| الملخص Abstract |
تعد الجِيارْدِيَّةُ اللَّمْبِلِيَّة من أكثر الطفيليات انتشاراً في المياه الملوثة. وقد يتطور تأخر نمو لدى الأطفال المصابين بداء الجِيارْدِيَّات المزمن.
إن استخدام الطرق التشخيصية الروتينية قد لا يكون كافياً في بعض الحالات لإثبات وجود هذه الكائنات الحية، حيث يتطلب الأمر تدريباً خاصاً للعاملين في المختبر لاكتساب الخبرة الكافية للتمييز بين الموجودات المجهرية. ولهذا السبب كان هنالك تطوير دائم لأساليب تشخيصية جديدة تعنى براحة المريض وسرعة ومصدوقية العمل المخبري.
جرى في هذه الدراسة اختبار مقايسة كيفية للاستشراب اللوني المناعي ذي الطور الصلب للكشف عن مستضد الجِيارْدِيَّةُ اللَّمْبِلِيَّة في عينات البراز. وقورنت النتائج مع الفحص المجهري الاعتيادي. حيث شملت الدراسة 100 طفل، 80 منهم من المصابين بداء الجِيارْدِيَّات و20 طفلاً من الشواهد السليمة.
أثبتت مقارنة نتائج الفحص المجهري الاعتيادي لعينات البراز مع نتائج مقايسة الاستشراب اللوني المناعي الكيفي ذي الطور الصلب أن الأخير يتمتع بنوعية عالية 100% وحساسية جيدة 92.4%.
|
Giardia lamblia is considered to be one of the most parasites found in contaminated water. Children whom infected with chronic Giardiasis may develop Growth retardation.
In some cases, the use of routine diagnostic methods may be insufficient to demonstrate the presence of these organisms, a special training for labor is required to have the appropriate Experience to distinguish between microscopic findings. For that reason, there was a continues development for new diagnostic approaches that assess the patient comfort and the credibility of the laboratory work.
In this study, a Solid-Phase Qualitative Immunochromatographic Assay to detect Giardia Lamblia copro- antigen were tested. And the results were compared with the traditional microscopic examination. The study included 100 children, 80 infected with Giardiasis and 20 were control subjects.
Comparing results of routine Microscopic examination with the Solid- Phase
Qualitative Immunochromatographic Assay proved that the latter has high specifety 100%, and good sensitivity 92.4%.
|
| المقدمة Introduction |
داء الجيارديات هو مرض عالمي يسببه طفيلي الجِيارْدِيَّةُ اللَّمْبِلِيَّة Giardia lamblia. يعد داء الجيارديات من أكثر الأمراض الطفيلية انتشاراً في العالم، حيث تبلغ نسبة إصابة البالغين 2% بينما ترتفع إلى 8% عند الأطفال في البلدان النامية (7، 10).
لا تظهر أعراض سريرية عند معظم المصابين بداء الجيارديات وغالباً ما يكون الشفاء ذاتياً دون مداخلات دوائية. بينما تعاني نسبة من المصابين من أعراض إسهال وضمور الحافة الفرشانية للأمعاء الدقيقة وسوء امتصاص ثانوي (7).
يعد داء الجيارديات من أكثر الأمراض الناتجة عن تلوث المياه، إذ يسبب وجود الأكياس في مرافق المياه العامة في البلدان النامية قلقاً أساسياً لصحة العامة عند كشفها. يؤدي شرب المياه الملوّثة بأكياس الجيارديا لامبليا إلى الإصابة بإسهال المسافرين في بعض مناطق العالم ، لا سيما لدى القادمين من بلدان متقدمة إلى أخرى موبوءة (6).
تتواجد كيسات الجيارديا في خزانات مياه المدن وهي تقاوم طرق معالجة المياه المختلفة، مثل التنقية باستخدام الكلور أو الأوزون أو طريقة التحال. ويكفي ابتلاع عشر كيسات جياردية لبدء العدوى التي تسبقها فترة حضانة تستمر مدة 14 يوم وتكون العدوى محدودة ذاتياً عند البالغين (1، 5).
