بحث في أعداد المجلة
الجملة  
المؤلف   
 

المجلد 6 , العدد 7 , ذو القعدة 1433 - تشرين أول (أكتوبر) 2012
 
تعيين تتالي النهاية الأمينية وخصائص الببتيد 14 كيلودالتون الملئم للجروح والمعزول من جلد الضفدع Rana esculenta
N-Terminal Amino Acid Sequence and Characterization of the 14 KDa Wound-Healing Peptide isolated from the Skin of the Frog Rana esculenta
د. سعاد العقلة
Souad AL-OKLA
قسم علم الحياة الحيوانية، كلية العلوم، جامعة دمشق
Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Damascus
الملخص Abstract
لقد بيَّنَا في بحثين سابقين أهمية الببتيد 14 كيلودالتون، المعزول من جلد الضفدع Rana esculenta، في الْتِئام الجروح، على طرز حيوانية وبشرية. قمنا بتنقية هذا الببتيد بوساطة بروتوكول يتضمن خطوتين الاستشراب بمُبادِلٌ للأَيونات والتَرْشيحٌ الهُلاَمِيّ، كما فصلنا مكونات عصابة الببتيد 14 كيلودالتون المضاعفة بالتحليل SDS–PAGE على الهلامة 17%. ومن أجل تعيين هوية الببتيد 14 كيلودالتون، جرى في هذه الدراسة تعيين تتالي 50 حمضاً أمينياً للنهاية الأمينية بالتدرك الآلي "لإدمان". وكان التتالي على الشكل التالي:
VHLTDQELKSMNAIWSKVDDKHIGGEALARLLIVYPWTTQYFSSANNNAA
إن البحث المكثف، باستعمال برنامج BLAST، عن تماثل لهذا التسلسل مع المعطيات المتوفرة في مصرف للبروتينات، أبدى نسبة عالية من التشابه مع تتالي الأحماض الامينية في النهاية الأمينية للبروتينات التي تنتمي إلى فوق العائلة الشبيهة بالغلوبين globin-like superfamily 52)-74%)، التي تعرف بدورها في تعديل الوظائف الخلوية خلال سيرورة ترميم الجرح، مما يفسر الفاعلية العالية للببتيد 14 كيلودالتون في هذه السيرورة. كما جرى في هذا البحث تعيين تتالي 10 أحماض أمينية للنهاية الامينية للعصابة 14 كيلودالتون المضاعفة بالتدرك الآلي لإدمان. وأنتجت كلا العصابتين تتالياً متماثلاً للنهاية الأمينية (VHLTDQELKS).
سجلنا، في هذه الدراسة، استعراف (تعيين هوية) ببتيد جديد يتميز بفعالية مرممة للجروح في البرمائيات، ذي بنية أولية فريدة، الذي يمكن تصنيفه ضمن فوق العائلة الشبيهة بالغلوبين. ونحن نستقصي حالياً فعاليات دوائية أخرى لببتيدات مستخلصة من ضفدع R. esculenta والتي يمكن أن تكون مفيدة في تصميم ببتيدات من أجل تطبيقات علاجية.  
Our previous studies have demonstrated the significance of the 14 KDa peptide, isolated from the skin of Rana esculenta in wound healing on animal models and human. We purified this peptide by a 2 steps protocol involving ion-exchange chromatography and gel filtration, and we separated the 14 KDa doublet band by SDS–PAGE analysis on 17% gel. In order to identify the 14 KDa, the N-terminal amino acid sequence of 50 amino acids was determined in this study by automated Edman degradation. The sequence was the following:
VHLTDQELKSMNAIWSKVDDKHIGGEALARLLIVYPWTTQYFSSANNNAA. Extensive homology search for this sequence from the protein data banks using local alignment tool BLAST showed a major N-terminal amino acid sequence similarity with the members of the globin superfamily (52-74%) known to modulate the wound healing process, which explain the great effect of 14 KDa peptide in this process. In addition, we have sequenced the N-terminal of 10 amino acids of the doublet band of 14 KDa by automated Edman degradation. Both bands produced an identical N-terminal sequence (VHLTDQELKS).
