| الملخص Abstract |
لمعرفة جدوى التشخيص بالاعتماد على أوساط الزرع الجرثومي في مخابرنا، جرى جمع 50 عينة اشريكية قولونية E. Coli من مخابر متعددة، وأعيد زرع المستعمرات المعزولة على أوساط EMB انتقائية وحفظت، ثم طبقت كل من الاختبارات الكيميائية الحيوية باستخدام مجموعة الـ API E-20 وطريقة الـ PCR باستخدام بادئة نوعية. أظهرت نتائج الـ PCR أن 44 مستعمرة كانت اشريكية قولونية بينما 6 مستعمرات لم تكن E. Coli، وهذا يعني أن نسبة الخطأ في التشخيص كانت 12%. بينما أظهرت نتائج الـ API E-20 أن نسبة الخطأ في التشخيص كانت 20% لأن 40 مستعمرة فقط كانت E. coli. |
To know the reliability of bacterial culture media in our laboratories, 50 Escherichia coli samples were collected from several labs, these 50 isolated colonies were recultured on selective media EMB and stored, then biochemical tests API E-20 and PCR technique were applied on them. PCR results show that 44 colonies were E. coli while 6 were not E. coli, this means that the wrong diagnosis ratio was 12%. API E-20 results show that the wrong diagnosis ratio was 20% because only 40 isolated colonies were E. coli. |
| المقدمة Introduction |
| هذه المقالة هي جـزء من بحث وواحـدة من أهداف دراسة واسعة تتعلق بالجراثيم المعزولة من عينات غذائية وبشرية؛ بهدف كشف وجود الإشريكية القولونية الممرضة من النمط المصلي O157. ومما دعانا لكتابتها أننا وجدنا مختبراتنا تحتاج وبشكل دائم إلى ضبط الجَودة والتقييم المستمر لما نستعمله من طرق ومواد، ومعرفة مصداقيتها والمشاكل والمحاذير التي يجب تجنبها ضمن ظروفنا وإمكاناتنا. وانطلاقاً من ذلك بدأت هذه الدراسة العملية التي كان من أحد وجوهها المتعددة تقييم طريقة التعرف الجرثومي ID المعتادة في المختبرات الطبية لعصيات الإشريكية القولونية Escherichia coli على أغار EMB؛ وذلك بالمقارنة مع كل من التعرف الجرثومي: بالاختبارات الكيميائية الحيوية والتعرف بالطريقة المورثية "التفاعل السَّلْسَلي للبوليميراز PCR". جرى انتقاء الإشريكية القولونية Escherichia coli لعدة أسباب: أن هذه الجراثيم معروفة وكثيرة الورود إلى المختبرات وهي سهلة التشخيص على أوساط الزرع البدئي عموماً - وتشكل في بعض الأحيان آفات جدية سواءً في أخماج البول أو الدم أو السوائل الحيوية، أو في سياق وجودها الطبيعي وهو الأمعاء، حيث تسبب بعض أنماطها المصلية Serotypes أمراضاً إنتانية في جهاز الهضم قد تؤدي للموت والتي أشهرها النمط O157 ثم النمط O111 والـ O26؛ وهذا ما كان موضوع الدراسة أصلاً (Roman 2006، Ghosh et al; 2007، Takano 2008، Crane 2008)، أما انتقاء الطرق الثلاث: فكان أساسه انتقاء طرق مختلفة المبدأ وتجمع بين مراحل مختلفة من تطور طرق الكشف الجرثومية، حيث أن الكشف بوساطة الأوساط الانتقائية (طريقة تعتمد الصفات الشكلية) هو الأكثر شيوعاً وقدماً، تليها طريقة التعرف بوساطة التفاعلات الكيميائية الحيوية (طريقة تعتمد الاستقلاب والصفات الكيميائية الحيوية) والتي تطورت حتى أخذت الشكل المجموعي الـ API E20 فأصبح التعرف على الجرثومة ينجز باستعمال منظومة مجهزة ومتخصصة بتفاعلات الكشف عن جراثيم عائلة معينة، وحديثاً ومع ثورة الهندسة الوراثية اعتبر الـ PCR من أكثر وسائل التشخيص اعتماداً وشيوعاً في العالم ويحمل مصداقية عالية. (Lantz et al; 2000). |
| هدف البحثThe target |
| تقييم طريقة التعرف الجرثومي - الشائعة في مختبراتنا - من خلال الصفات الشكلية Form لمستعمرات الإشريكية القولونية Escherichia coli على أغار EMB؛ وذلك بمقارنتها مع كل من طريقتي التعرف: بالاختبارات الكيميائية الحيوية API E20 و التعرف المورثي بطريقة PCR. |
| العينات Samples |
مستعمرات جرثومية على أغار الـ EMB مشخصة على أنها إشريكية قولونية بالاعتماد على وصف المستعمرات على أوساط الزرع البدئي المعتادة في المختبرات الطبيـة؛ عزلت
من عينات مرضية.
