| الملخص Abstract |
تسبب يرقة المشوكة الحبيبية عند الإنسان داء الكيسة العدارية لدى البشر. وينتج الإجهاد التأكسدي من دفاعات خلايا الجهاز المناعي تجاه الطفيلي. وبهذه الآلية، فإن عدداً من الجزيئات المؤكسِدة كالجذور الحرة، تؤثر في الغشاء الخلوي، مؤديةً إلى أكسدة فائقة للشحوم ومشكلة مالونديالدهيد MDA (واصم هام للشدة التأكسدية). ويلعب غلوتاثيون GSH دوراً كمضاد للأكسدة ويتفاعل مع الجذور الحرة.
هدف هذه الدراسة مقايسة مستويات الغلوتاثيون والمالونديالدهيد في بلازما المرضى المصابين بالكيسة العدارية، وذلك لاستقصاء وقوع الإجهاد التأكسدي لديهم.
شملت دراستنا 101 مريضاً مصاباً بالكيسة العدارية، و 35 شخصاً سليماً كانت نتيجة اختبار التراص الدموي اللامباشر لديهم سلبية (المجموعة الشاهدة). جرت مقايسة الغلوتاثيون بالطريقة اللونية الحركية، وقيست مستويات المالونديالدهيد بالطريقة اللونية. لاحظنا زيادة مستويات المالونديالدهيد وانخفاضاً في مستويات غلوتاثيون لدى المرضى المصابين بالكيسة العدارية مقارنة مع المجموعة الشاهدة. وتشير هذه النتائج إلى وقوع الإجهاد التأكسدي لدى المرضى. لاحظنا أيضاً علاقة عكسية بين مستويات الغلوتاثيون والمالونديالدهيد لدى مجموعة المرضى، أي ترابطاً بين الإجهاد التأكسدي وتراجع الغلوتاثيون في الخلايا.
|
The larva of Echinococcus granulosus causes hydatid cyst in human. The oxidative stress results by defends of immune system cells against parasites. In this mechanism, various oxidant molecules as free radicals, affects the cell membrane, resulting lipid peroxidation and forming of malondialdhyde (MDA) (marker of the oxidative stress). Glutathione (GSH) plays role as antioxidant and reacts with free radicals.
The aim of this study is to assay the levels of glutathione (GSH) and malondialdhyde (MDA) in the plasma of patients diagnosed with hydatid cyst, to investigate the incidence of oxidative stress.
Our study group comprised 101 patients, who diagnosed with hydatid cyst, 35 healthy subjects who were negative for hydatid cyst by indirect hemaggltination (control group). The GSH levels was assayed by kinetics colorimetric method, and the MDA levels was assayed by colorimetric method. We observed an increase in the MDA levels and decrease in the GSH levels in patients with hydatid cyst compared with control group. This results mean the the incidence of the oxidative stress in patients. Also, we observed a reverse correlation between GSH levels and MDA levels in patients group, this means correlation between the oxidative stress and retraction of GSH in the cells.
|
| المقدمة Introduction |
ينتشر داء الكيسة العدارية في الكثير من دول العالم وخاصة في بلدان حوض المتوسط ومنها سورية، حيث يعد من المشاكل الصحية المتوطنة endemic في المجتمعات الريفية (1، 2).
سبب هذا الداء هو يرقة المشوكة الحبيبية Echinococcus granulosus، وقد يكون الإنسان واحداً من الأثوياء الوسط، حيث تقيم مستعمراتها الممرضة في مختلف أنحاء الجسم وخاصة الكبد والرئة مشكلاً بنية كيسية مملوءة بسائل (3).
ينجم الإجهاد التأكسدي عن دفاعات خلايا الجهاز المناعي تجاه الطفيلي، حيث تعمل السيتوكينات المتحررة من الخلايا T المساعدة 1 T helper) 1) على أجلاب الخلايا البلعمية إلى منطقة العدوى، ويؤدي تفعيل البلاعم المتجمعة حول الكيسة إلى إنتاج الأنواع الأكسجينية التفاعلية والأنواع النتروجينية التفاعلية بشكل جذور حرة، تمتلك فعالية مضادة للكيسة العدارية ولها أثر ضار على عيوشية الطفيلي (4، 5). كذلك يمكن لهذه الأنواع الأكسجينية التفاعلية أن تهاجم أهدافاً داخل خلوية كالبروتينات، الدنا، والشحوم، مؤدية إلى حدوث خلل في وظيفة الخلايا المجاورة للكيسة (6، 7). تهاجم الأنواع الأكسجينية التفاعلية أغشية الخلايا مؤديةً إلى حدوث تفاعلات الأكسدة الفائقة للشحوم ويتشكل مالونديالدهيد، الذي يسبب أواصر متصالبة Cross-links وبلمرة لمكونات الغشاء الخلوي، محدثة بذلك تبدلات بنيوية وتخرباً للأغشية الحيوية (7). يعد المالونديالدهيد واصماً هاماً لتطور الأكسدة الفائقة للشحوم والإجهاد التأكسدي وإلى جانب ذلك تشير الدراسات إلى أن المالونديالدهيد والجذور الحرة يتدخل أيضاً في إحداث السرطان (8، 9).