إن للسراية المباشرة من إنسان إلى إنسان أهمية خاصة في الأحوال التي يكون تواتر تلك السراية فيها كبيراً. وتحدث السراية المباشرة بين البشر عند الابتلاع غير المقصود للكيسات الموجودة في مياه أو طعام ملوّث أو عند انخفاض مستويات الوعي الصحي للنظافة الشخصية في مراكز العناية الصباحية بالأطفال في المجتمعات الفقيرة، حيث يزداد عدد الإصابات وترتفع فرصة العدوى من شخص لآخر. ويكون الأطفال الأكثر عرضة لاختطار الإصابة بالعدوى )8). وغالباً لا يعالج الأطفال المصابون، مما يزيد العواقب طويلة الأمد في حال استمرار الإصابة وعدم حدوث شفاء ذاتي، الأمر الذي يزداد سوءاً عند الأطفال الذين لا يتلقون التغذية الملائمة، أو المعرضين لأمراض طفيلية معدية أخرى مثل عدوى المحرشفة الصغيرة أو عدوى المَلقُوّات (8).
يجب التفريق بين آثار العدوى الحادة التي قد تسبب إسهالاً قصير الأمد وبين الآثار طويلة الأمد، خاصة لدى الأطفال الذين يعيشون في أماكن ترتفع فيها نسبة الإصابة، حيث يتعرض الأطفال في المناطق الموبوءة، التي تتناقص فيها النظافة ويرتفع فيها معدّل السراية، إلى عواقب داء الجيارديات المزمن مثل: سوء الامتصاص، عوز العناصر الزهيدة، عوز الحديد، فقر الدم، ضعف الوظيفة الإدراكية (4).
يُعد الفحص المجهري للبراز الطريقة المعتمدة لتشخيص داء الجيارديات، إلا أنه يعتمد بشكل أساسي على خبرة ومعرفة الشخص المخبري الذي يقوم به وعلى حجم العينة المدروسة ومدى كثافة الطفيلي فيها. ومن هنا تأتي الحاجة إلى تقنية تشخيصية جديدة تكون أكثر نوعية وحساسية. وتستخدم في الوقت ذاته عينة البراز، باعتبارها العينة الأكثر سهولة في الجمع لدى مختلف الفئات العمرية عامة، ولدى الأطفال خاصةً (2).
هدفت دراستنا إلى اختبار مقايسة كيفية للاستشراب اللوني المناعي ذي الطور الصلب، للكشف عن مستضدات الجياردية اللمبلية في عينات البراز ومقارنة النتائج مع الفحص الروتيني للبيضة والطفيلي باستخدام المجهر الضوئي وذلك لعينة من الأطفال بصفتهم الفئة الأكثر تأثراً بداء الجيارديات.
|
| المواد والطرق Materials and Methods |
مكان وزمان الدراسة
جُمعت عينات البراز من مستشفى الأطفال في دمشق بالإضافة إلى مجموعة من المختبرات المنتشرة في مناطق مختلفة من دمشق وخاصة منطقة دوما باعتبارها منطقة عالية الاختطار، نظراً لسوابق تلوث المياه فيها.
مجموعة الدراسة
تألفت عينة البحث من 100 من الأطفال واليافعين تراوحت أعمارهم بين أسبوعين و16 عاماً. واستبعدت النتائج المتعلقة بأحدهم بسبب فشل نتيجة أحد اختبارات المقايسة [Invalid test] فأصبحت العينة مؤلفةً من 99 من الأطفال واليافعين الذين تراوحت أعمارهم بين أسبوعين و16 عاماً. أخذت عينة براز من كل منهم، وبنتيجة الفحص المجهري قُسّمت عينة البحث إلى مجموعتين رئيستين وفقاً للإصابة بالجياردية اللمبلية :مجموعة المصابين بداء الجيارديات، ومجموعة الأطفال السليمين (غير المصابين بهذا الداء). حيث كان توزع الأطفال في عينة البحث وفقاً للمتغيرات المستقلة المختلفة المدروسة معتمداً على توزع الأطفال في عينة البحث وفقاً للإصابة بالجياردية اللمبلية مجهرياً (الجدول 1).
|
الجدول 1: توزع الأطفال في عينة البحث وفقاً للإصابة بالجياردية اللمبلية مجهرياً.