جرى جمع 50 مستعمرة معزولة للإشريكية القولونية من المرضى أغلبها من زروعات البول. أخذت العينات من عدة مختبرات خاصة وأخرى تابعة لمستشفيات عامة في محافظة دمشق وعلى فترات زمنية متباعدة عبر 6 زيارات خلال الأشهر الأربعة من كانون الثاني إلى نيسان من عام 2008 (الجدول 1).
|
الجدول 1: العينات المدروسة وزمن الحصول عليها.
الشهر |
كانون الثاني |
شباط |
آذار |
نيسان |
المجموع |
عدد العينات |
9 |
4 |
30 |
7 |
50 |
|
| المواد والأوساط Materials and media |
أغار اليوزين وزرقة الميثيلين :(EMB) وسط انتقائي خفيف شائع الاستعمال، ينمي مستعمرات العصيات سلبية الغرام ويثبط نمو إيجابيات الغرام عموماً، عامل الانتقاء: زرقة الميثيلين مع اليوزين (ديفكو– أمريكا).
وسط لوريا :Luria medium وسط منم عام، استخدم بثلاثة أشكال: أطباق أغار لوريا للاستعمال المنوالي وهو يشابه الأغار المغذي البسيط ويحفظ بالبراد. ومرق لوريا المكثر LB broth لاستخلاص الـ DNA وهو يشابه المرق المغذي البسيط أيضاً؛ ويحفظ بالبراد. ومرق لوريا مع الغليسيرول (80% مرق لوريا مع 20% غليسيرول) لغاية الحفظ طويل الأمد في الدرجة – 20م أو -80°م.
|
مجموعة الاختبارات الكيميائية الحيوية التفريقية المجموعية API 20E: جرى انتقاء منظومة الـ API 20E الخاصة بعائلة الإمعائيات Enterobacteriaceae Pyatkin.,1980)) التي تختبر 23 صفة كيميائية حيوية تفريقية هي:
- التحري عن فعالية إنزيمات: الغالاكتوبيرانوزيداز، الأرجنين ثنائي الهيدرولاز، الأكسيداز.
- تفاعلات نزع زمرة الكربوكسيل من الأحماض الأمينية: الليزين، الأورنيثين.
- تفاعل نزع زمرة الأمين من الحمض الأميني التربتوفان.
- تفاعلات تخمير السكاكر التالية: الغلوكوز، المانيتول، الإينوزيتول، السوربيتول، الرامنوز، السُّكْروز، المليبيوز، الأميغدالين، الأرابينوز.
- تفاعلات إنتاج: الإندول، الأسيتوئين.
- تفاعلات إنتاج غازات: كبريت الهيدروجين H2S، أوكسيد الآزوت NO2، الآزوت N2.
- تفاعلات دراسة صفات: تميّع الهلام، استعمال السيترات، حلمهة اليوريا (اليورياز).
يجري تعيين نوع الجرثومة المعزولة بالرجوع إلى الفهرس الخاص المعتمَد من قبل الصانـع
بمقارنة النتائج. عمل الـ PCR: لشركة Perkin-Elmer (Cetus Co; Norwalk Conn; USA), Pharmacia LKB Biotechnology (Uppsala, Sweden)، هيئة الطاقة الذرية السورية. أما جهاز الـ PCR فهو من طراز PC-512 من شركة techne الانكليزية England.
السُّلالة المرجعية للإشريكية القولونية: جرى إنجاز العمل بالقياس على السلالة المرجعية التي مصدرها كلية العلوم وهي السلالة: Escherichia coli ATCC No.8739؛ وهي تتميز بأنها تمتلك الصفات الكيميائية الحيوية النموذجية للنوع.
|
| الطرق Methods |
حفظ العينات:
زرعت المستعمرات المُسْتقدمَة: على أطباق أغار لوريا وحضنت اعتيادياً ثم حفظت بعد لفها بالبارافيلم في درجة حرارة البراد للاستخدام عند الحاجة مع مراعاة تسجيل تاريخ كل زراعة، ومع ملاحظة تجديد زراعتها كل فترة بالرجوع إلى الأنابيب المحفوظة بالمجمدة إذا ما هرمت المستعمرات.
جرى نقل مستعمرة معزولة نقية طازجة من أغار لوريا إلى 3 مل مرق لوريا ووضع في حاضنة هزازة لمدة 24 ساعة، في اليوم التالي جرى تنبيذ المرق بشكل عقيم بسرعة عالية ولمدة 15 دقيقة؛ ثم أُبين Decant الطافي؛ أما الثفالة الجرثومية المتبقية فغُسلت بمحلول الدارئة الفسفاتية PBS العقيمة. ومن ثم أضيف لكل أنبوب 2 مل مرق LB مع الغليسيرول ووزع على أنبوبي إيبندورف eppendorf، ثم وضع أحدهما في المجمدة -80°م والآخر في -20°م إلى حين الاستعمال.