بالمقابل تحتوي الخلايا والأنسجة جميعها على نظام دفاعي لإزالة سمية الأنواع الأكسجينية التفاعلية لحماية الخلية أو الحد من أذيتها، وأهمها الغلوتاثيون وهو ثلاثي ببتيد ذو بنية فريدة مكونة من ثلاثة أحماض أمينية هي الغلوتامات والسيستئين والغليسين، ويلعب دوراً كمضاد للأكسدة بتفاعله مع الجذور الحرة (10-12).
|
| المواد والطرق Materials and methods |
جرت الدراسة على 136 شخصاً وزعوا كالتالي: مجموعة شاهدة شملت 35 متطوعاً (17 ذكراً و18 أنثى)، من الأصحاء ظاهرياً، كانت نتيجة اختبار التراص الدموي اللامباشر لديهم سلبية، متوسط أعمارهم 40±12 عاماً، غير مصابين بالداء السكري وغير مدخنين ولا يتعاطون الكحول ولا يتناولون أية أدوية هرمونية. ومجموعة مرضى الكيسة العدارية وشملت 101 مريضاً مشخصاً شعاعياً ومخبرياً (أجري لهم اختبار التراص الدموي اللامباشر)، (40 ذكراً و61 أنثى)، متوسط أعمارهم 42±13 عاماً، غير مصابين بالداء السكري وغير مدخنين ولا يتعاطون الكحول ولا يتناولون أية أدوية هرمونية، قُسمت هذه المجموعة إلى زمرتين بحسب توضع الكيسة العدارية: زمرة مرضى الكيسة العدارية الكبدية (82 مريضاً). وزمرة مرضى الكيسة العدارية الرئوية (19 مريضاً).
جرى جمع العينات اللازمة لهذه الدراسة من مراجعي مستشفى الأسد الجامعي والمواساة وذلك قبل إجراء التداخل الجراحي، في الفترة الواقعة بين شهر آذار من عام 2009 وحزيران من عام 2010.
لإجراء مقايسة الغلوتاتيون والمالونديالدهيد، جرى سحب 5 مل من الدم على أنبوب يحوي هيبارينات الليثيوم في فترة الصباح بعد صيام حوالي 12 ساعة، نُبذت العينات وفصلت البلازما وحفظت في أنابيب Eppendorf بدرجة حرارة -70مْ إلى حين إجراء المقايسة.
لإجراء مقايسة أضداد الكيسة العدارية في المصل، جرى سحب 5 مل من الدم على أنبوب جاف لكل شخص في مجموعة الشاهد، نُبذت العينات وفُصل المصل وحفظت في أنابيب Eppendorf بدرجة حرارة -20مْ إلى حين إجراء الاختبار. جرت مقايسة غلوتاثيون بالطريقة اللونية الحركية وفق تعليمات عتيدة Northwest لمقايسة الغلوتاثيون باستخدام قارئ صفيحة Microplate reader في مركز نقل الدم، جامعة دمشق. حيث يعتمد مبدأ المقايسة على تفاعل كاشف أيلمان (DTNB) 5-5'-dithiobis [2-nitrobenzoic acid] مع الغلوتاتيون فيتشكل مركب ملون (TNB) 5-thionitrobenzoic acid والذي يكون امتصاصه بموجة طولها 412 نانومتر ومركب آخر هو GS-TNB. فيما بعد يجري ارجاع الـ GS-TNB بواسطة غلوتاثيون ريدوكتاز ونيكوتيناميد أدنين ثنائي نكليوتيد فسفات ((NADPH لتتحرر جزيئة ثانية من الـ TNB ويعاد تشكل غلوتاثيون. وبذلك يجري اختزال الغلوتاتيون المؤكسد (GSSG) الموجود مسبقاً في مزيج التفاعل أو المتشكل من تفاعل الغلوتاثيون مع GS-TNB بسرعة إلى الغلوتاتيون (الشكل 1).
