بحث في أعداد المجلة الجملة   المؤلف

المجلد 6 , العدد 3 , ذو القعدة 1432 - تشرين أول (أكتوبر) 2011   علم الأحياء الدقيقة القديمة: المبادئ والشروط ودوره في فهم وباء الموت الأسود  Palaeomicrobiology: Principals and Conditions and Its Role in the Comprehension of the Black Death Epidemic د. عبد الناصر كعدان* و د. محمود عنجريني** *Kaadan Abd N. and **Angrini M. *قسم تاريخ الطب،**قسم الطب المخبري، كلية الطب، جامعة حلب. (مقال مُراجَعَةReview Article ) المقدمة Introduction شهد عام 1993 بداية فعلية لما يدعى بعلم الأحياء الدقيقة القديمة Palaeomicrobiology؛ ففي ذلك العام أُجري كشف جزيئي لدنا DNA جرثومة المتفطرة السلية Mycobacterium Tuber-culosis في هيكل عظمي إنساني قديم على يد باحثين هما Spigelman and Lemma (1). وكان لهذا البحث الفضل في توضيح دور تقنيات البيولوجيا الجزيئية في التنقيب عن العوامل الممرضة في العينات القديمة المستخلَصة من أنسجة إنسانية متنوعة ومن نواقل ومستودعات للعوامل الممرضة القديمة. يمكن من وجهة نظر علمية كشف معظم هذه العوامل الممرضة، باستثناء بعض الطفيليات المعوية وبعض الفيروسات، اعتماداً على كشف وتمييز أحماضها النووية (2). لقد أوضحت بعض المعطيات التجريبية أنه من الممكن كشف DNA الجرثومي في عينات المضيف الذي يعود إلى مدة تقارب 20 ألف سنة، وفي العينات البيئية المحفوظة في الطبقة الجليدية المتجمدة والتي يعود تاريخها إلى عدة آلاف من السنين (3). وكذلك فلقد جرى استخلاص RNA فيروس الأنفلونزا الإسبانية من نسيج رئوي إنساني محفوظ بالفورمالين ومن نسيج إنساني محفوظ بالطبقات الجليدية (4). يعد وباء الموت الأسود الذي أصاب قارات العالم القديم في القرن الرابع عشر الميلادي واحداً من أسوأ الكوارث العالمية. ومن أهم الأمثلة التي توضّح دور علم الأحياء الدقيقة القديمة في الإجابة عن أسئلة معقدة طالما شكلت معضلة صعبة الحل ومحوراً مستمراً للجدال.   1- أهداف علم الأحياء الدقيقة القديمة  يهدف الكشف الجزيئي للعوامل الممرضة الماضية إلى: • تشخيص الأمراض المُعْدِية القديمة والأوبئة الغامضة التي حيّرت الباحثين لمدة طويلة. • شرح وبائية هذه الأمراض المُعْدِية القديمة من خلال إعادة إنشاء التوزيع الجغرافي والزماني للأفراد المصابين ونواقل ومستودعات العامل الممرض، مما يمكننا من وضع مخطط وبائي عالمي لكل الأمراض المُعْدِية السارية. • تتبّع التطور الجيني للأحياء الدقيقة عبر تنميطها جينياً (5)، وتحديد موعد دخولها الأول للبشر. وفي المحصلة فإن هذه المعلومات سوف تعود بالفائدة على الباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة الحديث وفي مجال العلاقات بين المضيف والعامل الممرض والباحثين في مجال الوبائيات.   