CK2β خلال المرحلة الأولى من تكون النطاف في خصى الفئران البالغة. بينت النتائج اختلاف التعبير والتوضع لهذه الوحيدات مما يقترح أدواراً مختلفة للبروتين كيناز CK2 عند تكون النطاف.

سـتخدمت فئـران ذكور (عدد50 ) من نوع

Sprague-Dawley من مختلف الأعمار، وهي الأكثر توافراً والأسهل استخداماً والتي أثبت التحليل الكيميائي المناعي للنطاف وجود البروتين كيناز CK2 لديها، حيث استخدمت خمسة فئران من مختلف الأعمار منها كشاهد، وذلك من مركز حيوانات التجربة التابع للمجموعة البحثية للبروفسور ماتياس مونتينار في مدينة هومبرغ سار في ألمانيا وجرى العمل في مختبر البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الطبية، وذلك خلال صيف عام 2009.

وضعت الفئران ضمن دورة 12 ساعة ضوء و 12 ساعة ظلام مع الماء والطعام، وذلك من أجل تنبيه الجهاز العصبي المركزي لديها، ثم جرى قتل الفئران من قبل المجموعة المتخصصة والمدربة، في مركز حيوانات التجربة المذكور، باستخدام الخلع الرقبي cervical dislocation. كما جرى تطبيق التحاليل الموصى بها من قبل تطوير المرشد لأجل رعاية واستخدام حيوانات التجربة في التعليم والبحث العلمي.

عزل النطاف والكيمياء الخلوية المناعية

قامت المجموعة المتخصصة بالتعامل مع الحيوانات حسب الإرشادات القانونية المتبعة والتابعة للمجموعة البحثية للبروفسور مونتينار في مركز البيولوجيا الجزيئية في ألمانيا، بعزل النطاف من الفئران، وذلك بغمر بربخ الفأر في وسط wittingham medium دون ألبومين مصل البقر BSA ثم تقسيمه إلى أجزاء صغيرة رفيعة باستخدام مشرط. تم حضن القطع بالدرجة 37م وضغط %5 CO₂ في مستنبت chamber للسماح للنطاف بالسباحة خارج لمعة البربخ. نبذ المعلق بسرعة 3000 g لمدة 5 دقائق ثم غسلت الرسابة باستخدام دارئة فسفاتية لإزالة الوسط العالق. استخدمت الرسابة لاستخلاص البروتين. لإنجاز تحاليل الكيمياء الخلوية المناعية، علقت الرسابة في بارافورمألدهيد %4 لمدة ساعة.

استخلاص البروتين ولطخة ويسترن western blot

جرى استخلاص البروتين بمجانسة النطاف المعزولة كما ذكر سابقاً، حيث وضعت في الدارئة:

Buffer A (1% Triton X-100, 1 M NACL, 1 m M EDTA, 10 mg/ml phenylmethane sulfonyl-fluoride, 20 mM TRIS-HCL PH 7, protease inhibitors leupeptin, aprotinin and E-64).

ثم نبذت العينات لمدة 10 دقائق بسرعة 3000 g بدرجة 4م. حدد تركيز البروتين في السائل الطافي حسب طريقة Bradford مع استخدام محلول BSA كمعياري (Bradford 1976). ومزج حوالي 100 µg من البروتينات مع دارئة lumli 3x، سخن الناتج لمدة 5 دقائق بالدرجة 95م من أجل أن تسمخ البروتينات. رحلت الخلاصات الناتجة على هلامة عديد الأكريلاميد %12.5 SDS-polyacrylamide ثم نقلت إلى أغشية نتروسلولوز.

طبقت بعد ذلك تقانة western blot فحضنت الأغشية لمدة ساعة مع دارئة الإحصار %2 blocking buffer، BSA/PBS وحضنت طوال الليل بدرجة 4م مع أضداد أولية نوعية ذوابة في محلول الإحصار وهي أضداد الوحيدة CK2ά متعددة النسائل مشتقة من البقر وبتركيز (400 ng/ml)، بالإضافة إلى أضداد الوحيدة CK2β متعددة النسائل مشتقة من الأرانب وبتركيز (200 ng/ml)، وكلاهما من Santa Cruz Biotechnology, Calif; USA أو β-actin (1 µg/ml; Sigma, USA).