In this study, we report the identification of a new wound healing peptide in amphibians, which have unique primary structure, which can be classify as a member of the globin superfamily, and we are currently investigating other pharmacological activities of peptides from the skin of R. esculenta which would be useful in designing peptides for therapeutic applications.  
المقدمة Introduction 
طورت البرمائيات نظاماً دفاعياً كيميائياً متميزاً، يتكون من ببتيدات مضادة للجراثيم وللمِكروبات الأخرى antimicrobial peptides (AMPs)، وببتيدات دوائية شافية للجروح wound healing peptides 1، وتُنتِج الضفادع عادة هذه الببتيدات الدوائية بكميات تكفي لتعيين تتالي الأحماض الأمينية والكشف عن الوظيفة الدوائية لها. وتعد سلسلة الأحماض الأمينية للنهاية الأمينية الطريقة التحليلية التي تقدم معظم المعلومات المتعلقة بالبروتينات اعتباراً من كميات صغيرة. إن تتالي عدد من الأحماض الأمينية يزيد على 10 يكفي لإعطاء معلومات وافية عن هوية هذا البروتين، بالمقارنة مع المعطيات المتوفرة في مصارف خاصة بالبروتينات، وتعيين في ما إذا كان قد جرى تنسيل أو سلسلة هذا البروتين مسبقاً. يختلف تسلسل الأحماض الأمينية لهذه الببتيدات بشكل واضح عند البرمائيات، إذ يحوي جلد الضفادع عدداً كبيراً منها، تختلف عن بعضها البعض بحجومها وبتتالي الأحماض الأمينية وبشحنتها وبألفتها للماء وببنيتها الفراغية ثلاثية الأبعاد وبطيف تأثيرها. كما تختلف هذه الببتيدات بين الضفادع حسب الفصيلة التي تنتمي لها، وجنسها، ونوعها وحتى تحت النوع 2.
جرى في السنوات الأخيرة تركيز الاهتمام على ببتيدات البرمائيات (ببتيدات مضادة للمكروبات، وببتيدات ذات فاعلية إلتئامية) كجزيئات آمنة يمكن أن تستعمل كمواد علاجية تحل محل بعض السيتوكينات وعوامل النمو، التي جرى البرهان على أن تطبيقها على الجروح يسرع التئامها. يعرف عن ببتيدات البرمائيات المضادة للمكروبات جميعها، بما فيها ببتيدات الجنس Rana التي عُينت حتى الآن، بأنها ذات بنية حلزونية، باستثناء عائلة tigerinins المشتقة من ضفدع R. tigerina التي تتصف ببنية الملاءة بيتا وتشكل بذلك أول الأمثلة على ببتيدات البرمائيات المضادة للمكروبات ذات البنية غير الحلزونية 3-6.
لقد قمنا في دراسات سابقة بعزل وتنقية ببتيد ذي كتلة جزيئية نسبية منخفضة (حوالي 14 كيلودالتون) من خلاصة جلد الضفدع R. esculenta، الذي يعد نوعاً سائداً في سورية. وجرى البرهان على أن لهذا الببتيد تأثيراً ملئماً للجروح، نتيجة تجارب أجريت على طرز حيوانية وبشرية. وتبين أنه بإجراء الرحلان الكهربائي SDS–PAGE على هلامة بتركيز 17%، تبدو عصابتان بروتينيتان تهاجران على الهلامة متجاورتان وفي المستوى نفسه، تبلغ الكتلة الجزيئية النسبية لكل منهما حوالي 14 كيلودالتون 7،8. لذلك جرى في هذا البحث متابعة دراسة هذا الببتيد بغية تعيين هويته من خلال سلسلة نهايته الأمينية، ومقارنة هذا التتالي مع المعطيات الموجودة في مصرف للبروتينات، صنفت فيه البروتينات وفقاً لدرجة التماثل في تتالي الأحماض الأمينية، لتعيين في ما إذا سبق وجرى تنسيل هذا الببتيد أو سلسلته، بهدف تصنيفه ضمن عائلة محددة من البروتينات، أو قد لا يبـدي هذا الببتيـد أي تشابه مع البروتيـنات المدروسـة، ومن ثم يعد بروتيناً جديداً.  