2- مميزات الدنا القديم Ancient DNA  إنّ الدراسات التجريبية التي أُجريَت على مدى عشرين سنة الأخيرة، قد أوضحت تمتّع الدنا DNA القديم بمميزات خاصة به مقارنة مع الدنا DNA الحديث وهذه المميزات هي: • إن الدنا القديم يكون محطّماً إلى أجزاء تقلّ كل منها عن 500 أساس آزوتي (6)؛ وبالنتيجة لا يمكن أن نستخدم تقنية PCR Polymerase) Chain Reaction) لتضخيم شدف Fragments كبيرة في العينات القديمة، بل فقط شدف صغيرة. ويمكن التغلب على هذا العائق عبر إجراء البلمرة Polymerisation (7)، باختيار مَشْرَع Primer لتضخيم شدف تقل أوتساوي 300 أساس آزوتي أو عبر التصليح الإنزيمي من خلال الفعالية المركّبة لإنزيم DNA polymerase I وإنزيم T4 DNA ligase (8). • يتميز الدنا القديم أحياناً بالتعديل الكيميائي الذي يتضمن الأكسدة والحلمهة، مما يسبب نزع أمين النوكليوتيدات (9). قد يؤدي هذا التعديل الكيميائي إلى نتاج سيء من تضخيم PCR. ويكمن الحل في اختيار Taq DNA polymerase مناسب. • أوضحت العديد من الدراسات وجود مثبطات PCR في مستخلصات العينات القديمة (10). لم تُحَدّد بعد الطبيعة الدقيقة لهذه المثبطات. وللتغلب عليها يمكن تمديد العينات المستخلصة أو إضافة ألبومين المصل البقري BSA أو بروتين آخر مشابِه (11).   3- مصادر الدنا القديم  يمكن استخلاص الدنا القديم من العينات المجمّدة للنسيج الضام للمضيف، كما جرى في دراسة العالم R.J. Cano وزملائه (12)، أو العينات المحنّطة كما جرى في دراسة العالم Fornaciari وزملائه (13)، أو العينات المدفونة كما جرى في دراسة العالم Reid وزملائه (14)، أو العينات المثبّتة كما جرى في دراسة العالم Taubenberger وزملائه (15). في بداية الأمر، فإنّ دراسات علم الأحياء الدقيقة القديمة استخدمت الأنسجة العظمية، أما حالياً فيشكل لب الأسنان والأنسجة المحنّطة مادة أساسية (16). ويجب الانتباه إلى أن الاستخلاص من الأنسجة العظمية والأسنان الكاملة يستلزم إزالة تكلس واسعة باستخدام مادة EDTA والطحن الميكانيكي للعظام قبل البدء باستخلاص الدنا. إن استخدام لب الأسنان قد يكون المكان الأنسب للكشف الجزيئي للعضويات المحمولة بالدم (17). يمكن الحصول على الدنا القديم من مصادر بيئية كالمصادر غير الحية (تربة ملوّثة مثلاً) أوالطفيليات الخارجية Ectoparasite، أو بعض الحيوانات التي تلعب دور مستودع Reservoir، أو ناقل Vector (الشكل 1).   4- مميزات طريقة التعامل مع الدنا القديم  إن عملية كشف الدنا القديم العائد للعامل الممرض هي عملية أكثر تعقيداً وصعوبة من عملية التعامل مع عينات الدنا الحديث، ولعل الخطر الأكبر الذي يهدد مصداقية نتائجها هو خطر حدوث التلوّث، لهذا طوّر العلماء مع استمرار التجارب بروتوكولات معينة لمنع حدوث تلوث العينة.  4-1- أهم أسباب تلوّث عينات الدنا القديم من الممكن تعرض العينة للتلوث في مراحل العمل الثلاث: • مرحلة جمع العينات: يحدث التلوث في هذه المرحلة إما من النبيت المنقول باليدين أو النبيت البيئي؛ حيث أن الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في موقع المدفن يمكن لها أن تلوّث العينات قبل إجراء التحاليل المخبرية. ويعد خطر التلوث عالياً بشكل خاص عندما يجري استخدام أُسلوب عالمي مثل 16S rDNA-based PCR (18)، في حين يصبح الخطر أقل عند استخدام أهداف جزيئية نوعية. • مرحلة استخلاص الدنا القديم: قد يحدث التلوث إما من تجارب سابقة مع العامل الممرض نفسه في المختبر ذاته أو من الشاهد الإيجابي أو النبيت المنقول باليدين. • مرحلة PCR: قد يحدث التلوث في مجموعة الكواشف المستخدمة أو غيرها. 