بحث في أعداد المجلة
الجملة  
المؤلف   
 

المجلد 6 , العدد 1 , ربيع الثاني 1432 - نيسان (أبريل) 2011
 
دراسة آثار بعض مضادات التأكسد على الليشمانية في سورية
Study the Effects of Some Antioxidants on Leishmania in Syria
د. رولا عسكر*، د. محمود قويدر** و أ.د. محمد معروف*
Roula Askar*, Mahmoud Kweider** and Mohammed Maarrouf*
*كلية الصيدلة، **كلية العلوم - جامعة دمشق
الملخص Abstract
تعد الليشمانية العامل الممرض البشري المسؤول عن طيف من الأمراض التي تدعى بأدواء الليشمانيات، والتي تشكل مشكلة صحية في أجزاء كثيرة من سورية. استقصينا في هذه الدراسة آثار بعض مضادات التأكسد على الليشمانية المدارية، وهي عامل مسبب لليشمانية الجلدية في العالم القديم.
أظهر كل من الريسفيراترول والكركمين والخلاصة الميثانولية للشاي الاخضر فعالية مضادة للمُشَيِّقَات (الأشكال المتحركة) في المختبر، وكانت فعالة ضد اللَيشُمانَات (الأشكال غير المتحركة)، كما اكتشف في مقايسة البلاعم في المختبر. بينما لم يظهر فيتامين C أية فعالية ضد الليشمانية المدارية في المقايسة في المختبر.  
Leishmania is a human pathogen responsible for a spectrum of diseases known as leishmaniases, and a significant health problem in many parts of Syria. In this study, we investigated effects of some Antioxidants on Leishmania Tropica, a causative agent of cutaneous leishmaniasis in the Old World.
Resveratrol, Curcumin and Methanolic extract of Green tea showed antileishmanial activity against promastigotes in vitro, and was effective against amastigotes, as detected in vitro macrophage assay. where as the vitamin C did not show any activity against leishmania tropica in vitro assay.  
المقدمة Introduction 
أدواء الليشمانيات هي مجموعة من الآفات تصيب الجلد والأغشية المخاطية والأحشاء، تسببها طفيليات من شعبة الحيوانات الاوالي Protozoa وجنس الليشمانية Leishmania. تنتقل طفيليات الليشمانية إلى الإنسان بوساطة ذبابة الرمل Sand Fly مسببة الإصابة بداء الليشمانيات الجلدي Cutaneous Leishmaniasis (CL) وداء الليشمانيات الجلدي المخاطي (MCL) Mucocutaneous leishmaniasis وداء الليشمانيات الحشوي Visceral leishaniasis (VL). يتواجد طفيلي الليشمانية بشكلين: مُشَيِّقَة (شكل متحرك) Promastigote وليشمانة (شكل غير متحرك) Amastigote (1، 2).
تعد مركبات الأنتموان الدواء المرجعي للسيطرة على المرض، لكن استخدامها أصبح محدوداً بسبب حدوث مقاومة ونقصان في الفعالية، ولسوء الحظ هنالك القليل من الأدوية المستخدمة كخط علاجي ثان، في حالة فشل المعالجة بالأنتموان، لكن الكلفة العالية ومدة المعالجة الطويلة والآثار الجانبية السامة أنقص من استخدامها (3). تهدف دراستنا إلى تحديد وتطوير مركبات جديدة مضادة لليشمانية، تكون آمنة وجيدة التوافر الحيوي الفموي ومقبولة أصلاً لاستخدامات أخرى.
إن آخر دواء استخدم في المعالجة السريرية هو Miltofosine، وهو مضاد للسرطان وفعال ضد الليشمانية الحشوية (4)، ومن الأدوية التي تملك الكثير من الفعاليات، ومنها الخاصية المضادة للسرطان، مضادات التأكسد، التي تمتاز بشكل عام بفعالية مضادة للأحياء الدقيقة، حيث يمتاز بعضها بفعالية مضادة للجراثيم، وبعضها بفعالية مضادة للفطور، وبعضها بفعالية مضادة للطفيليات الأوالي، وبعضها بفعالية مضادة للفيروسات (5). وبالتالي يمكن أن تمتلك بعض مضادات التأكسد، من الناحية النظرية، فعالية مضادة لداء الليشمانيات، الذي يشكل مشكلة صحية خطيرة في سورية، وهذا ما قادنا إلى دراسة ومقارنة أثر بعض مضادات التأكسد النقية، مثل فيتامين C والكركمين والريسفيراترول، مع أثر نبات معروف بشكل عام بامتلاكه لمجموعة من مضادات التأكسد، وهو نبات الشاي الأخضر، على الأشكال المتحركة وغير المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية في المختبر. هذا وجرى استخدام البنتوستام كدواء مرجعي فعال ضد الليشمانية من أجل مقارنة تأثير المواد السابقة مع تأثيره.  
المواد والطرق Materials and Methods 
1- طفيليات الليشمانية المدارية: عزلت طفيليات الليشمانيا المدارية L.tropica، من شاب من منطقة ريف دمشق بوساطة وسط NNN، وجرى تكثيرها على وسط RPmI-1640، من شركة Cytogen، المضاف له مصل البقر منزوع المتممة بنسبة 10% بدرجة حرارة 26°م، وجرى نقل الطفيليات إلى أوساط سائلة جديدة كل ثلاثة أيام مع الحضن بدرجة حرارة 26°م، للحفاظ على السلالة المستخدمة وتكثيرها أثناء الدراسة، استحصل على الريسفيراترول من شركة (Sigma(Munich، والكركمين من شركة Funakoshi co; ltd (Japan)، حُضّرت خلاصة ميثانولية للشاي الأخضر، فيتامين C من معمل العربية للدواء )سورية( البنتوستامAlbert David (India) .