جرت مقايسة المالونديالدهيد لونياً وفق تعليمات عتيدة Northwest لمقايسة المالونديالدهيد باستخدام جهاز مقياس الطيف الضوئي Spectrophotometer. حيث يعتمد مبدأ المقايسة على تفاعل المالونديالدهيد MDA مع حمض الثيوباربيتوريك Thiobarbitoric acid (TBA) فيتشكل معقد MDA-TBA2 ملون يقاس امتصاصه بموجة طولها 532 نانومتر (الشكل 2).
أجريت مقايسة أضداد الكيسة العدارية للمجموعة الشاهدة بتطبيق اختبار التراص الدموي اللامباشر في مختبر مستشفى المواساة ووفق تعليمات عتيدة شركة Fumouze الفرنسية. حيث يعتمد المبدأ على اتحاد الأضداد المصلية للمشوكة الحبيبية (في حال وجودها) مع المستضدات الموافقة لها والموجودة على الكريات الحمر المحسسة (كريات حمر مأخوذة من الخروف ومغلفة بمستضدات المشوكة الحبيبية)، ويؤدي هذا إلى تراص هذه الكريات مشكلة طبقة رقيقة بلون بني محمر في قعر البئر، أما إذا لم تحتو عينة المصل على الأضداد النوعية فإن الكريات الحمر المحسسة تترسب مشكلة زراً أو حلقة في قعر البئر.
أجريت الدراسة الإحصائية باستخدام برنامجي Excel 2007 و SPSS 19 لمعالجة البيانات وتحليلها ورسم الخطوط البيانية. وجرى التعبير عن مختلف القيم بحساب المتوسط الحسابي والانحراف المعياري. كما اعتمد اختبار ستيودنت Student (T-test) لتحديد كون الفارق بين المتوسطات ناجماً عن المصادفة أم حقيقياً. اعتمد معامل Person لدراسة علاقات الارتباط بين متثابتات المجموعة الواحدة. اعتمدت القيمة p<0.05 لتحديد الأهمية الإحصائية.
|
الشكل 1: مبدأ مقايسة الغلوتاثيون.
الشكل 2: مبدأ مقايسة المالونديالدهيد.
|
| النتائج Results |
1- تعيين قيم الغلوتاثيون لدى مجموعات الدراسة: كانت مستويات الغلوتاثيون لدى
لمجموعة الشاهدة 23.71±6.3 مكرومول/ لتر، ولدى مجموعة مرضى الكيسة العدارية 12.08±2.81 مكرومول/ لتر. وعند تقسيم هذه المجموعة إلى زمرتين بحسب توضع الكيسة، كانت مستويات غلوتاثيون زمرة مرضى الكيسة العدارية الكبدية 11.96±2.69 مكرومول/ لتر. ولدى زمرة مرضى الكيسة العدارية الرئوية 13.03±3.31 مكرومول/ لتر.
أظهرت دراستنا وجود فارق يعتد به إحصائياً (p<0.05) بين كل من: متوسط مستويات غلوتاثيون GSH لدى مجموعة مرضى الكيسة العدارية ومتوسط مستويات الغلوتاثيون لدى المجموعة الشاهدة (الشكل 3). وبين متوسط مستويات الغلوتاثيون لدى زمرة مرضى الكيسة العدارية الكبدية ومتوسط مستويات الغلوتاثيون لدى المجموعة الشاهدة (الشكل 4)، وأيضاً بين متوسط مستويات الغلوتاثيون لدى زمرة مرضى الكيسة العدارية الرئوية ومتوسط مستويات الغلوتاثيون لدى المجموعة الشاهدة (الشكل 4).
2- تعيين قيم المالونديالدهيد لدى مجموعات الدراسة
كانت مستويات المالونديالدهيد لدى المجموعة الشاهدة 24.64±5.29 مكرومول/ لتر، وكانت مستويات المالونديالدهيد لدى مجموعة مرضى الكيسة العدارية 67.94±8.14 مكرومول/ لتر (الشكل 5). وعند تقسيم هذه المجموعة إلى زمرتين، بحسب توضع الكيسة، كانت مستويات المالونديالدهيد لدى زمرة مرضى الكيسة العدارية الكبدية 68.46±7.75 مكرومول/ لتر. ولدى زمرة مرضى الكيسة العدارية الرئوية 63.7±9.57 مكرومول/ لتر.