4-2- طرق الوقاية من حدوث تلوّث عينات الدنا القديم في عام 2000، وضع العالمان Alan Cooper and Hendrik Poinar عدة معايير لموثوقية العمل (19)، وهذه المعايير هي: • أن تكون منطقة العمل معزولة مادياً: يجب أن لا يكون المختبر المستخدم مكاناً لفحوص روتينية عن الدنا الهدف. • أن تكون عملية التضخيم Amplification مضبوطة وتتضمن عدة مستخلصات وشواهد. • أن يكون السلوك الجزيئي مناسباً: أي أن تتناسب قوة تضخيم PCR بشكل عكسي مع حجم الناتج. • القدرة على تكرار الإنتاج باستخدام العينات نفسها، واستخدام أزواج مَشْرَعات Primers مختلفة ومتراكبة. • الاستنساخ Cloning: يجب على الباحثين تحديد المتواليات Sequencing باستنساخ ناتج التضخيم. • التنسخ المستقل: بمعنى أن يجري استخلاص وتحديد متواليات عينات مستقلة مأخوذة من النموذج نفسه Specimen في مخابر منفصلة (الشكل 2). بناء على المعايير السابقة وعلى نتائج التجارب المتواصلة جرى اقتراح عدد من الإجراءات العملية التي تهدف إلى الحرص على مصداقية العمل، وهذه الإجراءات تقسم كما يلي:     الإجراءات في موقع الدفن، والتي تهدف إلى الوقاية من تلوّث النبيت البيئي والنبيت المنقول باليدين، وهي: ارتداء قفازات معقمة، كشط السطح الخارجي للعظام، استخدام ماء معقم، التنظيف باستخدام هواء مضغوط مرشّح. التشعيع باستخدام الأشعة فوق البنفسجية 254-nm (20). وفي حال التعامل مع الأسنان القديمة ينصح بوضعها في راتين Resin معقم (21). يمكن اللجوء إلى تحليل العينات البيئية (كتربة المدفن مثلاً) باستخدام الأهداف الجزيئية نفسها للتأكد من خلوّ العينة من تلوث التربة (22). إن استخدام عينات محمية بشكل طبيعي مثل لب الأسنان يقلل خطر التلوث الخارجي (17). الإجراءات في المختبر: ارتداء قفازات لدى التعامل مع العينة، استخدام غرف مخصصة ومضبوطة واستخدام التجهيزات القابلة للاستخدام لمرة واحدة، يجب أن تحضر حديثاً الكواشف وتشعع بالأشعة فوق البنفسجية، عدم استخدام شواهد إيجابية عند إجراء تجارب الدنا القديم، ويمكن استخدام شواهد إيجابية زائفة ودنا يعود إلى أنواع مختلفة، استخدام شواهد سلبية لمراقبة أي مصدر لاحق للتلوث، استخدام ما يدعى Suicide PCR والذي يجري فيه استخدام زوج جديد من PCR primer موجّه إلى منطقة مجينية genomic جديدة في كل تجربة جديدة مع تجنب استخدام شواهد إيجابية (16)، كما يجب انجاز المَشْرَع Primer الأمثل في بناء منفصل عن البناء الذي سيجري فيه التعامل مع العينات القديمة، وكذلك الأمر بالنسبة للمختبر الذي يجري فيه استخلاص DNA القديم. ويفضـل أن تكون كل من هذه المختبرات في بناء منفصل (23). 4-3- دلائل جودة العمل: • إن غياب أي تضخيم في الشواهد السلبية هو دليل أساسي لا غنى عنه لضمان جودة العمل. • الحصول على متوالية أصلية Original Sequence تختلف عن الدنا الشائع، في الوقت الحاضر، يبعد احتمال حدوث تلوث في المختبر، ويشكل دليلاً قوياً على موثوقية العمل. ويجب أن يظهر هذا التسلسل الأصيل في عدة مرات (24). • كما أن ظهور متواليتين مختلفين يحددان العامل الممرض نفسه في العينة ذاتها يزيد نوعيّة تحديد هوية هذا العامل الممرض. وكذلك الأمر لظهور متوالية أصلية لدنا العامل الممرض بالنسبة للعينات المختلفة المجموعة من الشخص نفسه. • تعد أول متوالية يجري انجازها في المختبر ذات مصداقية كبيرة إذا لم يجرِ التعامل مع العامل الممرض المفتش عنه في ذلك المختبر من قبل. أخيراً من الجدير بالذكر أن التنميط الجيني سوف يساهم في صنع جسر يربط بين كشف دنا العامل الممرض في العينات الإنسانية والبيئية القديمة وبين علم الأحياء الدقيقة الحديث. وإن توافر قاعدة بيانات كبيرة تشمل التسلسل الكامل للجينوم المكروبي سوف يدعم تأسيس تقنية Suicide PCR وطرق جديدة لتحديد النمط الجيني للمكروبات الماضية (24). 