2- مقايسة عيوشية الخلايا Viability بوساطة عتيدة Cell proliferation kit II
تعتمد المقايسة على انشطار أملاح التترازوليوم XTT ذات اللون الأصفر، نتيجة لاستقلابها من قبل الخلايا الحية، مما يؤدي إلى تشكل صبغة برتقالية اللون Formazon dye، تتناسب شدة لونها طرداً مع عدد الخلايا الحية.

3- دراسة آثار المركبات والخلاصات النباتية على تكاثر الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية في المختبر In vitro
حضرنا 12 مل من وسط 1640-RPMI يحوي كل 1 مل منها 5 × 610 من الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية. استخدمنا صفائح زرع تحوي 12 بئراً من شركة Cell Star، وقمنا بتوزيع الوسط السابق على الآبار بمقدار 975 مكل في كل بئر. استخدمنا البئرين A1 و A2للشاهد، وخصصنا بئرين من الآبار المتبقية لدراسة أثر كل تركيز من التراكيز المختلفة للمادة أو الخلاصة المدروسة، قمنا بإضافة 25 مكل من المحل المستخدم لبئري الشاهد. كما قمنا بإضافة 25 مكرولتر من المواد أو الخلاصات المطلوب اختبار فعاليتها لنحصل على التراكيز النهائية المطلوبة في آبار الزرع. حُضنت صفائح الزرع السابقة، بعد إضافة المواد أو الخلاصات المطلوب اختبار فعاليتها بدرجة حرارة 26°م لمدة 24 ساعة، ثم أجرينا مقايسة عيوشية الخلايا Viability بوساطة عتيدة Cell proliferation kit II لشركة Roche. جرت بعدها قراءة امتصاصية اللون المتشكل بوساطة قارئ إليزا بموجة طولها 450 نانومتر مقابل طول موجة مرجعي 690 نانومتر. جرى حساب النسبة المئوية للعيوشية في كل بئر من آبار الزرع الحاوية على تراكيز مختلفة من الدواء، بالمقارنة مع الشاهد، وتعبرالنتيجة النهائية عن متوسط ثلاث معايرات مختلفة وتعبر نتيجة كل معايرة عن متوسط معايرة البئرين. % للعيوشية = (امتصاصية البئر الحاوي على مضاد التأكسد ÷ امتصاصية البئر الشاهد) × 100