طريقة التعرف الجرثومي المعتمدة على الشكل Form: وهي الطريقة محل التقييم في الدراسة؛ وتعتمد على خصائص المستعمرات الجرثومية Characteristics Colonies ووصفها على الأوساط الشائعة. اعتمد وسط الأغار الانتقائي selective medium EMB الشائع؛ فزرعت عليه جميع المستعمرات الواردة كونه مميزاً للإشريكية القولونية: القطر 1-2، ملم قاتمة اللون ملساء؛ وذات لمعة معدنية خضراء مميزة وافرة تطغى على المستنبت (Barbara et al; 2000) .
|
| الطريقة المعتمدة على الخصائص الكيميائية الحيوية Biochemical Tests التفريقية: |
| وهي مجموعة اختبارات كيميائية تفريقية؛ استخدم لها عتيدة API 20E لشركة بيوميريو الفرنسية؛ وجرى تنفيذ خطوات العمل وقراءة النتائج بحسب تعليمات الصانع: تستحلب مستعمرات نقية طازجة عمرها 18-24 ساعة ابتداءً من وسط خالٍ من المُشعِرات (أغار لوريا) في محلول جاهز (API NaCl, 0.85%) عقيم؛ ثم توزع كمية متساوية على آبار شريط الاختبارات التي تحوي كل منها الكواشف اللازمة لاختبار كل صفة كيميائية على حدة؛ ثم يحضن الشريط بدرجة حرارة 37م. وفي اليوم التالي تضاف الكواشف اللازمة لإظهار نتائج بعض التفاعلات؛ وتطبق خطة بيوميريو لكشف نوع الجرثومة بالمقارنة ويرجع إلى الفهرس في معرفة النتيجة حسب الرقم الخاص الناتج التابع لكل عزلة مختبرة. |
| الطريقة الحيوية الجزيئية (التفاعل السَّلْسلي للبوليميراز PCR): |
* المبدأ:
يعتمد على تضخيم جزء من المادة المورثية (تتاليات معينة من النوكليوتيدات أو جين معينة مثلاً) للكائن المتحرى عنه بالاستعانة بإنزيم بوليميراز Polymerase يتحمل درجات الحرارة العالية، حيث تمر المادة الوراثية بعدة دورات حرارية متتالية بالتسخين والتبريد؛ يجرى فيها أولاً انفصال شريطي الـ DNA ثم التحام البادئة Primer النوعية المضافة بمكانها المخصص على النيكليوتيد المعنيّ؛ ثم تحدث مرحلة الاستطالة بنسخ شريط DNA جديد بقياس معلوم تحدده البادئة Primer. تعاد الدورة 35 مرة. ومن ثم يجري ترحيل الناتج بتيار كهربائي عبر هلامة الأغاروز، يرحل خلالها الـ DNA الأصغر حجماً بسرعة أكبر؛ ثم يُظهر القياس باستعمال مادة كيميائية ترتبط بالـ DNA تكشفها الأشعة فوق البنفسجية. فإن لم تظهر العصابة Band المتوقعة فمعناه أن الكائن الهدف غيـر
موجود (Bertrand, Roig, 2007).
* خطوات الطريقة:
زرعت العزلات الجرثومية النقية في المرق؛ ثم عزلت الثفالة واستخلص الـ DNA. وبعد ذلك جرى:
– استخلاص الدنا DNA extraction باستخدام طريقة (TRI reagent protocol):
- تحضير مزيج المواد الخاص بالـ PCR ((PCR mixture.
- استنبات الجرثومة في 10 مل مرق لوريا.
- ينقل 5 مل من معلّق الجرثومة إلى أنبوب التنبيذ، لينبذ بسرعة 4000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق ويتم إكمال العمل على الثفالة الجرثومية، حيث تستخدم مواد وإجراءات غايتها تحطيم الجدر الخلوية والتخلص منها ومن البروتينات؛ بأن تعرض للأمواج فوق الصوتية sonication والصدمات الحرارية؛ وإضافة الإنزيمات الحالّة للجُدُر.
- في النهاية وبعد عدة خطوات من الإضافات والتنبيذ والإبانة تترك ثفالة الـ DNA لتجف في الحاضنة بالدرجة 37°م ثم تمدد بالـماء المقطر لتظهر بشكل خيوط واضحة.
- يقاس تركيز الـ DNA بجهاز خاص ((techne, PC-512, England، ويمدد المحلول حتى يصل التركيز 100 نغ/ مكل ويحفظ في الثلاجة.