المواد والطرق Materials and Methods 
1. استخلاص البروتينات
استخلصت البروتينات الكلية من جلد ظهر الضفدع
R. esculenta باستخدام دارئة فسفاتية تحتوي على التريتون X-100 (Triton X-100) كمذيب عضوي، ومزيج من مثبطات إنزيمات البروتياز 8. وجرت معايرة البروتينات الكلية في الحلالة الخلوية باستخدام طريقة "برادفورد Bradford"، وحفظت هذه البروتينات في الدرجة -80 مئوية، أو جفدت لتركيزها وحفظها في الدرجة 4 مئوية، إلى حين استخدامها.
2. تنقية الببتيد 14 كيلودالتون
جرت تنقية الببتيد 14 كيلودالتون في هذه الدراسة على مرحلة واحدة فقط بتقنية الاستشراب السائل بتبادل الأيونات ion exchange chromatography على عمود Q-Sepharose حجمه 100 مل، بغية التخلص من أكبر قدر من البروتينات المرافقة للببتيد 14 كيلودالتون والحصول عليه بأعلى تركيز ممكن. وذلك بشكل مماثل للشروط التي استخدمت في تجاربنا السابقة8 لتجري سلسلته بطور صلب، أي محمولا على غشاء polyvinylidene (PVDF) (Bio-Rad). جُمِعَت الشُّدف fractions التي تحتوي تركيزاً مرتفعاً من الببتيد 14 كيلودالتون، ورُكزت باستعمال مراشح خاصة، ورُحِلَت على هلامة بولي أكريلاميد ذات التركيز 15%، بتأثير تيار كهربائي شدته 30 ميلي أمبير ولمدة ساعة واحدة فقط. ولفصل مكونات العصابة المضاعفة لهذا الببتيد، استخدمت هلامة الفصل ذات التركيز 17%، ورُحّلت العينات لمدة ساعة وخمس وأربعون دقيقة. وجرى إظهار العصابات البروتينية بتلوين الهلامة بأزرق الكومازي اللمّاع Coomassie Brilliant Blue R-250.
3. تحليل تتالي الأحماض الامينية Amino acid sequence analysis
نقلت البروتينات، بعد فصلها على هلامة بولي أكريلاميد كهربائياً وفي الوسط السائل إلى غشاء polyvinylidene (PVDF) (Bio-Rad) في دارئة تريس غليسين ثنائي الفلورايد tris glycine difluoride buffer تتكون من 2.21 غرام 3-(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid (CAPS) و 0.37 غ SDS و100 مل من الميثانول وكمية كافية من الماء المقطر لتحضير لتر واحد، وبتطبيق تيار شدته 300 ميلي أمبير ولمدة 30 دقيقة بدرجة حرارة 4 مئوية. لُوِّنَ الغشاء بملون Amido Black، ثم غُسل بمحلول ميثانول تركيزه 50% مدة 10 دقائق، وقُصَت عصابة الببتيد 14 كيلودالتون المفردة والمضاعفة من الغشاء، وغسلت بالماء بشكل جيد لإزالة الملون والأملاح وجففت. سُلسِلَت البروتينات في تجارب منفصلة بتفاعل تدرك "إدمان" المتسلسل gas phase Edman’s sequential degradation reaction in ABI’s (Applied Biosystems Inc.) باستخدام نظام سلسلة البروتين 476 Protein Sequence System وباستخدام المواد الكيميائية الخاصة بتدرك "إدمان" للنهاية الأمينية للبروتين الذي يعتمد على الفصل المتسلسل لثمالات الأحماض الأمينية من النهاية