4- اختبار أثر المركبات والخلاصات النباتية على تكاثر الأشكال غير المتحركة ضمن البلاعم
استخدمنا فئران BALB/C، عمرها 6-8 أسابيع، كمصدر للبلاعم، حيث جرى الحصول على البلاعم وفقاً للبروتوكول المذكور في دراسة Danilo C. Miguel (6)، ثم قمنا بعد البلاعم بعدادة نيوباور.
وضعنا ساترة معقمة في كل بئر من الآبار الإثني عشر لعلبة زرع، ثم أضفنا 500 ألف بالعة فأرية في كل بئر من الآبار الإثني عشر لعلبة زرع. ثم قمنا بعد الحضن لمدة ساعتين بالدرجة 37°م وبوجود 5% CO2، بإبانة الطافي وإضافة وسط RPMI-1640، ومن ثم إضافة الأشكال المتحركة المأخوذة من مزرعة في طور الاستتباب بمعدل 5 طفيليات لكل بلعم. ثم حضنا علب الزرع السابقة لمدة 3 ساعات وأزلنا الطفيليات غير الداخلة، ثم أضفنا وسط زرعي جديد وقمنا بالحضن لمدة 24 ساعة، بعد 24 ساعة من الزرع قمنا بإضافة 25 مكرولتر من محاليل المواد أو الخلاصات المطلوب اختبار فعاليتها وأضفنا الحجم نفسه من المذيب المستخدم إلى الآبار الشاهدة وحضنا علب الزرع لمدة 24 ساعة إضافية. قمنا بعد ذلك بأخذ السواتر من كافة آبار الزرع وتلوين الخلايا بملون Giemsa، مما سمح بعد الأشكال غيرالمتحركة داخل البلاعم، حيث قمنا بالعد في 100 بلعم من كل بئر،كما حسبنا الـعيوشية بالمقارنة مع الآبار الشاهدة.  
النتائج Results 
- نتائج اختبار فعالية الريسفيراترول والكركمين والخلاصة الميثانولية للشاي الاخضر وفيتامينC على تكاثر الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية في أوساط الزرع السائلة بالمقارنة مع البنتوستام 
تلخص الجداول 1 و 2 و3 النتائج التي حصلنا عليها. أدت معالجة الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية بالريسفيراترول، بتراكيز 10 و 20 و 40 و 50 مكغ/ مل، إلى تثبيط تكاثرها بنسبة 17.7 و 32.9 و 52.2 و64.9% على الترتيب، في حين أدت معالجتها بتراكيز 100 مكغ/ مل إلى تثبيط تكاثرها بنسبة 83.4%، ولقد أدت معالجتها بتركيز 200 مكغ/ مل إلى قتل كل الأشكال المتحركة. كما أدت المعالجة بتراكيز 150 و 300 و 450 مكغ/ مل من الخلاصة الميثانولية للشاي الأخضر إلى تثبيط تكاثرها بنسبة 17.09 و33.75% و 40.8 على الترتيب، وبتركيز 600 و750 مكغ/ مل إلى تثبيط 48.3 و77.5%، ولقد أدت معالجتها بتركيز 1500 مكغ/ مل إلى قتل كل الأشكال المتحركة. وأدى الكركمين بتراكيز 5 و10 و15 مكرومول إلى تثبيط تكاثرها بنسبة 26.73 و 35 و 54.2% على الترتيب، كما أدت معالجتها بتركيز 20 و 25 مكرومول إلى تثبيط تكاثرها بنسبة 66.97 و 83.4% على الترتيب، ولقد أدت معالجتها بتركيز 30 مكغ/ مل إلى قتل كل الأشكال المتحركة. بينما لم تؤدِ المعالجة بفيتامين C بالتراكيز 12 و 24 و 36 و 48 و 60 و 120 و 480 و 960 مكغ/ مل إلى أية فعالية. جرت المقارنة مع البنتوستام، حيث أدت معالجة الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية، بتراكيز 10 و20 مكغ/ مل، إلى تثبيط تكاثرها بنسبة 31.77 و %44.74 على الترتيب، وبتركيز 30 و 40 مكغ/ مل إلى تثبيط 67.55 و %86.75، في حين أدت معالجتها بتركيز 50 مكغ/ مل إلى تثبيط تكاثرها بنسبة 94.34%. هذا ولقد أدت معالجتها بتركيز 60 مكغ/ مل إلى قتل كل الأشكال المتحركة.
تبين نتائجنا وجود علاقة ارتباط عكسية قوية جداً، معامل الارتباط r>0.9، بين تركيز كل من الريسفيراترول والكركمين والخلاصة الميثانولية للشاي الأخضر وعيوشية الأشكال المتحركة. كما كانت هذه النتائج معتداً بها إحصائياً، حيث بلغت قيمة P= 0.0003 (أصغر من 0.005) بالنسبة للريسفيراترول و 0.0005 بالنسبة للكركمين و 0.009 بالنسبة للخلاصة الميثانولية للشاي الأخضر. وبالتالي فلقد أظهرت دراستنا انخفاضاً يعتد به إحصائياً في عيوشية الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية المعالجة لمدة 24 ساعة بكل من الريسفيراترول والخلاصة الميثانولية للشاي الأخضر والكركمين على حده، بالمقارنة مع الشاهد الذي أضيف له DMSO فقط، وتزايد هذا الانخفاض طرداً مع تزايد تركيز كل منها. وبالتالي يمكن القول أن كلاً من الريسفيراترول والكركمين والخلاصة الميثانولية للشاي الاخضر يثبط تكاثر الأشكال المتحركة لطفيلي الليشمانية المدارية.
وسمح رسم المنحنيات التي تربط بين عيوشية الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية المزروعة على وسط RPMI- 1640 وتراكيز متزايدة من كل من الريسفيراترول والشاي الاخضر والكركمين بالحصول على معادلات المنحنيات (الأشكال 1و 2 و 3)، وبالتالي حساب التركيز IC50، الذي يثبط تكاثر 50% من الأشكال، لكل من الريسفيراترول (43.6 مكغ/ مل)، والكركمين (10.79 مكرومول)، والشاي الأخضر (523.5 مكغ/ مل).  

الجدول 1 : نتائج اختبار معالجة الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية، المزروعة على وسط RPMI-1640 .

تركيزالريسفيراترول
مكغ/ مل

عدد الطفيليات/ مل بعد حضن 24 ساعة

% للعيوشية مقارنة مع الشاهد

المتوسط

SD

المتوسط

SD

0

12.2x106

4.3x105

100

-

10

10x106

2.0x105

82.3

3.37

20

8.2x106

1.7x105

67.1

2.76

40

5.8x106

1.0x105

47.8

1.36

50

4.3x106

7.5x104

35.1

1.22

100

2.1x106

7.4x104

16.6

1.2

200

0

0

0

0


الجدول 2: نتائج اختبار معالجة الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية، المزروعة على وسط RPMI-1640 ، قبل وبعد معالجتها بالكركمين.

تركيز الكركمين
مكرومول

عدد الطفيليات/ مل بعد حضن 24 ساعة

% للعيوشية
مقارنة مع الشاهد

المتوسط

SD

المتوسط

SD

0

12.2x106

4.3x105

100

-

5

8.9x106

2.0x105

73.27

7.87

10

7.8x106

1.7x105

65

2.76

15

5.5x106

1.0x 105

45.80

1.36

20

3.7x106

7.5x104

33.03

1.22

25

2.1x106

7.4x104

16.6

1.2

30

0

0

0

0


الجدول 3: نتائج اختبار معالجة الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية، المزروعة على وسط RPMI-1640 ، قبل وبعد معالجتها بخلاصة الشاي الأخضر الميثانولية.