بعد ثلاث مرات غسل في الدارئة التالية: 0.1% Tween-20 in PBS (PBST) لمدة 10 دقائق في كل مرة، جرى كشف الأضداد الأولية باستخدام أضداد ثانوية مقرونة بالإنزيم alkaline-phosphatase باستخدام نظام NBT/BCIP، ثم أظهرت النتيجة بتطبيق نظام ECL. أعطى التفاعل مع الضد anti- CK2β عصابة واحدة فقط مع الأضداد المأشوبة his₆-tagged recombinant protein. ولقد برهن الامتزاز البدئي لأضداد anti- CK2ά مع ببتيد الإحصار الشاهد (Santa Cruz Biotechnology) أو مع CK2β المأشوب recombinant للضد العصابة الملاحظة في الشاهد.

التألق المناعي Immunoflourescence

جرت مقايسة CK2 في نطاف الفأر المغمورة بالبارافين 5 µm والمثبتة بمحلول Bouin. عوملت العينات بالماء الأكسجيني 3% H₂O₂ مدة 5 دقائق، ولمنع الارتباط غير النوعي طبق نظام إحصار البروتين المعياري لمدة 5 دقائق. جرى الغسل مرتين لمدة 5 دقائق في دارئة TRIS-HCL بدرجة باهاء pH 7.6 مع 0.3 M NaCl و 0.1% Tween 20 ثم أذيبت الأضداد: أضداد الوحيدة CK2ά متعددة النسائل مشتقة من البقر (400 ng/ml) وأضداد الوحيدة CK2β متعددة النسائل مشتقة من الأرانب (200 ng/ml)، كلاهما من Santa Cruz Biotechnology, Calif; USA في محلول الإحصار ثم طبقت على العينات التي جرى حضنها طوال الليل بدرجة 4م في غرفة رطبة. بعد ذلك، أضيفت الأضداد التالية وجرى الحضن لمدة 15 دقيقة:

Biotinylated secondary antibody, streptavidine-biotinlated-peroxidase complex, amplification reagent (biotinyltyramide), and peroxidase-conjugated streptavidine (Lab-Vision)

أخيراً، أضيف محلول تلوين الركازة (محلولDABI ) لمدة 5 دقائق وهو يتألف من:

Concentrated TRIS-HCL, 0.8% H₂O₂, 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DABI)

غسلت الأجزاء بالماء المقطر. قرئت العينات باستخدام مجهر تألق لشركة zies وصورت النتائج بكاميرا ديجيتال باستخدام برنامج التألق المناسب على الحاسوب.

لتوضع والتعبير عن الوحيدات CK2ά و CK2β في المرحلة الأولى لتكون النطاف عند الفأر

جرى تحليل مستويات البروتين CK2ά و CK2β في نطاف مأخوذة من فئران تتراوح أعمارها بين 5-60 يوماً. أظهرت لطخة ويسترن western blot بأن مستوى البروتين

CK2β بقي ثابتاً ضمن الفترة المدروسة بينما ارتفعت مستويات البروتين CK2ά بشكل ثابت في الفئران التي يتراوح عمرها ما بين 35-5 يوماً ثم بقي ثابتاً وصولاً إلى عمر 60 يوماً، (الشكل 2).

درس التوضع دون الخلوي للوحيدات CK2ά و CK2β بين أنماط الخلايا الأصلية المختلفة خلال المرحلة الأولى من تكون النطاف. ووجد أن الوحيدة CK2ά لها توضع نووي في خلايا سيرتولي والخلايا الإنتاشية germ في الفئران البالغ عمرها 5 أيام، (الشكل 3). لم يلاحظ التوضع النووي للوحيدة CK2ά في خلايا سيرتولي في خصى الفئران الأكبر عمراً. أظهرت خلايا النطاف المأخوذة من فئران يبلغ عمرها 35-25-15 يوماً، توسيماً قوياً strong labeling في العضيات الهيولية، والتي بناء على توضعها وبنيتها، اتضح أنها في جهاز غولجي، (الشكل 4). تتوضع CK2ά أيضاً في هيولى أرومة النطاف المدورة والمتطاولة في الفئران البالغ عمرها 45 و 60 يوماً. أبدت أرومة النطاف المتطاولة إشارة قوية في الفصوص الهيولية Cytoplasmic lobes. فحصت نوعية الضد سابقاً بتطبيق لطخة ويسترن western blots ولم تظهر تجارب الشاهد بدون الضد الأولي أية إشارة في أي عمر مدروس.