أظهرت دراستنا وجود فارق يعتد به إحصائياً (p<0.05) بين متوسط مستويات المالونديالدهيد MDA لدى مجموعة مرضى الكيسـة العدارية ومتوسط مستويات المالونديالدهيد لدى المجموعة الشاهدة (الشكل 5). وبين متوسط مستويات المالونديالدهيد لدى زمرة مرضى الكيسة العدارية
الكبدية ومتوسط مستويات مالونديالدهيد لدى المجموعة الشاهدة (الشكل 6)، وأيضاً بين متوسط مستويات المالونديالدهيد لدى زمرة مرضى الكيسة العدارية الرئوية ومتوسط مستويات المالونديالدهيد لدى المجموعة الشاهدة (الشكل 6).
3- علاقة الارتباط بين GSH و MDA لدى مجموعة مرضى الكيسة العدارية
قمنا بدراسة العلاقة بين مستويات الغلوتاثيون والمالونديالدهيد لدى مجموعة مرضى الكيسة العدارية فتبين أن هنالك علاقة ارتباط عكسية يعتد بها إحصائياً (p<0.05؛ r = - 0.49) (الشكل 7).
|
الشكل 3 : مقارنة مستويات GSH بين المجموعة الشاهدة ومجموعة مرضى الكيسة العدارية.
الشكل 4: مقارنة مستويات GSH بين المجموعة الشاهدة وزمر مرضى الكيسة العدارية.
الشكل 5 : مقارنة مستويات MDA بين المجموعة الشاهدة ومجموعة مرضى الكيسة العدارية.
الشكل 6 : مقارنة مستويات MDA بين المجموعة الشاهدة وزمر مرضى الكيسة العدارية.
الشكل 7 : الارتباط بين GSH و MDA لدى مجموعة مرضى الكيسة العدارية.
|
| المناقشة Discussion |
وجدنا من خلال الدراسة التي قمنا بها انخفاضاً واضحاً في مستويات الغلوتاثيون وارتفاعاً في مستويات المالونديالدهيد لدى مجموعة مرضى الكيسة العدارية، حيث كانت قيم الغلوتاثيون 12.05±2.81 مكرومول/ لتر وكانت قيم المالونديالدهيد ±67.94 8.14 مكرومول/ لتر مقارنةً مع أفراد المجموعة الشاهدة، حيث كانت قيم الغلوتاثيون 23.71±6.3 مكرومول/ لتر وكانت قيم المالونديالدهيد 24.64±5.29 مكرومول/ لتر.
مما يقترح وقوع إجهاد تأكسدي مترافق مع الإصابة بالكيسة العدارية وحدوث خلل واضح في استتباب حالة الأكسدة والاختزال reduction في الخلية وتراجع محتوى الخلية من الغلوتاثيون وتطور أكسدة فائقة للشحوم. وتأكد ذلك من خلال مقايسة المالونديالدهيد كواصم للإجهاد التأكسدي، حيث ارتفعت مستوياته.
توافقت نتائجنا مع دراسة Atambay et al. 2008 حيث لاحظوا انخفاضاً في مستويات الغلوتاثيون وارتفاعاً في مستويات المالونديالدهيد لدى مرضى الكيسة العدارية (13). كذلك توافقت نتائجنا مع دراسة Koltas et al. 2006 حيث أكدت دراستهم ارتفاعاً في مستويات المالونديالدهيد لدى مرضى الكيسة العدارية ولكن هذه الدراسة لم تجرِ مقايسة للغلوتاتيون عند هؤلاء المرضى (14). ولم نجد دراسات أخرى مجراه حول هذا الموضوع.
يمكن أن يفسر الإجهاد التأكسدي الناجم عن العدوى بالمشوكة الحبيبية بأن ارتشاح البلاعم وتجمعها حول الكيسة العدارية أدى إلى إنتاج جذور حرة، وعمل الغلوتاتيون، بشكله المختزل، على كنس scavenge الجذور الحرة التفاعلية المتشكلة بنتيجة دفاع خلايا الجهاز المناعي، لتقوم عندها إنزيمات مُخْتَزِلَةُ الغلُوتاثَيون Glutathione reducatse بإعادة توليد الغلوتاثيون المختزل من جديد. ومع الوقت ونتيجة الإنتاج المفرط للجذور الحرة أصبحت عمليات إزالة السمية هذه أكبر من قدرة الخلية على إعادة توليد الغلوتاثيون المختزل مما أدى إلى تراجع تدريجي لمحتوى الخلية من الغلوتاثيون (مضاد الأكسدة الأساسي) وتراجع قدرة الخلية الدفاعية المضادة للأكسدة، واختلال استتباب حالة الأكسدة والاختزال في الخلية. وسمح ذلك للجذور الحرة بمهاجمة الروابط المضاعفة في الأحماض الدهنية عديدة عدم الإشباع الداخلة في التركيب البنيوي للأغشية الحيوية وانطلاق سلسلة من تفاعلات الأكسدة الفائقة للشحوم المؤدية إلى تشكل المالونديالدهيد، والمسببة لتبدلات بنيوية وتخرب في الأغشية الحيوية.