الإصابة بالجيارديا |
عدد الأطفال |
النسبة المئوية |
غير مصاب بالجياردية اللمبلية مجهرياً |
20 |
20.2 |
مصاب بالجياردية اللمبلية مجهرياً |
79 |
79.8 |
المجموع |
99 |
100 |
|
مواد الدراسة
الأجهزة المستخدمة: مجهر ضوئي
الكواشف المستخدمة: عتيدة لكشف مستضدات الجياردية اللمبلية البرازية باختبار الاسـتشراب اللونـي المناعي السريع.
- Rapid chromatographic immunoassay (Xpect®) لشركة Remel الأمريكية.
- عتيدة ضابطة لاختبار الاستشراب اللوني المناعي السريع الخاص بمستضدات الجياردية اللمبلية البرازية، Xpect® Giardia kit لشركة Remel الأمريكية.
|
طرق الدراسة
- الفحص المجهري لتحري الكيسات
يعد الفحص المجهري المباشـر الخطوة الأولـى
والأهم في تشخيص الطفيليات بشكل عام والجياردية اللمبلية بشكل خاص، وتعتمد نتائج هذا الفحص أولاً على خبرة عين الفاحص وثانياً على جودة وشروط أخذ العينة وتحضيرها للفحص المجهري.
طريقة العمل
جرى التحرّي عن الجياردية اللمبلية في البراز في اللطاخة المباشرة: يمدّد جزء من عينة البراز بقطرة متوسطة من المصل الفيزيولوجي ويجانس المزيج بواسطة عود خشبي، يجب أن يكون المزيج متجانساً ومتوسط الكثافة، توضع ساترة بزاوية 45 درجة لمنع تشكل فقاعات الهواء. يُفحص المحضر بالكامل بالتكبير 100 ثم يجرى الفحص بالتكبير 400.
تبدو كيسة الجياردية اللمبلية بالتكبير 400 شفافة وبيضوية تتراوح أبعادها بين 5-10 مكرون، يمكن تمييز أربع نوى وأربعة أجسام متوسطة وخيوط مبعثرة.
يمكن استخدام اليود لتمديد عينة البراز ومزج قطرة من اليود مع حجم من عينة البراز ويجانس المزيج جيداً على الصفيحة وتبدو الكيسة بالتكبير 400 ملونة بلون بني محمر بسبب إضافة اليود، كما تأخذ الخيوط المحورية السياط شكل الحرف S في وسط الكيسة، ويعيق اليود مشاهدة النوى.
يجري عد الكيسات في 10 ساحات مجهرية لتحديد شدة الإصابة.
|
| - المقايسة الاستشرابية المناعية الكيفية
Qualitative Chromatographic Immunoassay Xpect®:
|
تعد مقايسة Xpect® لا إنزيمية سريعة مصممة لكشف وجـود مسـتضدات الجياردية اللمبلية في عينات البراز المحفوظة أو اللا محفوظة.
مبدأ الاختبار:
يعتمد مبدأ كشف مستضدات الجياردية اللمبلية البرازية باستخدام عتيدة شركة Remel على طريقة الاستشراب اللوني المناعي الكيفي.
يقوم الاختبار بفتل العينة لالتقاط مستضدات الجياردية على خط اختبار T منفصل حاوٍ على أضداد نوعية لمستضدات الجياردية اللمبلية. حيث تضاف العينة على أنبوب تمديد يحوي دارئة، ثم يضاف للأنبوب سائل اقتران يتضمن جزيئات صغيرة ملونة مرتبطة بأضداد فأرية وحيدة النسيلة نوعية للجياردية اللمبلية. يوزع المزيج في بئر العينة الخاص بالأداة ويمر عبر غشاء ماصّ يحوي خيطاً لاقط للأضداد. وفي حال وجود الجياردية اللمبلية تتفاعل معقداتها المناعية مع أضداد الجياردية اللمبلية على خط الاختبار. وتُلتقط الأضداد الموسومة بالجزيئات الصغيرة غير المرتبطة عند خط الاختبار لاحقاً في خط الضبط C الحاوي على أضداد الضد الفأرية. يظهر خط أزرق (يتراوح لونه بين الأزرق القاتم والسماوي) في خط اختبار الجياردية اللمبلية في حال وجود مستضدات الجياردية. يشير الخط الكامل في موضع الضبط إلى أن الأداة تعمل بشكل جيد.