5- الموت الأسود وعلم الأحياء الدقيقة القديمة يعد وباء الموت الأسود The Black Death من أشد الكوارث التي عصفت بالعالم، فهو يعد وفقاً لمعيار Foster Scale الذي وضعه البروفسور الكندي Harold D. Foster - الذي يرى أن الكوارث يجب ألا تُقاس بعدد الوفيات فحسب، بل بالأخذ بالحسبان أيضاً الأذى الجسدي والمادي والشدة النفسية الناتجة عنه على مستوى المجتمع- ثاني أشد كارثة في التاريخ محققاً درجة 10.9 بعد الحرب العالمية الثانية التي حققت 11.1. في حين أن الحرب العالمية الأولى قد جاءت في المركز الثالث محققة 10.5 (25). لقد فتك الموت الأسود ما بين عامي 1346-1352 بحوالي ثلث سكان أوروبا وبلاد الشام ومصر وشرق ووسط آسيا وشمال أفريقيا. وقد دار جدل كبير في السنوات الأخيرة تركّز حول العامل المسبب الذي كان مسؤولاً عن انتشار هذا الوباء. فلقد اعتقد الكثيرون أن سببه هو جرثومة اليرسينيا الطاعونية Yersinia Pestis المسببة لداء الطاعون الدبيلي، في حين اعتقد آخرون من أمثال البروفسورين في جامعة ليفربول البريطانية Duncan C. J. and S. Scott أنه كان عبارة عن حمى فيروسية نزفية Viral Haemorrhagic Fever تشبه حمى الضنك Dengue Fever (26). ورأى العالم Joseph Patrick Byrne أنه ليس سوى مرض الجمرة الخبيثة الذي تسببه عصيات Anthrax Bacillus (27). أما العالم Cohn S.K. فاعتقد أنّ سببه عاملاً ممرضاً كان موجوداً سابقاً وغير معروف حالياً (28). في السنوات الأخيرة قدمت عدة دراسات، قامت على مبادئ علم الأحياء الدقيقة القديمة وتقنيات البيولوجيا الجزيئية، دلائل على أن Yersinia Pestis هي السبب في حدوث الموت الأسود، ومن هذه الدراسات: • دراسة قام بها عدة باحثين في جامعة Rockefeller الأمريكية في عام 2000 اعتمدوا فيها على تقنية Suicide PCR لفحص لب 23 سناً جمعت من هياكل ضحايا توفوا بالموت الأسود في مدينة مونبلييه Montpellier الفرنسية (29). • دراسة أخرى قام بها باحثون في مرسيليا بجنوب فرنسا في 2007، جرى فيها فحص لب 36 سن أخذت من ثلاث مقابر جماعية في Vienne, Martigues and Marseille وجرى فيها استخدام تقنية Suicide PCR ومراعاة عدد من شروط السلامة من تلوث العينة المذكورة سابقاً (30). • الدراسة الأهم قام بها مجموعة كبيرة من العلماء (12 باحثاً) ينتمون إلى خمسة عشر مؤسسة بحثية متوزعة في فرنسا وإيطاليا وألمانيا وهولندا والمملكة المتحدة وايرلندا. جرى فيها تحليل لب أسنان وعظام تعود إلى 76 هيكل عظمي في مقابر جماعية موجودة في فرنسا (مدفنان) وألمانيا (مدفنان) وهولندا (مدفنان) وإيطاليا (مدفن) وإنكلترا (مدفن) (31). أكدت هذه الدراسة أن سبب الموت الأسود هو جرثومة اليرسينيا الطاعونية، ووجدت أيضاً أنه بخلاف المتوقع لم تتسبب السلالة الشرقية أو الوسيطة Orientalis, Medievalis من جرثومة Yersinia Pestis بالمرض، بل تسببت به سلالتان جينيان قديمتان جرى تحديد مكانهما في سلسلة تطور الأنماط الجينية لجرثومة اليرسينيا الطاعونية، كما جرى الاستنتاج أن الموت الأسود قد وصل إلى فرنسا عبر طريقين مختلفين، كل منهما حمل سلالة مختلفة. ولقد اتبعت في هذه الدراسة كافة شروط السلامة من تلوث العينة، بالإضافة إلى استخدامها طريقة إضافية، لكشف المستضد المحفظي F1 antigen النوعي لجرثومة اليرسينيا الطاعونية، تعتمد على مبدأ مقايسة الاستشراب المناعي باستخدامه غَميسة dipstick خاصة جرى تطويرها.   