* المشْرع النوعي (البادئة):
جرى استخدام بادئة مصنّعة محلياً في هيئة الطاقة الذرية تستهدف قطعة من الجين المُرمِّزة لإنتاج إنزيم الفسفتاز القلوية ALP الخاصة بجراثيم الإشريكية القولونية؛ تتألف هذه القطعة من 496 نكليوتيداً؛ وتلتحم البادئة النوعية المستعملة على دنا الجرثومة عند درجة الحرارة 56°م (الجدول 2).
* تطبيق جهاز المُّدوِّر الحراري Thermorotator:
البرنامج الذي جرى تطبيقه في جهاز الـ PCR هو التالي؛ حيث تمر كل دورة بالأطوار التالية:
بالدرجة 94م لمدة ثلاثين ثانية: التمسخ Denaturation بانفصال شريطي الدنا (تفكك الروابط أو الجسور الهيدروجينية بين الأسس الآزوتية).
بالدرجة 56م لمدة 45 ثانية: التحام Annealing البادئة مع شريط الـ .DNA
أخيراً بالدرجة 72م لمدة 90 ثانية: مرحلة الاستطالة Extension أو التطويل.
وبانتهاء الدورات ينتهي البرنامج عند درجة الحرارة 72م لمدة 10 دقائق؛ ثم التبريد حتى الدرجة 10م.
* تطبيق الرحلان الكهربائي Electrophoresis على هلامة الأغاروز Agarose gel:
تستخدم الهُلامة لترحيل الـ DNA الناتج عن تفاعل الـ PCR، الأغاروز بتركيز 1.5%؛ وجرى ترحيل 15 مكل من نواتج الـ PCR. جرى الرحلان بفرق كمون 85 فولتاً لمدة ثلاثين دقيقة. وحددت النتيجة باستخدام الأشعة فوق البنفسجيةUV .
|
| النتائجResults |
1- الطريقة المعتمدة على شكل المستعمرات Form باستخدام وسط الـ EMB:
يتم بشكل اعتيادي في المختبرات الطبية عموماً تشخيص جنس المستعمرة بناءاً على الصفات الشكلية دون الاستعانة بأية وسيلة تأكيد أخرى. ولقد تم ذكر خصائص مستعمرة الإشريكية القولونية على هذا الأغار (الشكل 1). وذكرنا أنه قد جرى نقل جميع العزلات الواردة مجدداً إلى وسط EMB لدى تطبيق المقارنة. والملفت للنظر أن بعض العزلات المعاد زراعتها Subculture
وتنقيتها purification بعد فترة أسابيع من الحفظ في الثلاجة فقدت اللمعة الخضراء المعدنية التي كانت تميزها في الزراعة السابقة البدئية.
2- الطريقة المعتمدة على الخصائص الكيميائية الحيوية Biochemical التفريقية باستخدام منظومة الـ APIE20:
أظهرت النتائج أن 40 عينة فقط من العزلات الـ 50 السابقة المشخصة على أنها إشريكية قولونية باستخدام أغار EMB أعطت نتيجة إيجابية على أنها إشريكية قولونية بالاختبارات الكيميائية المفرقة (الشكل 2)؛ أي بنسبة قدرها 80%. أما العزلات العشرة الأخرى فتفصيلها مذكور في الجدول 3.
3- الطريقة الحيوية الجزيئية (التفاعل السَّلْسَلي للبوليميراز PCR):
لدى استخدام طريقة الـ PCR كان عدد العينات الإيجابية للإشريكية القولونية 44 ونسبتها المئوية 88% نسبة للتشخيص بالاعتماد على شكل المستعمرات على الأغار (الشكل 3) (Bertrand and Roig, 2007). أما العزلات الست السلبية ونتائج مقارنتها مع نتائج الاختبارات التفريقية فذكرت في الجدول 3.
وما تجدر الإشارة إليه هنا أنه لم يكن هنالك رابط بين فقد اللمعة ووجودها وبين سلبية اختبار الـ PCR لـ E. coliوإيجابيته. |
الجدول 2: البادئة المستخدمة لتحري الإشريكية القولونية.
اسم البادئة المستخدمة |
الجين المستهدفة |
درجة حرارة الالتحام Tm |
قياس قطعة الـ DNA المُضخَّمة |
تتالي الأسس
القاعدية للبادئة |
E. coli-AP-R2*
E. coli-AP-F3* |
Alkaline phosphatase
(in E. coli species) |
56 °م |
bp 496 |
aat tcc agc gcc cgt tgt ac
cga tta ccg aac agc tgc tt |
تصميم الدكتور عبد القادر عبادي – دائرة الميكروبيولوجيا والمناعيات – هيئة الطاقة الذرية.
الشكل 1: القسم الأيمن من الطبق المزروع يمثل عينة إشريكية قولونية على وسط الــ EMB ، أما القسم الأيسر فيمثل عينة ليست إشريكية قولونية. أخذت الصورة تحت ضوء الشمس.