تركيز خلاصة الشاي

عدد الطفيليات/ مل بعد حضن 24 ساعة

% للعيوشية مقارنة مع الشاهد

المتوسط

SD

المتوسط

SD

0

12.2x106

4.3x105

100

-

150

10.11x106

2.0x105

82.91

1.77

300

8.08x106

1.7x105

66.25

1.25

450

7.22x106

1.0x105

59.2

1.2

600

6.22x106

7.5x104

51.7

0.3

750

2.745x106

7.4x104

22.5

0.7

1500

0

0

0

0



الشكل 1: تناقص عيوشية الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية المزروعة على وسط RPMI-1640 ، بتأثير تراكيز متزايدة من الريسفيراترول.


الشكل 2: تناقص عيوشية الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية المزروعة على وسط RPMI-1640 بتأثير تراكيز متزايدة من الكركمين.


الشكل 3: تناقص عيوشية الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية المزروعة على وسط RPMI-1640 بتأثير تراكيز متزايدة من خلاصة الشاي الأخضر.

الجدول 4: أثر الريسفيراترول على تكاثر الأشكال غير المتحركة للطفيليات في البلاعم البريتوانية الفأرية.


تركيزالريسفيراترول
مكغ/مل

عدد الطفيليات
في 100 بلعم

% لعيوشية الطفيليات داخل البلاعم المعالجة مقارنة مع الشاهد

المتوسط

SD

المتوسط

SD

0

1368

136

100

0

20

1023

86

74.8

6.34

40

615

44

45

3.09

50

478

16

35

1.19

100

349

12

25.53

0.53


الجدول 5: أثر الكركمين على تكاثر الأشكال غير المتحركة للطفيليات في البلاعم البريتوانية الفأرية.

تركيز الكركمين
مكرومول

عدد الطفيليات
في 100 بلعم

% لعيوشية الطفيليات داخل البلاعم المعالجة مقارنة مع الشاهد

المتوسط

SD

المتوسط

SD

0

223

32

100

0

5

176.4

19

79.1

8.6

10

128.7

22

57.7

9.8

15

88.5

26

39.7

11.6

20

56.2

11

25.2

4.94

25

33

3

14.8

1.5

الجدول 6 : أثر خلاصة الشاي الأخضر على تكاثر الأشكال غير المتحركة للطفيليات في البلاعم البريتوانية الفأرية.

تركيز الشاي الأخضر
مكغ/مل

عدد الطفيليات في 100 بلعم

% لعيوشية الطفيليات داخل البلاعم المعالجة مقارنة مع الشاهد

الوسطي

SD

الوسطي

SD

0

1368

136

100

0

150

1112

86

81.3

0.7

300

844

44

61.71

0.52

450

731

16

53.5

2.5

600

424

12

31

1.0

750

273

7

20

2.0



الشكل 4: تناقص عيوشية الأشكال غير المتحركة للطفيليات الموجودة داخل البلاعم البريتوانية الفأرية بعد معالجتها لمدة 24 ساعة بتراكيز متزايدة من الريسفيراترول.


الشكل 5: تناقص عيوشية الأشكال غير المتحركة للطفيليات الموجودة داخل البلاعم البريتوانية الفأرية بعد معالجتها لمدة 24 ساعة بتراكيز متزايدة من الكركمين.



الشكل 6: تناقص عيوشية الأشكال غير المتحركة للطفيليات الموجودة داخل البلاعم البريتوانية الفأرية بعد معالجتها لمدة 24 ساعة بتراكيز متزايدة من خلاصة الشاي الأخضر.



أدت المعالجة بكل مما يلي على حده: بالريسفيراترول بتراكيز 10 و 20 و 40 و 50 و 100 مكغ/ مل، وخلاصة الشاي الأخضر الميثانولية بتراكيز 150 و300 و 450 و 600 و 750مكغ/ مل، والكركمين بتراكيز 5 و 10 و 15 و 20 و 25 مكرومول، إلى تناقص عيوشية الأشكال غير المتحركة داخل البلاعم مقارنة مع الشـاهد الذي أضيـف له DMSO فقط. حيـث
سمحت المعالجة بالتراكيز السابقة من الريسفيراترول إلى تثبيط تكاثر الأشكال غير المتحركة للطفيليات داخل البلاعم بنسبة 2.25 و 55 و 65 و 47.74% على الترتيب (الجدول 4). وبالنسبة للكركمين فقد كانت نسبة التثبيط 20.9 و 42.3 و 60.3 و 74.8 و85.2 % على الترتيب (الجدول 5). أما بالنسبة لخلاصة الشاي كانت نسبة التثبيط 18.7 و 38.28 و46.5 و69 و80% على الترتيب (الجدول 6). ولم يكن للفيتامين C، الذي جرت المعالجة به بكل من التراكيز 12و24 و36 و48 و60 و 120 و 480 و960 مكغ/ مل أية فعالية. جرت المقارنة مع البنتوستام، حيث أدت المعالجة به بتراكيز 10 و 20 و 30 و 40 مكغ/ مل، إلى تثبيط تكاثر الأشكال غير المتحركة للطفيليات داخل البلاعم بنسبة 25.5 و 55 و 65 و %74.47 على الترتيب، كما أدت إلى تناقص عيوشية الأشكال داخل البلاعم مقارنة مع الشاهد الذي أضيف له DMSO فقط. 