أظهرت الوحيدة CK2β توضعاً نووياً وهيولياً خلال المرحلة الأولى من تكون النطاف. تتوضع CK2β في نواة بعض خلايا سيرتولي وفي هيولى بعض خلايا (طليعة أرومة النطاف) gonocytes في الحيوانات البالغ عمرها 5 أيام. استمر التعبير الهيولي عن الوحيدة CK2β في الحيوانات الأكبر وكان واضحاً في خلايا النطاف وأرومة النطاف المدورة. لوحظت CK2 في الجسم الثمالي residual body لأرومة النطاف المبكرة والمتأخرة. فحصت نوعية الضد سابقاً بتطبيق لطخة ويسترن western blots ولم تظهر تجارب الشاهد بدون الضد الأولي أية إشارة في أي عمر مدروس، (الشكل 5).

يتألف البروتين كيناز CK2 من ثلاث وحيدات مختلفة هي α، ά، β. جرى في هذه الدراسة تحري وحيدتين فقط هما CK2β و CK2ά. لسوء الحظ لم تتوفر أضداد ضد الوحيدة CK2α موثوق بها. أنتجت غالبية الأضداد التجارية إشارات labeling غير نوعية في طريقة الكيمياء النسيجية المناعية المطبقة. لذا جرى العمل فقط على الأضداد التي أعطت إشارة نوعية ومتكررة. أظهرت الوحيدات CK2β و CK2ά تنوعات في التوضع دون الخلوي subcellular في كل من خلايا سيرتولي وخلايا germ خلال المرحلة الأولى من تكون النطاف وخلال مرحلة البلوغ. لا يمكن إهمال مشاركة CK2α في هذه الخلايا، فهذه النماذج قد ترتبط بالوظائف المختلفة لهذه الوحيدات مثل فسفرة عوامل الانتساخ و/ أو تنظيم جزيئات الإشارة الهيولية. هذا الموضوع هام ويحتاج إلى دراسة.

إن الفهم القليل والمثير للجدل هو صفة دور CK2 في الانقسام المنصف. لوحظ وجود الوحيدات CK2β و CK2ά في خلايا النطاف وتبدي كلتا الوحيدتين نموذج تعبير متماثل مع وجود مستوى تعبير أعلى في خلايا النطاف في الحيوانات البالغة. وربما يساهم هذا التوضع المختلف للوحيدتين في تنظيم الجينات النوعية الداخلة في الانتصاف (الانقسام المنصف) أو في التعبير الجيني عن بروتينات نوعية والتي تدخل في إشارة نظيرة الصماوية paracrine (9).

من جهة أخرى، لوحظت كلتا الوحيدتين في خلايا النطاف Pachytene خلال المرحلة الأولى من تكون النطاف. وجدت CK2β في النواة بينما CK2ά في الهيولى وقد حددت هذه التوضعات المختلفة في الخصى البالغة (12).

يعبر عن الوحيدة CK2β بشكل كبير في بزرة النطاف للفئران البالغة، وقد يعود هذا إلى الوظيفة النوعية ولكن غير المعروفة في العلم الحيوي للخلية الجذعية الإنباتية. عرف سابقاً بأن للبروتين كيناز CK2 دوراً في دورة حياة الخلية عن طريق التآثر مع و/ أو فسفرة العديد من البروتينات مثل P53 (27)، P27^KIP (20)، c-myc (23)، و β-catenin (22).

من الجدير بالملاحظة بأن الوحيدات CK2ά و CK2β تتوضع بشكل مختلف في حويصلة الجسيم الطرفي (الأكروزوم) وكامل السوط على الترتيب في الحيوان المنوي للفأر الناضج. يعكس هذا التوضع الوظائف النوعية لكلتا الوحيدتين في الإخصاب. مثلاً تتدخل CK2ά في سبل تنبيغ الإشارة المرتبطة بالاستجابة السريعة لحويصلة الجسيم الطرفي (الأكروزوم) بعد التماس بين النطفة والبيضة. من جهة أخرى تبين أن CK2β تنظم التعضي لمغزل الانقسام الفتيلي الذي له اهتداء نوعي مع احترام الغشاء الأساسي في الفئران (29).