الشكل 2: شريط strip من منظومة الـ API 20E يختبر الصفات الكيميائية الحيوية الخاصة بعائلة الإمعائيات، يظهر الشكل التفاعلات الخاصة بالإشريكية القولونية لإحدى العزلات المختبرة.
الشكل 3: صورة عصابات الرحلان على الهلامة لعدد من العينات، يظهر الخطّ 1 الواصمة (المعلّم) marker لشدف دنا DNA fragments معروفة الوزن الجزيئي؛ الأولى من الأسفل ذات وزن 200 يليها نحو الأعلى 400 ثم 600 أساس قاعدي، الخط 2 يمثل شاهداً سلبياً مع البادئ الخاص بالإشريكية القولونية، الخط 3 يمثل الشاهد الإيجابي للـسلالة المرجعية Escherichia coli مع البادئة، الخطوط 4- 5- 6- 7 تمثل عينات إيجابية للإشريكية القولونية مع البادئة الخاصة بها.
|
| المناقشة Discussion |
1- الطريقة المعتمدة على الشكل Form باستخدام وسط الـ EMB: يتم الاعتماد لتشخيص الـ E. coli على أغار EMB: بظهور اللمعة المعدنية والمستعمرات الصغيرة القاتمة. ولكن من المعلوم أن بعض ذراري الأنتروباكتر والكلبسيلة قد تنتج مثل هذه اللمعة بشكل قليل على هذا الأغار. الأمر الذي يفسر أن عزلات من تلك التي يجرى تشخيصها على أنها E. coli لم تكن كذلك؛ وإنما كانت تنتمي إلى جراثيم أخرى. وهذا ما سيتضح لنا لاحقاً.
تعاني المستعمرات النامية على الأوساط الصلبة الصنعية من ظاهرة التلاؤم (التكيف)Adaptation التي تُفقدها بعض الصفات الظاهرة. وربما يفسر هذا اختفاء اللمعة المعدنية لدى إعادة الزرع على وسط الـ EMB؛ وأن بعض المستعمرات بدت أصغر قطراً من الحجم الطبيعي لها على الرغم من كونها تملك الصفات الأخرى كلها الخاصة بالإشريكية القولونية.
وبالتالي هناك زروع إيجابية للإشريكية القولونية بالممارسة العملية قد لا يجري تمييزها لدى الاعتماد المطلق على اللمعة المعدنية؛ وهذا ما قد يفسر اختلاف النتائج مابين الاختبارات الكيميائية والـ PCR.
2- الطريقة المعتمدة على الخصائص الكيميائية الحيوية التفريقية باستخدام منظومة الـ API E20: تتصف الإشريكية القولونية بما يلي: إيجابية الرامنوز rhamnose - تخمير السكروز saccharose يختلف من سلالة لأخرى - سلبية الإينوزيتول inositol - تنتج الإندول indole - كل السلالات سالبة لاختبار فوكس بروسكاور (إنتاج الأسيتوئين) - كل السلالات سلبية اليورياز - سلبية إنتاج H2S - لا تميع الهلام Gelatin - سلبية السيترات وهو ما وافق نتائج البحث (Barbara et al., 2000).
تبين أن العزلات أعطت Klebsiella وأخرى Enterobacter واثنتان Escherichia fergusonii إحداهما الـ (id) لها 70% ولها احتمالان آخران الأول Escherichia coli 1 الـ (id) لها 22.6% والثاني هو Escherichia coli 2 الـ (id) لها 5.3% والباقي (ثلاثة) لم يتعرف عليه في الفهرس المعتمد من قبل الصانع.
ومن المهم ذكره أن بعض العزلات كان لها نوعان متقاربان بالاختبارات الكيميائية:
مثلاً: إحدى العزلات كانت نتيجتها أنتروباكتر على نوعين متقاربين: Enterobacter cloacae الـ (id) لها 71.1% و Enterobacter sakazakii الـ (id) لها 28.2%.
مثال آخر: عزلة أخرى نتيجتها نوعان متقاربان: Klebsiella oxytoca الـ (id) لها 97.7% ولها احتمال أن تكون Raoultella planticola.
إن وجود أكثر من نمط واحد للعزلة الواحـدة
بالاختبارات الكيميائية يوجه نحو صحة نتيجة الـ PCR على أنها إشريكية قولونية فعلاً. أما العزلة الأخيرة فيرجح كونها إشريكية قولونية أيضاً ترجيحاً لنتائج الـ PCR حسب ما سبق من ملاحظات وربما تعدل في الفهارس الكيميائية التي يتم تحديثها كل فترة. الجدول 4.