أظهرت دراستنا وجود علاقة ارتباط عكسية قوية جداً بين تركيز كل من الريسفيراترول والكركمين وخلاصة الشاي الأخضر الميثانولية، على حده، وعدد الأشكال غير المتحركة داخل البلاعم البريتوانية الفأرية المعالجة بهم، r>0.9، وهذه العلاقة يُعتد بها إحصائياً، لأنً قيم P هي 0.009 للريسفيراترول، وهي أقل من 0.05، وكانت 0.001 للكركمين، و0.001 لخلاصة الشاي الاخضر الميثانولية، تعكس المنحنيات في الأشكال 4، 5، 6 العلاقة السابقة، ولقد سمحت معرفة معادلة كل من هذه المنحنيات، بتحديد تركيز IC50 المثبط لـ 50% من الطفيليات السابقة والذي بلغ بالنسبة للريسفيراترول 43 مكغ/ مل، 12.9 مكرومول بالنسبة للكركمين، والذي بلغ 445 مكغ/ مل بالنسبة للشاي الأخضر. هذا وتوافقت نتائج تعداد الطفيليات المذكورة في الجداول السابقة مع نتائج اختبار العيوشية.

المناقشة Discussion 
تمتاز الأنواع المختلفة لمضادات التأكسد بشكل عام، بفعالية مضادة للأحياء الدقيقة، حيث يمتاز بعضها بفعالية مضادة للجراثيم وبعضها بفعالية مضادة للفطور، وبعضها بفعالية مضادة للطفيليات الأوالي، وبعضها بفعالية مضادة للفيروسات (7). وبالتالي يمكن أن تمتلك بعض مضادات التاكسد، من الناحية النظرية فعالية مضادة لداء الليشمانيات، الذي يشكل مشكلة صحية خطيرة في سورية، وهذا ما قادنا إلى مقارنة أثر بعض مضادات التأكسد النقية، مثل فيتامين C، وفيتامين E، والكركمين، والريسفيراترول، مع أثر نبات معروف بشكل عام بامتلاكه لمجموعة من مضادات التأكسد، وهو نبات الشاي الأخضر، على الأشكال المتحركة وغير المتحركة لطفيليات الليشمانية المدارية. هذا وجرى استخدام البنتوستام كدواء مرجعي فعال ضد الليشمانية من أجل مقارنة أثر المواد السابقة مع أثره.
في الوقت الذي بينت فيه نتائجنا عدم امتلاك الفيتامين C لأية فعالية مضادة لليشمانية المدارية، بينت قدرة الريسفيراترول على قتلها بتركيز 200 مكغ/ مل وقدرة الكركمين على قتل الليشمانية المدارية، بتركيز 13.8 مكغ/ مل (37.6 مكرو مول).
كما بينت نتائجنا تثبيط الريسفيراترول لتكاثر الأشكال المتحركة وغير المتحركة لليشمانية المدارية، حيث بلغت قيمة التركيز IC50، المثبط لخمسين بالمائة من الطفيليات، 43.6 مكغ/ مل بالنسبة للأشكال المتحركة و 43 مكغ/مل، بالنسبة للأشكال غير المتحركة. هذا وكان الريسفيراترول أقل فعالية من فعالية البنتوستام، الذي بلغت قيمة التركيز IC50 المثبط لخمسين بالمائة من الطفيليات، 21 مكغ/ مل بالنسبة للأشكال المتحركة، و 26.34 مكغ/ مل بالنسبة للأشكال غير المتحركة. توافقت نتيجتنا مع النتيجة المنشورة عام 2007 عن أثر الريسفيراترول المثبط لنمو الأشكال المتحركة لطفيليات الليشمانية الكبرى، حيث بلغ تركيز IC50 45 مكغ/ مل )8)، وكانت الليشمانية المدارية أكتر حساسية من الليشمانية الكبرى. في الحقيقة لم يكن هذا الأثر المضاد لليشمانية مستغرباً، حيث بينت الدراسات امتلاك الريسفيراترول، وهو فيتولاكسين طبيعي يتواجد في العنب والنبيذ الأحمر (9)، لخاصية مضادة للسرطان، ومضادة للتأكسد (10)، ومضادة الفطور (11)، والفيروسات (12)، ولفعالية مضادة المثقبيات البروسية (13).
كما أظهرت نتائجنا أن الكركمين يثبط الأشكال المتحركة وغير المتحركة لليشمانية المدراية، حيث بلغت قيمة التركيز IC50 3.97 مكغ/ مل للأشكال المتحركة، و4.75 مكغ/ مل للأشكال غير المتحركة. وبالتالي فقد كان الكركمين أكثر فعالية من البنتوستام. توافقت نتيجتنا مع النتيجة المنشورة عن التأثير القاتل للكركمين لطفيليات الليشمانية الكبرى، وكانت الليشمانية المدارية أكثر حساسية من الليشمانية الكبرى، حيث بلغت قيمة التركيز IC50 بالنسبة للأشكال المتحركة للطفيليات 13.8مكغ/ مل (14). هذا وتشير الدراسات المنشورة إلى فعالية الكركمين المضادة للجراثيم (15)، والفيروسات (16)، والفطور (17)، والملاريا (18)، وإلى فعاليته المضادة للسرطان عند خلايا الثدييات نتيجة لقدرته على وقف دورة الخلية (19)، وعلى تثبيط اصطناع الدنا DNA (20)، وتثبيط البروتين كيناز C (21)، وإنزيم EGF-receptor tyrosine kinase (22). هذا ويمتلك الكركمين أيضاً فعالية مضادة للجينات الورمية عند الحيوان، حيث يكبح السرطان عبر كبت نقل الإشارة في الخلايا الهدف(23) . وبالتالي يمكن أن تشكل الفعاليات السابقة جزءاً من آلية تأثير الكركمين المضادة لليشمانية الكبرى.