|
| النتائج Results |
أُجري اختبار الاستشراب اللوني المناعي السريع لكل عينة من عينات البراز المدروسة في البحث. ثم جرت مقارنة نتائج اختبار الاستشراب اللوني المناعي السريع مع نتائج الفحص المجهري
وحُددت السلبية والإيجابية الحقيقية والكاذبة لاختبار الاستشراب اللوني المناعي السريع اعتماداً على نتيجة الفحص المجهري وفقاً للقاعدة الموضّحة في الجدول 2.
وبالعودة إلى الجدول 2 أمكن تعيين قيم الإيجابية والسلبية (الحقيقية والكاذبة) في دراستنا كما هو موضح في الجدول 3. |
الجدول 2: تحديد السلبية والإيجابية الحقيقية والكاذبة لفحص الاستشراب المناعي السريع في عينة البحث اعتماداً على نتيجة الفحص المجهري.
نتيجة فحص الاستشراب المناعي السريع |
نتيجة الفحص المجهري |
السلبية والإيجابية |
غير مصاب بالجياردية |
غير مصاب بالجياردية |
سلبية حقيقية |
غير مصاب بالجياردية |
مصاب بالجياردية |
سلبية كاذبة |
مصاب بالجياردية |
مصاب بالجياردية |
إيجابية حقيقية |
مصاب بالجياردية |
غير مصاب بالجياردية |
إيجابية كاذبة |
الجدول 3: قيم الإيجابية والسلبية (الحقيقية والكاذبة) وحساب النوعية والحساسية والقيمة التنبوئية الإيجابية والقيمة التنبوئية السلبية لنتائج الدراسة.
|
نتيجة تشخيص الجيارديا بالفحص المجهري |
|
إيجابي |
سلبي |
نتيجة اختبار الاستشراب السريع |
إيجابي |
الإيجابية الحقيقية
= 73 |
الإيجابية الكاذبة
= 0 |
القيمة التنبوئية الإيجابية = 100% |
سلبي |
السلبية الكاذبة
= 6 |
السلبية الحقيقية
= 20 |
القيمة التنبوئية السلبية = 76.9% |
|
الحساسية = 92.4% |
النوعية = 100% |
|
|
| المناقشة Discussion |
بما أن الطرق التشخيصية المعتادة لتحري الجياردية اللمبلية في عينات البراز قد لا تكون كافية لإثبات وجود هذه الكائنات الحية في بعض الحالات، حيث يتطلب التشخيص بالمجهر الضوئي تدريباً خاصاً للعاملين في المختبر لاكتساب الخبرة الكافية للتمييز بين موجودات الفحص المجهري، لذا كان هنالك تطوير دائم لمقاربات تشخيصية جديدة تعنى براحة المريض وسرعة ومصدوقية العمل المخبري.
وبالعودة للجدول 3 نلاحظ ما يلي:
- يشير عدد السلبيات الكاذبة القليل وانعدام حالات الإيجابية الكاذبة إلى أن اختبار الاستشراب اللوني المناعي السريع جيد لتأكيد الإصابة بالجياردية اللمبلية (PPV= 100%).
- استطاع اختبار الاستشراب اللوني المناعي السريع تمييز الإصابة بالجياردية دون غيرها ولم تسجل أي حالة تفاعلات متصالبة Cross-reactions مع المتعضيات الأخرى الموجودة في عينات البراز (النوعية = 100%).