الأمينية للبروتين، وتحديد هوية كل حمض أميني بتقنية HPLC معكوسة الطور reverse-phase HPLC. جرت برمجة الجهاز لإنجاز التفاعل للعديد من الدورات في التجارب المختلفة وتراوحت بين 10 و 50 دورة. وجرى في كل تجربة مقارنة المنحنيات البيانية للـ HPLC الخاصة بـ phenylthiohydanation-amino acid (PTH-AA) الناتجة عن كل دورة مع مخطط مزيج PTH-AA المعياري. وجرى تحديد PTH-AA باستخدام برنامج خاصApplied Biosytems Model 140 PTH Analyzer and a Model 785A Programmable detector set بعد قياس الامتصاصية بموجة طولها 269 نانومتر. تجدر الإشارة إلى أن الاختصارات الخاصة السابقة بثمالات الأحماض الأمينية هي كالتالي: V(Val), Valine; H(His), Histidine; L(Leu), Leucine; T(Thr), Threonine; D(Asp), Aspartate; Q(Gln), Glutamine; E(Glu), Glutamate; K(Lys), Lysine; S(Ser), serine; M(Met), Methionine; N(Asn), Asparagine; A(Ala), Alanine; I(Ile), Isoleucine; W(Trp), Tryptophan; G(Gly), Glycine; R(Arg), Arginine; F(Phe), Phenylalanine ; Y(Tyr), Tyrosine; P(Pro), Proline; C(Cys) Cysteine. (x, any amino acid residue; B, Lys or Arg; Q, Gln; P, Pro)
4. الدراسة في السِليكون in silico
 جرى إدخال تتالي الأحماض الأمينية الناتجة عن عملية سلسلة الببتيد 14 كيلودالتون (10، و 20، و 30، و 50 ثمالة حمض أميني) داخل المعطيات المتوفرة في مصارف خاصة بالبروتينات، بالاستعانة بالموقع الالكتروني http://www.ncbi.nlm.nih.gov/NCBI_Blast، واستخدم برنامج يسمىBasic Local Alignment Search tool (BLAST)، الذي يحوي المعطيات جميعها الخاصة بالبروتينات المدروسة حتى الآن، وجرت مقارنة هذا التتالي مع التتاليات الخاصة بالبروتينات المعروفة التي تمتلك تتالياً مماثلاً أو قريباً منه. تجدر الإشارة إلى أنه استخدمت، في تجارب منفصلة، عينات مجفدة للخلاصة البروتينية لجلد ضفدع R. esculenta حُلَّت في الماء المقطر، وعينات استُخلِصَت وجرى العمل عليها مباشرة وفي 3 تجارب كاملة مكررة، وجرى الحصول على نتائج متماثلة.  
النتائج Results 
1. تنقية الببتيد 14 كيلودالتون
للحصول على تركيز مرتفع من الببتيد 14 كيلودالتون، بغية سلسلته، جُمِعَت المكونات البروتينية التي تحوي هذا الببتيد، ورُكِزَت، وفُصِلَت على هلامة بولي أكريلاميد ذات التركيز 15% وبتطبيق تيار شدته 30 ميلي أمبير لمدة ساعة واحدة فقط، فحصلنا على عصابة مفردة ذات تركيز مرتفع كتلتها الجزيئية النسبية 14 كيلودالتون (الشكل 1، أ). ولدى الترحيل على هلامة بولي أكريلاميد ذات التركيز 17% ولكن خلال 1 ساعة و 45 دقيقة، حصلنا على عصابتين بروتينيتين هاجرتا متجاورتين وفي المستوى نفسه، تبلغ الكتلة الجزيئية النسبية لكل منهما حوالي 14 كيلودالتون (الشكل 1، ب).  