كذلك أظهرت دراستنا وجود علاقة عكسية يعتد بها إحصائياً بين مستويات الغلوتاثيون والمالونديالدهيد لدى مرضى الكيسة العدارية أي أن تطور الشدة التأكسدية يرتبط بتراجع محتوى الخلية من الغلوتاثيون، لكن لا تتوفر دراسات عالمية تبين العلاقة بين مستويات الغلوتاثيون والمالونديالدهيد لدى مرضى الكيسة العدارية. يمكن أن نقترح إضافة الفيتامينات المضادة للأكسدة E و Vit C إلى المعالجة الدوائية للكيسات العدارية، حيث ترفع فعالية الغلوتاثيون والذي هو أحد عوامل حماية الخلية من التأثيرات الضارة للجذور الحرة. لكن لا تتوفر دراسات عالمية جرت فيها إضافة الفيتامينات المضادة للأكسدة إلى المعالجة الدوائية للكيسات العدارية.
|
الاستنتاج Conclusion
يُشير انخفاض مستويات الغلوتاتيون وارتفاع مستويات المالونديالدهيد لدى مرضى الكيسة العدارية إلى حدوث إجهاد تأكسدي وأكسدة فائقة للشحوم كآلية للضرر النسيجي في هذه الإصابة. لذلك يمكن مقايسة مستويات الغلوتاثيون والمالونديالدهيد كواصمات حيوية هامة لدى مرضى الكيسة العدارية لتقصي سير المرض والحالة الإمراضية Pathologic المرافقة.
|
| المراجع References |
1-Khanfar N.
Hydatid cyst.
Current Anaesthesia & Critical Care; 15: 173-183, 2004.
2-Darwish B.
Clinical and radiological manifestations of 206 patients with pulmonary hydatidosis over a ten-year period.
Prim Care Respir J; 15(4): 246-251, 2006.
3-McManus D.P; Zhang W; Li J. and Bartley P.B.
Echinococcosis.
Lancet; 362:1295-1304, 2003.
4-Dzik JM.
Molecules released by helminth parasites involved in host colonization.
Acta Biochim Pol; 53: 33-64, 2006.
5-Cabrera G; Cabrejos ME; Morassutti AL; Cabez?n C; Orellana J; Hellman U; Zaha A. and Galanti N.
DNA damage, RAD9 and fertility/infertility of Echinococcus granulosus hydatid cysts.
J Cell Physiol; 216(2): 498-506. 2008.
6-Mackenzie E.L.
Reactive Oxygen/Reactive Metabolites and Toxicity. In: Smart R C; Hodgson E, editors.
Molecular and biochemical Toxicology.
4th ed. John Wiley & sons; 389-411, 2008.
7-Liberman M. and Marks A.D.
Basic Medical Biochemistry: a clinical approach.
2nd ed. Lippincott Williams & Willinks. 380-395, 439-453, 2005.
8-Boelsterli Urs A.
Mechanistic Toxicology: The molecular basis of how chemicals disrupt biological targets.
1st ed. Taylor & Francis; 15-295, 2003.
9-Azad N; Rojanasakul Y. and Vallyathan V.
Inflammation and lung cancer: roles of reactive oxygen/nitrogen species.
J Toxicol Environ Health B Crit Rev; 11(1): 1-15, 2008.
10-Franco R; Schoneveld OJ; Pappa A. and Panayiotidis MI.
The central role of glutathione in the pathophysiology of human diseases.
Archives of Physiology and Biochemistry; 113 (4/5): 234-242, 2007.
11-Reed Donald J.
Mechanisms of chemically induced cell injury and cellular protection mechanisms.
In: Smart R C, Hodgson E, editors. introduction to biochemical toxicology. 3rd ed. John wily, 221-252, 2001.
12-Han D; Hanawa N; Saberi B. and Kaplowitz N.
Role of glutathione redox status in liver injury.
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol; 291:G1-G7, 2006.
13-Atambay M; Karaman U; Kiran T.R; Colak C; Karabulut AB; Celik T. and Daldal N.
Gltathione and malondialdhyde levels in patients with hydatid cyst.
Saudi Med; 29: 87-89, 2008.
14-Koltas I; Yucebilgic G; Bilgin R; Parsak C.K. and Sakman G.
Serum malondialdhyde levels in patients with cystic echinococcosis.
Saudi Med; 27: 1703-1705, 2006.
|
| |