برهنت هذه الدراسة على أن CK2ά و CK2β يتواجدان في منطقة الجسيم الطرفي (الأكروزوم) للحيوان المنوي الناضج، مما يقترح أنها تنظم تفاعل الأكروزوم. كما أن مشاركة CK2ά في النقل داخل الخلوي يدعم فكرة مشاركته في تسرب الأكروزوم. لا تسمح المعلومات المتوافرة لدينا بمعرفة التوضع الدقيق للوحيدات CK2ά و CK2β في المنطقة الأكروزومية. فهما يمكن أن تتوضعا في الهيولى بين الغشاء الهيولي وغشاء الأكروزوم الخارجي أو في الفراغ خارج الخلوي مجاورة للغشاء الهيولي.

على الرغـم من أنه وجد CK2 يتوضـع في

الفراغ خارج الخلوي ضمن بعض الشروط، إلا أنه يوجد أيضاً في الهيولى (14). تبنى هذه النظرية على التوضع الهيولي لهذا الإنزيم و وحيداته ضمن خطوات متنوعة لتمايز أرومة النطاف. سنحتاج إلى عدة تحاليل لتحديد التوضع الرئيسي للوحيدات CK2ά و CK2β في رأس النطفة (14، 16). تؤسس هذه الدراسة لتقصي أعمق لدور فعالية CK2 في تفاعل الأكروزوم وهو المشارك الجديد في عملية الإخصاب لدى الثدييات.

تقترح نماذج KO mouse بأن وظيفة Ck2β غير ضرورية في إنتاج النطاف وخصوبة الذكر (15)، مما يشير إلى وظيفة فائضة لهذه الوحيدة. إن حذف جين Ck2ά يطور pups عيوش لكنها عقيمة في مرحلة البلوغ لأنها تنتج نطافاً شاذة شكلياً ينقصها الجسيم الطرفي (الأكروزوم) (28). أوضحت معطيات الدراسة بأن Ck2ά تتوضع في الهيولى وفي جهاز غولجي خلال المرحلة الأولى من تكون النطاف. بينت النتائج أيضاً مشاركة نقل الغشاء داخل الخلوي بين جهاز غولجي والأكروزوم وهذا ما توافق مع دراسة Towbin et al. (19). إن غياب Ck2ά في KO mouse قد يفسد تشكل حبيبات الجسيم الطرفي (الأكروزوم) proacrosomal granules مما يؤدي إلى غياب أو سوء تشكل الجسيم الطرفي (الأكروزوم). إن أي عبث في النقل الغشائي بين جهاز غولجي والأكروزوم في الخطوات الأخيرة لتمايز أرومة النطاف قد يسهم في غياب الأكروزوم (26، 27). ولقد أكدت هذه النتائج على الدور الوثيق للوحيدة Ck2ά في تنظيم التشكل الحيوي للجسيم الطرفي (الأكروزوم) في مرحلة تكون النطاف لدى الثدييات.

على الرغم أن CK2 إنزيم رباعي القسيمات فإن وحيداته تختلف في التعبير والتوضع خلال الدورة الأولى من تكون النطاف وخلال البلوغ لدى الفأر. اقترحت هذه النتائج أنه خلال تكون النطاف تستطيع الوحيدات بمفردها تنظيم العمليات النوعية بشكل مختلف عن تلك التي تتنظم بوساطة الإنزيم الكلي. رغم أن CK2 إنزيم معبر عنه بشكل وافر فله نموذج تعبير خاص خلال تكون نطاف الفأر قد يشرح النمط الظاهري الملاحظ في KO mouse. يضاف إلى ذلك أن هذا الإنزيم له وظيفة في فيزيولوجية النطفة حيث يعبر عنه في النطاف الناضجة كما أن دوره في الإخصاب يحتاج إلى دراسة أوسع.