يمتاز كل من الريسفيراترول والكركمين بكونهما من البولي فينولات، في حين لا يمتلك كل من الفيتامين C والفيتامين E بنية البولي فينولات، مما يسلط الضوء على تأثير البولي فينولات المضاد لليشمانية بشكل عام، وهذا ما قادنا لاختيار بعض النباتات التي تمتلك هذه البولي فينولات لدراسة أثرها على تكاثر طفيليات الليشمانية، حيث قمنا بناء على ما سبق بدراسة أثر نبات الشاي الأخضر.
بالنسبة لنبات الشاي الأخضر، فقد أظهرت نتائجنا فعالية الخلاصة الميثانولية للشاي الأخضر في تثبيط الأشكال المتحركة وغير المتحركة لليشمانية المدارية، حيث بلغت قيمة IC50 523 مكغ/ مل للأشكال المتحركة و 445 مكغ/ مل للأشكال غير المتحركة. وبالتالي فقد توافقت نتيجتنا مع النتيجة المنشورة عن تأثير المثبط للخلاصة الميثانولية للشاي الاخضر للأشكال المتحركة لطفيليات اليشمانية الكبرى، وكانت طفيليات الليشمانية المدارية أقل حساسية من طفيليات الليشمانية الكبرى (24). تعد البولي فينولات والكافيين من أهم مكونات نبات الشاي الأخضر، حيث تحتوي الخلاصة الجافة للنبات على 80% فينولات و 5-20% كافيين. تتألف بولي فينولات الشاي الأخضر من الكاتشينات، التي تشكل 55% منها (25)، وتشمل الكاتشين والإيبي كاتشين والإيبي كاتشين غالات والإيبي غالوكاتشين والإيبي غالو كاتشين غالات، الذي يشكل نصف الكاتشينات الموجودة بالشاي، والفلافونويدات التي تشكل 25% من البولي فينولات، وتضم الكامفيرول والميريسيبتين والكيرسيتين (26). وبالتالي تعد الكاتشينات والكامفيرول والكيرسيتين والميرسيبتين، وفقاً لنسبتهم، أهم المواد الفعالة الموجودة في خلاصة الشاي الأخضر. في حين يمتاز الإيبي غالوكاتشين غالات بكونه مضاداً للملاريا (27)، تمتاز الكاتشينات بفعالية مضادة للجراثيم (5)، ومضادة للفيروسات (28)، حيث تعتمد آلية عمل الكاتشينات على تثبيطها لإنزيم ODC الإنزيم المفتاحي في سلسلة اصطناع مركبات البولي أمين (29). هذا وبينت الدراسات أيضاً فعالية كاتشينات الشاي المضادة للمثقبيات الكروزية (30)، وفعالية الغالوكاتشين غالات والإيبي غالو كاتشين غالات المضادة لليشمانية الدونوفانية، حيث بلغ تركيزهما IC50 8.9 ملغ/ مل و 19.1 ملغ/ مل على الترتيب. وبالتالي يمكن أن يعود أثر الخلاصة الميثانولية للشاي الأخضر المثبطة لليشمانية المدارية لاحتوائها على الكاتشينات. أما بالنسبة للكيرسيتين فإنه يحرض الاستموات عند المثقبيات البروسية الغامبية Trypanosma brucei gambiense(31)، كما يثبط الكيرسيتين التوكسوبلاسما (32). يثبط الكيريستين نمو الأشكال المتحركة لليشمانية الدونوفانية، يبلغ التركيز IC50 45.5 ملغ/ مل، ويؤثر على استقلاب الحديد وإنزيم الريدونيكليوتيد ريدوكتاز (33)، وإنزيم topisomerase II، ويوقف دورة الخلية بالطور G0/G1، مما يؤدي للاستموات (34). أما بالنسبة للكامفيرول فيمتاز بفعالية مضادة لليشمانية الدونوفانية حيث يبلغ التركيز IC50 2.9 مكغ/ مل، وبفعالية مضادة للمثقبيات البروسية حيث يبلغ التركيز IC50 9.2 مكغ/ مل (31). كما يمتاز الكامفيرول بتأثيره المضاد لطفيليات الليشمانية الأمازونية (35)، والمثقبيات الكروزية Trypanozoma crusi (35). هذا ويمتلك الكافيئين أيضاً فعالية مضادة لليشمانيا الدونوفانية، حيث يبلغ التركيز IC50 12.9 مكغ/ مل (31)، وفعالية مضادة للمثقبيات البروسية الروديسية Trypanosoma brucie rhodesiense حيث يبلغ التركيز IC50 1.2 مكغ/ مل (31). أما بالنسبة للميريسيبتين فيمتلك أيضاً فعالية مضادة لليشمانية الدونوفانية حيث يبلغ التركيز IC50 5.9 مكغ/ مل، وفعالية مضادة للمثقبيات البروسية حيث يبلغ التركيز IC50 15.9 مكغ/ مل (31). وبالتالي يمكن أن يعود تأثير الخلاصة الميثانولية للشاي الأخضر على طفليليات الليشمانية إلى تأثير محتوى الخلاصة وبشكل خاص قلويدات الكافيين والطنين (الكاتشين) والفلافونويدات.
يتبين مما سبق أن أثر الشاي الأخضر على طفيليات الليشمانية يمكن أن ينتج عن تضافر أثر مجموعة المكونات الفعالة المشكلة لهذا النبات، وبالتالي يمكن أن يساهم كشف المكونات الفعالة وعزلها وتنقيتها بالحصول على أدوية جديدة مضادة لليشمانية. وبالتالي وبناء على نتائجنا يمكننا القول بأن الأثر المضاد لليشمانية لمضادات التأكسد السابقة لا يعود بشكل رئيسي إلى خصائصها المضادة للتأكسد، وإنما يعود لامتلاكها لآليات تأثير أخرى تكسبها الأثر على طفيليات الليشمانية.  
المراجع Referenses 
1-DejeuP.
Leishmaniasis:current situation and new perspectives.
Comp. immunal. microbial. infect. dis, 27(5): 18-305, 2004.