يعتمد تسجيل النتائج الإيجابية أو السلبية في التفاعلات الكيمياوية الحيوية الـ API، والرؤيةَ البصرية لتبدل اللون في كل تفاعل لوجود مشعر يميز التحول الحاصل؛ وأحياناً يكون تبدل اللون صعب التمييز لكونه بين الحالتين؛ وأحياناً قد تحدث أخطاء خفية في العمل المخبري تؤدي إلى جفاف في بعض الآبار وتبخرها أو حدوث تلوث أو اختلاف في كمية الجراثيم المضافة لكل بئر .. وكل هذا من مصادر الخطأ التي قد تُرتكب في طرق التحريات الكيميائية الحيوية وتؤدي إلى نتائج مبهمة أو كاذبة.
3- الطريقة الحيوية الجزيئية (التفاعل السلسلي للبوليميراز PCR): قد يعود الاختلاف في نتائج الـ API 80% عن نتائج الـ PCR 88%، إلى وجود عزلات غير قابلة للتنميط الكيميائي الدقيق حسب منظومة الـ API (وبالفعل نشرت الشركة الصانعة فهرساً أحدث لقراءة الاختبارات مؤخراً) ويشير هذا إلى أن التعديل بهذه المنظومة مستمر ويراعي وجود عزلات جديدة يكشف عنها باستمرار؛ ويؤكد أيضاً أن الـ PCR الذي كشف عن هذه العزلات غير المنمطة يمكن الاعتماد عليه أكثر في إثبات نوع العزلة المشكوك بها أو نفيها. أما العزلة التي نُمّطت كيميائياً على أنها Escherichia fergusonii 70% فقد كان لها احتمال آخر للـ E. coli.
لقد تطابقت نتائج الـ PCR مع التشخيص بالاعتماد على شكل المستعمرات بنسبة 88% أما الاختلاف فيوضحه الجدول 4.
أي أنه: من أصل 50 عزلة للإشريكية القولونية المعتمدة على أغار EMB: كان 10 عزلات منها غير متوافقة مع الاختبارات الكيميائية الحيوية؛ و 6 عزلات منها توافقت مع الـ PCR وخالفت الكيميائية؛ وبقيت 4 عزلات فقط توافقت مع الاختبارات الكيميائية.
أما عن صعوبة طريقة الـ PCR فهي تتمثل بشكل رئيسي: بتأمين البادئة المناسبة وتحديدها، ضبط شروط التفاعل وكميات مواده وتراكيزها والحفظ المناسب لها.
كانت العينات الست سالبة الاختبار للإشريكية القولونية متطابقة في نتيجتها مع نتائج التفاعلات الكيميائية؛ مع العلم بوجود واحدة منها لم يحدد نمطها.
|
الجدول 3: مقارنة العينات السلبية العشرة مع طريقتي الـ PCR والـ API .
العزلات السلبية بالـ API
وعددها عشر عزلات |
نتيجة العزلات السلبية العشرة
نفسها بتطبيق الـ PCR |
Klebsiella (خالفت الزرع على الأوساط) |
(-) أي أنها ليست إشريكية قولونية فعلاً |
Klebsiella (خالفت الزرع على الأوساط) |
(-) أي أنها ليست إشريكية قولونية فعلاً |
Enterobacter (خالفت الزرع على الأوساط) |
(-) أي أنها ليست إشريكية قولونية فعلاً |
Enterobacter (خالفت الزرع على الأوساط) |
(-) أي أنها ليست إشريكية قولونية فعلاً |
Raoultella (خالفت الزرع على الأوساط) |
(-) أي أنها ليست إشريكية قولونية فعلاً |
غير قابلة للتنميط الكيميائي الحيوي |
(+) أي أنها إشريكية قولونية كما بالأوساط |
غير قابلة للتنميط الكيميائي الحيوي |
(+) أي أنها إشريكية قولونية كما بالأوساط |
غير قابلة للتنميط الكيميائي الحيوي |
(-) أي أنها ليست إشريكية قولونية فعلاً |
Escherichia fergusonii 70% |
(+) أي أنها إشريكية قولونية كما بالأوساط |
Escherichia fergusonii |
(+) أي أنها إشريكية قولونية كما بالأوساط |
الجدول 4: مقارنة نتائج الطريقتين (API و PCR ).
عدد العينات الكلي المشخصة أنهاE. coli
على EMB ونسبتها المئوية |
عدد العينات الإيجابية بتطبيق الـ API ونسبتها المئوية |
عدد العينات الإيجابية بتطبيق الـ PCR ونسبتها المئوية |
50 (100%) |
40 (80%) |
44 (88%) |
|
| مقارنة المواصفات الأساسية للطرق المستخدمة: |
1- جدوى الطرق:
- تعتبر طريقة الـ PCR ذات مصداقية وموثوقية أعلى في التشخيص من الاعتماد على وصف شكل المستعمرات على الأغار، لأنها تعتمد مبدءاً وراثياً يستهدف الأحماض النووية التي تشكل أساس هوية الجرثومة، وهذا ما لا يوجد في الطريقتين الأخريين (Sachse, Frey, 2003، Kuhnert et al; 2000)، حيث أن الجين التي تكشفها الـ PCR قد لا تعبر عن نفسها بالنمط الظاهري Phenotype لسبب ما؛ فيؤدي هذا إلى اختلاف ما في الصفات الشكلية فتصبح مبهمة التشخيص ظاهرياً.