- تسمح الحساسية العالية (الحساسية =92.4%) لاختبار الاستشراب اللوني المناعي السريع باعتماد النتائج الإيجابية لهذا الاختبار.
- تشير القيمة التنبوئية السلبية NPV=76.9% إلى أن النتيجة السلبية لاختبار الاستشراب اللوني المناعي السريع قد تحتاج إلى إعادة فحص بطريقة ثانية، وهذا يفسر النتائج السلبية الكاذبة الست في دراستنا حيث تبيّن عند إعادة فحص تلك العينات بالمجهر الضوئي أن عدد الكيسات كان أقل من 4 كيسـات في السـاحة
المجهرية الواحدة.
- تستوجب النتيجة السلبية إعادة الفحص المجهري لنفي النتيجة السلبية أو تأكيدها، وذلك لكون اختبار الاستشراب اللوني المناعي السريع هو اختبار كيفي وليس كمياً، أي أنه عندما يكون تركيز مستضدات الجياردية البرازية أقل من حد الكشف فإن الاختبار لن يتمكن من كشفه.
مقارنة نتائج الدراسة مع نتائج دراسات أخرى:
- دراسة لـLynne S. Garcia, Robyn Y. Shimizu, Susan Novak, Marilyn Carroll, and Frank Chan, والتي أُجريت في جامعة كاليفورينا، لوس أنجلوس عام 2003 (3). جرى في تلك الدراسة فحص عينات براز مثبتة بالفورمالين 10% باختبار الاستشراب اللوني المناعي السريع ImmunoCard STAT لشركة Meridian Bioscience, Inc. ومقارنة النتائج مع عدة طرق مرجعية وهي:
1. فحص البيضة والطفيلي الروتيني بالمجهر الضوئي Routine O&P examination.
2. فحص التلوين المعدل السريع بالحمض modified acid-fast staining examination.
3. المقايسة المناعية للأضداد المفلورة fluorescent-antibody immunoassay.
كما جرت مقارنة النتائج وكانت حساسية اختبار Immuno Card 93.5% والنوعية 100% وهذا يتوافق مع نتائج دراستنا.
- دراسة لـ T. Weitzel, S. Dittrich, I. Mohl, E. Adusu and T. Jelinek, والتي أجريت في معهد الطب المداري، برلين، ألمانيا عام 2006 (9). جرى في تلك الدراسة فحص 220 عينة براز قسّمت كل عينة إلى قسمين: قسم جرى حفظه بواسطة ميرتولات إيودين فورمألدهيد وأجريت عليه الفحوصات التالية:
1. فحص البيضة والطفيلي الروتيني بالمجهر الضوئي Routine O&P examination.
2. المقايسة المباشرة للأضداد المفلورة direct fluorescent-antibody assay (DFA).
أما القسم الثاني من العينة فلقد جرى تجميده مباشرة وحفظه بالدرجة -20 ْم وأجري عليه اختباران يعتمدان مبدأ اختبار الاستشراب اللوني المناعي وهما على التتالي:
1. Rida Quick Giardia (R-Biopharm, Darmstadt, Germany).
2. Giardia-Strip (Coris BioConcepts, Gembloux, Belgium).
ثم جرت مقارنة النتائج وكانت حساسية اختبار Rida Quick Giardia 80% ونوعيته 99.4%، بينما كانت حساسية اختبار Giardia-Strip 44.4% ونوعيته 100%.
أي أن نوعية الاختبارين المذكورين أعلاه تتوافق مع نتائج دراستنا، بينما تختلف نتائج الحساسية في الاختبارين مع نتائج دراستنا. وقد يعود ذلك لاختلاف طريقة حفظ العينات في الدراسة المذكورة عن طريقة الحفظ التي اتبعناها بدراستنا وهي تثبيت العينات بالفورمالين 10%.