2-Kellina O.I.
On the dimensions of the leishmanial forms of L.major L.tropica and L.tropica minor.
medskaya. Parasitol, 3(1): 18-716, 1962.

3-Davis AJ. and Kedzierski L.
Recent advances in antileishmanil drug development.
Curr Opin Investig Drugs, 6: 163-169, 2005.

4-Jha TK; Sunder S; Thakur CP; Bachmann P; Karbwang J; Fischer C; Voss A. and Berman J.
Miltofosine, an oral agent for the treatment of Indian visceral Leishmaniasis.
N Engl J Med, 341:1795-1800, 1999.

5-Buzzini Pietro, Arapitsas Panagiotis, Goretti Marta, Branda Eva, Turchetti Benedetta, Pinelli Patrizia, Ieri F. and Romani
Annalisa
Antimicrobial and Antiviral Activity of Hydrolysable Tannins

8, 1179-1187, 2008.

6-Danilo C; Miguel Jenicer K.U; Yokoyama-Yasunakal, Walter K. Andreoli, Silvia R.B.Uliana and
Renato A. Mortara
Tamoxifen is Effective against Leishmania and induces a rapid alkalinzation of parasitolophorous vacuoles harbouring Leishmania
(Leishmania) amazonensis amastigotes.
Journal of antimicrobial chemotherapay, 10 (4): 1-9, 2007.

7-Korkina L.G.
Phenylpropanoids as naturally occurring antioxidants: from plant defense to human health.
Cellular and Molecular Biology, 53, 15-25, 2007.

8- Lukasz Kedzierski, Joan M. Curtis, Milena Kaminska, Jadwiga Jodynis-Liebert and Marek Murias
In vitro antileishmanial activity of resveratrol and its hydroxylated analogues against Leishmania major promastigotes and
amastigotes.
Parasitol Res, 102: 91-97, 2007.

9-Siemann EH. and Creasy LL.
Concentration of the phytoalexin resveratrol in wine.
Am J Enol Vitic, 43:49-52, 1992.

10- Baur JA. and Sinclair DA.
Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo evidence.
Nat Rev Drug Discove, 5: 493-506, 2006. Molecular Biology, 53, 15-25, 2007.

11-Leiro J; Cano E; Ubeira FM; Orallo F. and Sanmartin ML.
In vitro effects of resveratrol on the viability and infectivity of the microsporidian Encephalitozoon cuniculi.
Antimicrob Agents Chemother, 48: 2497-2501, 2004.

12-Docherty JJ; Fu MM; Stiffler BS; Limperos RJ; Pokabla CM. and
DeLucia AL.
Resveratrol inhibition of herpes simplex virus replication.
Antivir Res, 43:145-155, 1999.

13-Ferry-Dumazet H; Garnier O; Mamani-Matsuda M; Vercauteren J; Belloc F; Billiard C; Dupouy M; Thiolat D; Kolb J.P; Marit G; Reiffers J. and Mossalayi M.D.
Resveratrol inhibits the growth and induces the apoptosis of both normal and leukemic hematopoietic cells.
Carcinogenesis, 23, 1327-1333, 2002.

14- Tatsuo Koide, Mitsuhiko Nose, Yuiko Ogihara, Yoshisada Yabu and Nobuo Ohta
Leishmaniacidal Effect of Curcumin in Vitro.
Biol. Pharm. 25(1): 131-133, 2002.

15-Saeed Tajbakhsh, Khosro Mohammadi, Iman Deilami, Keivan Zandi, Moradali Fouladvand, Elissa Ramedani and Golandam Asayesh
Antibacterial activity of indium curcumin and indium diacetylcurcumin.
Academic Journals, 7(21): 3832-3835, 2008. 16-Singh RK; Rai D; Yadav D; Bhargava A; Balzarini J; De Clercq E; Singh RK; Rai D; Yadav D; Bhargava A; Balzarini J. and De Clercq E.
Eur J Med Chem. 45(3): 1078-86, 2010.