خاتمة  من الواضح أنّه قد تمّ في الآونة الأخيرة وضع أسس ثابتة يستند إليها علم الأحياء الدقيقة القديمة Palaeomicrobiology، مما يبشر بتعزيز دوره مستقبلاً في كشف اللثام عن المزيد من أسرار الأوبئة القديمة ويساعد في تطور الفهم عن كيفية نشوء العوامل الممرضة وطرق انتقالها.  المراجع References  1-Spigelman M; Lemma E. The use of the polymerase chain reaction to detect Mycobacterium tuberculosis in ancient skeletons. Int J Osteoarchaol, 3: 143, 1993. 2-Bouchet F; Harter S; Le B.M. The state of the art of paleoparasitological research in the Old World. Mem Inst Oswaldo Cruz, 98 (Suppl. 1): 95–101, 2003. 3-Willerslev E; Cooper A. Ancient DNA. Proc R Soc London B Biol Sci, 272: 3–16, 2005. 4-Reid A.H; Fanning T.G; Janczewski T.A; Taubenberger J.K. Characterization of the 1918 “Spanish” influenza virus neuraminidase gene. Proc Natl Acad Sci, 97: 6785–6790, 2000. 5-Drancourt M; Raoult D. Palaeomicrobiology: current issues and perspectives. Nat Rev Microbiol, 3: 23–35, 2005. 6-Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature, 362: 709–715, 1993. 7-Golenberg E.M; Bickel A; Weihs P. Effect of highly fragmented DNA on PCR. Nucleic Acids Res, 24: 5026–5033, 1996. 8-Pusch C.M; Giddings I; Scholz M. Repair of degraded duplex DNA from prehistoric samples using Escherichia coli DNA polymerase I and T4 DNA ligase. Nucleic Acids Res 26: 857–859, 1998. 9-Hofreiter M; Jaenicke V; Serre D; Haeseler A.A; P??bo S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucleic Acids Res, 29: 4793–4799, 2001. 10-Hoss M; Jaruga P; Zastawny T.H; Dizdaroglu M; P??bo S. DNA damage and DNA sequence retrieval from ancient tissues. Nucleic Acids Res 24: 1304–1307, 1996 11-Rohland N; Hofreiter M. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques 42: 343–352, 2007. 12-Cano R.J; Tiefenbrunner F; Ubaldi M; Del C.C; Luciani S; Cox T; et al. Sequence analysis of bacterial DNA in the colon and stomach of the Tyrolean Iceman. Am J Phys Anthropol, 112: 297–309, 2000. 13-Fornaciari G; Zavaglia K; Giusti L; Vultaggio C; Ciranni R Human papillomavirus in a 16th century mummy. Lancet, 362: 1160, 2003. 14-Reid A.H; Fanning T.G; Hultin J.V; Taubenberger J.K. Origin and evolution of the 1918 “Spanish” influenza virus hemagglutinin gene. Proc Natl Acad Sci, 96: 1651–1656, 1999. 15-Taubenberger J.K; Reid A.H; Lourens R.M; Wang R; Jin G; Fanning T.G. Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes. Nature, 437: 889–893, 2005. 16-Raoult D; Aboudharam G; Crubezy E; Larrouy G; Ludes B; Drancourt M. Molecular identification by “suicide PCR” of Yersinia pestis as the agent of Medieval Black Death. Proc Natl Acad Sci, 97: 12800–12803, 2000. 17-Drancourt M; Aboudharam G; Signoli M; Dutour O; Raoult D. Detection of 400-year-old Yersinia pestis DNA in human dental pulp: an approach to the diagnosis of ancient septicemia. Proc Natl Acad Sci 95: 12637–12640, 1998. 18-Gilbert M.T; Cuccui J; White W; Lynnerup N; Titball R.W; Cooper A; Prentice M.B. Absence of Yersinia pestis-specific DNA in human teeth from five European excavations of putative plague victims. Microbiology 150: 341–354, 2004. 19-Cooper A. and Poinar H.N; Ancient DNA: do it right or not at all. Science, 289: 1139, 2000 20-Ou C.Y; Moore J.L; Schochetman G. Use of UV irradiation to reduce false positivity in polymerase chain reaction. Biotechniques 10: 442-446, 1991. 21-Gilbert M.T; Willerslev E; Hansen A.J; Barnes I; Rudbeck L; Lynnerup N; Cooper A. Distribution patterns of postmortem damage in human mitochondrial DNA. Am J Hum Genet 72:32–47, 2003. 22-Papagrigorakis M.J; Yapijakis C; Synodinos P.N; Baziotopoulou-Valavani E. DNA examination of ancient dental pulp incriminates typhoid fever as a probable cause of the Plague of Athens. Int J Infect Dis 10:206–214, 2006. 23-Drancourt M; Roux V; Dang L.V; Tran-Hung L; Castex D; Raoult D; et al. Genotyping, Orientalis-like Yersinia pestis, and plague pandemics. Emerg Infect Dis 10:1585–1592, 2004. 24-Drancourt M; Raoult D; Paleomicrobiology: Past Human Infections. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, Germany, Page 61. 25-Harold D. Foster. What Really Causes AIDS. Trafford Publishing. 2002, page 28 26-Duncan C. J; Scott S.. What caused the Black Death?. Postgrad Med J,;81: 315–320, 2005. 27-Byrne J.P. The Black Death. Westport: Greenwood Press. pp 21–29, 2004 28-Cohn S.K; Jr. The Black Death transformed: Disease and culture in early Renaissance Europe. London: Arnold, 2002. 29-Raoult D; Aboudharam G; Crubézy E; Larrouy G; Ludes B; Drancourt M.. Molecular identification by ‘‘suicide PCR’’ of Yersinia pestis as the agent of Medieval Black Death. Proc. Natl. Acad. Sci. (PNAS), 97(23): 12800–12803, 2000. 30-Drancourt M; Signoli M Dang L. V; Bizot B; Roux V; Tzortzis S; Raoult D.. Yersinia pestis Orientalis in Remains of Ancient Plague Patients. Emerging Infectious Diseases, 13(2): 332-333, 2007. 31-Haensch S, Bianucci R, Signoli M, Rajerison M, Schultz M, et al. Distinct Clones of Yersinia pestis Caused the Black Death. PLoS Pathog, 6(10): 1-8, 2010.     المجلد 6 , العدد 3 , ذو القعدة 1432 - تشرين أول (أكتوبر) 2011 SCLA