- يليها مجموعة الاختبارات الكيميائية الحيوية التفريقية الـ API (الجدول 5)، التي تعطي دقة في النتيجة أكثر من نتائج الزرع على وسط الـ EMB، حيث أن مستعمرات الإشريكية القولونية قد تشتبه صفاتها أحياناً مع الكليبسيلة والإنتروباكتر بنسبة حوالي 8-10%. ولكن في الوقت نفسه من عيوب الـ API أن أي خطأ في سياق العمل كالحضن أو الرطوبة أو توزيع العينة على أي بئر من آبار الاختبارات قد يؤثر على كامل الاختبار ولا يعطي وثوقية للنتيجة المستحصل عليها. أما صعوبة الـ PCR فهي في بداية التحضيرات فقط كما سبق وأشير.
2- التكلفة:
تماثل طريقة الـ PCR طريقة الـ API من ناحية التكلفة تقريباً (حوالي 12 دولاراً للعينة الواحدة )، أما وسط الـ EMB فهو الأرخص ثمناً، خاصة أنه بالإمكان التحكم بقطر الأطباق وعدد المستعمرات المختبرة tested.
3- الوقت اللازم للإنجاز:
تحتاج طريقة زرع الأوساط 18– 24 ساعة. أما الـ API فيلزم لإتمام اختبارها 50 ساعة (24 ساعة لزراعة المستعمرات على وسط خالٍ من المشعرات، 24 ساعة لاختبارات التفاعلات الكيميائية، نصف ساعة لإضافة الكواشف والبحث عن النتيجة في الفهرس لكل اختبار) أما طريقة الـ PCR فتأخذ وقتاً أطول وتجهيزات أغلى ثمناً طبعاً وشروطاً محددة بمراسِم العمل المخبري يجب توفرها في مكان العمل من حيث ضمان الجودة والعقامة والعاملين والتأهيل. وهي تحتاج 32 ساعة تقريباً (24 ساعة لاستنبات الجرثومة، 4 ساعات لاستخلاص الـ DNA؛ 4 ساعات أخرى لتفاعل الـ PCR والرحلان حتى رؤية النتيجة بالأشعة فوق البنفسجية).
|
| الاستنتاجات Conclusion |
يعطي التشخيص المخبري المنوالي المعتمد على الزرع على أغار EMB فقط نسبة خطأ مقدارها 12%: أي من كل 100 عينة تشخص أنها إشريكية قولونية هناك 12 عينة خاطئة التشخيص. على الرغم من أن الوسط التفريقي الشائع الـ EMB وسط انتقائي تفريقي جيد ويتمتع العاملون المخبريون بخبرة جيدة بالتعامل معه وإن الإشريكية القولونية من أوضح المستعمرات عليه. في حين أنه من المتوقع أن أغار ماكونكي Mac Conkey الشائع الاستعمال أيضاً في مختبراتنا العاملة يحمل في التشخيص احتمال خطأ أكبر من ذلك لأنه يعتمد في تفريق مستعمرات إيجابيات اللاكتوز عن بعضها البعض على اختلافات قطر المستعمرات غالباً ولا يوجد لمعة مميزة هنا للإشريكية القولونية.
والأكثر من ذلك: أن الجراثيم الأخرى الشائعة في العينات المرضية كالإنتروباكتر والكلبسيلة والمتقلبات والعقديات والعنقوديات... من المحتمل أن تكون ذات نسبة خطأ أكبر في التشخيص اليومي؛ فالإشريكية القولونية أسهل، حيث كانت اللمعة المعدنية الخضراء فارقاً أساسياً واضحاً وتساعد في التشخيص وهذا ما يلفت الانتباه إلى إمكان ارتفاع نسبة الخطأ في التشخيص الدارج لجنس الجراثيم بأسلوب الزروع المتبع بالمختبرات ربما إلى الضعفين أو غالباً أكثر؛ ولنا أن نتوقع إذا عمّقنا التشخيص من مستوى تحديد الجنس Genus إلى مستوى تحديد النوع Specie؛ أن الأمر سيكون أصعب واحتمال الخطأ أكبر ويحتاج بالضرورة إلى الرجوع إلى طرق كيميائية حيوية مفرقة نوعية بحسب الاشتباه الحاصل.