17-Martins C.V.B; daSilvia D.l; Neres A.T.M; Magalhaes T.F.F; Watanabe G.A; Modolo L.V; Sabino A.A; de Fatima A. and de Resende M.A.
Curcumin as a promising antifungal of clinical interest.
Journal of antimicropilal chemotherapy, 63, 337-339, 2008.

18-Reddy R.C; Vathsala P.G; Keshamouni V.G; Padmanaban G. and Rangarajan P.N.
Curcumin for malaria therapy.
Biochem. Biophys. Res. Commun, 326: 472-474, 2005.

19-Mukhopadhyay A; Basu N; Ghatak N. and Gujral P.K.
Agents Actions, Synthesis of some symmetrical curcumin derivatives and their antiinflammatory activity.
12, 508-515, 1982.

20-Huang M.T; Deschner E.E; Newmark H.L; Wang Z.Y; Ferraro T.A; Conney A.H. and Cancer Lett.
Effect of dietary curcumin and ascorbyl palmitate on azoxymethanol-induced colonic epithelial cell proliferation and focal areas of dysplasia.
64, 117-121, 1992. 21-Huang M.T; Smart R.C; Wong Q.C. and Conney A.H.
Leishmanicidal effect of curcumin in vitro.
Cancer Res; 48, 5941-5946, 1988.

22-Chen H.W; Huang H.C. and Br J.
Effect of curcumin on cell cycle progression and apoptosis in vascular smooth muscle cells Pharmacol.
124, 1029-1040, 1998.

23-Korutla L. and Kumar R.
Curcumin, an antioxidant and anti-tumor promoter, induces apoptosis in human leukemia cells.
Biochim. Biophys. Acta, 1224, 597-600, 1994.

24-Mehdi Sharif, Hajar Ziaei, Mohammad Azadbakht, Ahmad Daryani, Akbar Ebadattalab and Masoumeh Rostami
Effect of Methanolic Extracts of Artemisia aucheri and Camellia sinensis on Leishmania major (In Vitro).
Turk J Med Sci, 36 (6): 365-369, 2006.

25-Murray F. 100 super supplements for a longer life, Los Angeles: CA McGraw-Hill Professional, 5:181-182, 2000.

26-Committee on Diet, Nutrition, and Cancer, Assembly of Life Sciences, National Research Council, Diet, nutrition, and cancer, Washington: D.C National Academies Press, 1982: 286. 27-Tanushree Banerjeea, Shailendra Kumar Sharmab, Namita Suroliac and Avadhesha Surolia
Epigallocatechin gallate is a slow-tight binding inhibitor of enoyl-ACP reductase from Plasmodium falciparum
Biochemical and Biophysical Research Communications, 377(4): 1238-1242, 2008.

28-Gargi Sen, Sibabrata Mukhopadhyay, Manju Ray and Tuli Biswas
Quercetin interferes with iron metabolism in Leishmania donovani and targets ribonucleotide reductase to exert leishmanicidal activity.
JAC, 61, 1066-1075, 2005.

29-Facchini A; Zannella B. and Stefanelli C.
Effect of Green tea extract on the induction of ornithine decarpoylase and the activation of extracellular signal-regulated Kinase in Bladder carcinoma ECV304 cells.
Nute Cancer, 47, 104-110, 2003.

30-Paveto C; Güida M.C; Esteva M.I; Martino V; Coussio J; Flawi? M.M. and Torres H.N.
Anti-Trypanosoma cruzi activity of green tea (Camellia sinensis) catechins.
Antimicrob. Agents Chemother, 48, 69-74, 2004.

31-Deniz Tasdemir, Marcel Kaiser, Reto Brun, Vanessa Yardley, Thomas J. Schmidt, Fatma Tosun, and Peter Rüedi
Antitrypanosomal and Antileishmanial Activities of Flavonoids and Their Analogues: In Vitro, In Vivo, Structure-Activity Relationship, and Quantitative Structure-Activity Relationship Studies.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50, 1352-1364, 2006.

32-Weiss LM; Ma YF; Takvorian PM; Tanowitz HB. and Wittner M.
Brdyzoite development in toxoplasma gondii and the hsp 70 stress response.
In fect Immun, 66(7): 3295-3302, 1998.

33-Gargi Sen, Sibabrata Mukhopadhyay, Manju Ray and Tuli Biswas
Quercetin interferes with iron metabolism in Leishmania donovani and targets ribonucleotide reductase to exert leishmanicidal activity.
JAC, 61, 1066-1075, 2005.

34-Mittra B; Saha A; Chowdhury AR; Pal C; Mandal S; Mukhopadhyay S. and Majumder HK.
Luteolin, an abundant dietary component is a potent anti leishmanial agent that acts by inducing topisomerase II-mediated Kinetoplast DNA cleavage leading to apoptosis. Mol Med, 6(6): 527-541, 2000.

35-Elisandra Cristina Schinor, Marcos José Salvador, Elisabeth Mieko Furusho Pral, Silvia Celina Alfieri, Sérgio Albuquerque and Diones Aparecida Dias
Effect of extracts and isolated compounds from Chresta scapigera on viability of Leishmania amazonensis and Trypanosoma cruzi.
Rev. Bras. Cienc. Farm, 43(2): 235-239, 2007.  
 
المجلد 6 , العدد 1 , ربيع الثاني 1432 - نيسان (أبريل) 2011

 
 
SCLA