- دراسة لـ Raymond Chan, Jing Chen, Mary K. York, Norman Setijono, Raymond L. Kaplan, Fitzroy Graham, and Herbert B. Tanowitz والتي أجريت في جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو عام 1999 (2). حيث جرى في تلك الدراسة فحص عينات براز مثبتة بالفورمالين 10% باختبار الاستشراب اللوني المناعي السريع (ColorPAC Giardia لشركة Becton Dickinson) ومقارنة النتائج مع نتائج الفحص المجهري بعد استخدام إحدى طرق التلوين التالية: trichrome أو iron-hematoxylin أو التلوين المعدل المقاوم للحمض modified acid-fast staining، وكانت حساسية اختبار ColorPAC Giardia 96.1% ونوعيته 98.5% وهذا يتوافق مع نتائج دراستنا.
|
| الاستنتاج |
أثبتت مقارنة نتائج الفحص المجهري لعينات البراز مع نتائج اختبار الاستشراب اللوني السريع أن الأخير يتمتع بنوعية عالية 100% وحساسية جيدة 92.4% .
تستوجب مقارنة تكاليف الاختبارات التشخيصية النظر إلى جوانب الاختبار جميعها، بما في ذلك الكواشف، والعمالة، وتكرارية نتائج الاختبارات، وضمان جودتها وتخزين الكواشف، وخبرة الموظفين في الفحص المجهري، ومتطلبات التدريب.
وعلى الرغم من أن تكاليف اختبار الاستشراب اللوني السريع قد تكون أعلى من تكاليف الفحص المجهري إلا أن كلفة اليد العاملة أقل، بالإضافة إلى اختصار وقت العاملين في المختبر عند الاستعانة به. كما أنه لا يتطلب أجهزة خاصة لتطبيقه، مما يسمح باستخدامه كأداة تشخيصية موثوقة في حالات التحري الميداني للمناطق الموبوءة أو في حالات كوارث تلوث المياه.
وبناءً عليه، يوفّر اختبار الاستشراب اللوني السريع القدرة على كشف مستضدات الجياردية اللمبلية في عينات البراز سواء المثبّتة أو غير المثبّتة بالفورمالين 10% خلال 15 دقيقة فقط، مما يجعله أداة تشخيصية مفيدة للباحث، لا تأخذ مكان الفحص المجهري وإنما تتمم وظيفته لتأكيد الإصابة بداء الجيارديات.
|
| Reference: |
1-Baker J.R; Muller R. and Rollinson D.
Advances in Parasitology.
Academic Press, Human Waterborne Trematode and Protozoan Infection 131-150, 2007.
2-Chan R; Chen J; York M.K; Setijono N; Kaplan R.L; Graham F; and Tanowitz H.B.
Evaluation of a combination rapid immunoassay for detection of Giardia and Cryptosporidium antigens.
J. Clin. Microbiol 38: 393-394, 2000.
3-Garcia L.S; Shimizu R.Y; Novak S; Carroll M. and Chan F.
Commercial assay for detection of Giardia lamblia and Cryptosporidium parvum antigens in human fecal specimens by rapid solid-phase qualitative immunochromatography.
J Clin Microbiol 41: 209-212, 2003.
4-Hesham M.S; Edariah A.B. and Norhavat M.
Intestinal parasitic infections and micronutrient deficiency.
Med J Malaysia 59: 284-293, 2004.
5-Hunter P.R. and Thompson R.C.
The zoonotic transmission of Giardia and Cryptosporidium.
Int J Parasitol, 35: 1181-1190, 2005.
6-Okhuysen P.C.
Traveler's diarrhea due to intestinal protozoa.
Clin Infect Dis 33: 110-114, 2001.
7-Rajan T.V.
Textbook of Medical Parasitology.
BI Publications Pvt Ltd. Chapter15: Giardiasis, 119-126, 2008.
8-Thompson R.C.A.
Giardiasis: modern concepts in control and management.
Annales Nestlé, 66, 23-29, 2008.
9-Weitzel T; Dittrich S; M?hl I; Adusu E. and Jelinek T.
Evaluation of seven commercial antigen detection tests for Giardia
and Cryptosporidiumin stool sam-ples.
Clin Microbiol Infect, 12: 565-569, 2006.
10-World Health Organization: The World Health Report 1996. Fighting Disease Fostering Development. Geneva, WHO, 1996.
|
| |