تشخيص الإشريكية القولونية بالاعتماد على موثوقية الـ PCR كطريقة مرجعية:
EMB / PCR: نسبة الخطأ قدرها 12% = (6 / 50)؛
EMB / API: نسبة الخطأ قدرها 20% = (10 / 50)؛
API / PCR: نسبة الخطأ قدرها 9 % = (4 / 44).
|
| التوصيات Recommendations |
إن تشخيص جنس الجراثيم باستخدام الـ PCR أمر مكلف كعمل منوالي في بلادنا حالياً؛ بسبب متطلباتها عالية الكلفة، وبالتالي فالحل المقترح والذي يمزج بين التكلفة الأخفض نسبياً للأوساط والمصداقية العالية للـ PCR والـ API مع تجنب عيوب الأخيرة من خطأ التشخيص اللوني والتكلفة العالية هو ما يلي: أن يتم اللجوء إلى بعض التفاعلات الكيميائية الحيوية التفريقية البسيطة والمنتقاة بحسب الالتباس الحاصل؛ والتي يمكن تحضيرها بسهولة محلياً بالرجوع إلى تركيبتها العلمية. ونقترح بعض هذه التفاعلات التي قد تغني عن البقية وأثبتت جدواها تطبيقياً وبحسب الحالة يمكن الانتقاء أحياناً فمثلاً:
- عند وجود لبس مابين الكليبسيلة والإشريكية: اختبار السيترات الذي يكون إيجابياً في الأولى وسلبياً في الثانية.
- للتفريق ما بين الزوائف من جهة وعموم عصيات عائلة الأمعائيات: اختبار الأكسيداز (إيجابي عند الزوائف)؛ أو تخمير الغلوكوز (سلبي عند الزوائف).
- وجود لبس مابين المتقلبات والسالمونيلات: اختبار اليورياز إيجابي عند الأولى (سريع) وسلبي في الثانية وهكذا.
وأخيراً ستظل نسبة الارتياب بتشخيص الجنس موجودة ولكن الهدف في النهاية هو تقليلها إلى الحد الأدنى ما أمكن وفق الإمكانات المتاحة.
نقترح تطبيق الاختبارات الكيميائية الحيوية التالية عند الحاجة إلى تفريق الإشريكية القولونية عن غيرها من الجراثيم عند زراعتها والاشتباه بتشخيصها عياناً.
|
الجدول 5: الاختبارات الكيميائية الأكثر تمييزاً بتفريق الإشريكية القولونية عن الجراثيم الأخرى المشابهة وفقاً للنتائج ومع الرجوع إلى API protocol .
الاختبار الكيماوي الحيوي المفرق |
اختبار السيترات CIT |
نزع الكربوكسيل من الليزين LDC |
الإشريكيةت القولونية E. coli |
(-) |
(+) |
الأنتروباكتر Enterobacter |
(+) |
(-) |
الكليبسيلة Klebsiella |
(+) |
(+) |
|
| كلمة شكر Acknowledgment |
| الشكر لفريق العمل الفني والمخبري في هيئة الطاقة الذرية وأخص التقاني أنس اللحام والباحثين في دائرة الميكروبيولوجيا.
كما أشكر القائمة بالأعمال ميساء الزيات من كلية العلوم لمساعدتها في إجراء الـ API، والمُدرِّسَين الدكتور إياد تنبكجي والدكتور محمد الدبش من المعهد الطبي التقاني بجامعة دمشق لما قدماه من جهد.
|
| المراجع References |
1-Bertrand Romain and Roig Benoit
Evaluation of enrichment-free PCR-based detection on the rfbE gene of Escherichia coli O157- Application to municipal wastewater. 2007.
2-Barbara M. Lund, Tony C; Baired-Parker and Grahame W. Gould.
The microbiological safety and quality of food, 1136-1164, 2000.
3-Crane Misti
Nebraska Company Recalls Beef Linked to Central Ohio E. coli Outbreak. Posted on: Tuesday, 1 July 2008, 12:00 CDT. News, 2008.
4-Ghosh Moushumi, Kaur Sarvnarinder and Ganguli Abhijit.
Inactivation of Escherichia coli O157:H7 by cinnamon extracts in carrot-kinnow mandarin blends, 377-381, 2007.
5-Kuhnert P; Boerlin P. and Frey J.
Target genes for virulence assessment of Escherichia coli isolates from water, food and the environment.
FEMS Microbiol. Rev. 24, 107-117, 2000.
6-Lantz P. G; Abu Al-Soud W; Knutsson R; Hahn-Hagerdal B. and Radstrom P.
Biotechnical use of the polymerase chain reaction for microbiological analysis of biological samples. Biotechnol.
Annu. Rev. 5, 87–130, 2000.
7-Pyatkin K. and Krivoshein YU.
Microbiology, 1980.
8-Roman Benoit Roig.
Evaluation of enrichment-free PCR-based detection on the rfbE gene of Esherichia coli O157-application to municipal wastewater, 2006
9-Sachse Konrad and Frey Joachim
PCR Detection of Microbial Pathogens., 3-4, 2003.
10-Takano Junji
How to Prevent Escherichia coli O157:H7. news, 2008.
|
| |