 
2. سلسلة النهاية الأمينية للببتيد 14 كيلودالتون

1 .2. سلسلة النهاية الأمينية للعصابة المفردة للببتيد 14 كيلودالتون
جرى في تجارب مختلفة سلسة أعداد متباينة من الأحماض الأمينية (10 و 20 و 30 و 50 ثمالة حمض أميني) من النهاية الأمينية للببتيد 14 كيلودالتون باستخدام تفاعل تدرك "إدمان" المتسلسل، الذي يعتمد على الفصل المتسلسل لثمالات الأحماض الأمينية من النهاية الأمينية للبروتين وتحديد هوية كل حمض أميني بتقنية الاسْتِشْرابُ السَّائِلُ الرَّفيعُ الإِنْجَاز بالطور العكوس reverse-phase HPLC، حيث يعين تتالي ثمالات الأحماض الأمينية بالاعتماد على الحمض الأميني ذي التركيز الأعلى في كل دورة (الشكل 2). بتحليل نتائج المنحنيات البيانية للـ HPLC الناتجة عن كل دورة، حصلنا نتيجة سلسلة الأعداد المتباينة من ثمالات الأحماض الأمينية، ولعينات جرى تحضيرها في تجارب مختلفة، على التتالي نفسه للنهاية الأمينية. ويبين الشكل 3، تتالي ثمالات الأحماض الأمينية في النهاية الأمينية لعشرين وثلاثين وخمسين ثمالة حمض أميني.

2 .2. سلسلة النهاية الأمينية للعصابة المضاعفة للببتيد 14 كيلودالتون
عُين، وبشكل منفصل، تتالي10 ثمالات حمض أميني للنهاية الأمينية لكل من عصابتي الببتيد 14 كيلودالتون، ويوضح الشكل 6 تسلسل الأحماض الأمينية للعصابة العلوية (الشكل 4، أ) والسفلية (الشكل 4، ب) للببتيد 14 كيلودالتون. بَيَّنَ تحليل النتائج أن تتالي ثمالات الأحماض الأمينية لكل من العصابتين هو VHLTDQELKS، مما يؤكد أن العصابتين تعودان للببتيد نفسه.  

3. دراسة في السِليكون in silico لتوصيف الببتيد 14 كيلودالتون
بَيَّن البحث المكثف، باستخدام برنامج BLAST، تماثل تتالي ثمالات الأحماض الأمينية (50 ثمالة) للببتيد 14 كيلودالتون مع عدد كبير من البروتينات المدروسة (619،036 ، 16تتالياً) والمصنفة ضمن عائلات في مصارف خاصة بالبروتينات وذلك وفقاً لدرجة التماثل في تتالي الأحماض الأمينية، وجود نسبة للتماثل مع عدد كبير من البروتينات التي تنتمي إلى فوق العائلة الشبيهة بالغلوبين globin-like superfamily (الشكل 5).
تراوحت نسبة التماثل بين 52-74%، وكانت أعلى نسبة للتماثل مع السلسلة بيتا-2 لهيموغلوبين ضفدع Telmatobius peruvianus (Peru water frog) (145 ثمالة حمض أميني)، ونبين في ما يلي مقارنة لتتالي ثمالات الأحماض الأمينية (1-50 ثمالة حمض أميني) للببتيد 14 كيلودالتون (Query) والتتالي العائد لثمالات الأحماض الأمينية (1-50) للسلسلة بيتا-2 لهيموغلوبين هذا النوع من الضفادع (Sbjct) في النهاية الأمينية لكل منهما. لقد أظهرت النتائج تماثل هاتين السلسلتين الببتيديتين في 37 حمضاً أمينياً، واختلفتا في 13 ثمالة حمض أميني، وبالنتيجة بلغت نسبة التماثل 74%. 		 






LOCUS HBB2-TELPE 145 aa linear VRT 05-OCT-2010
DEFINITION RecName: Full=Hemoglobin subunit beta-2; AltName:
Full=Beta-2-globin; AltName: Full=Hemoglobin beta-2 chain.
 
SOURCE Telmatobius peruvianus (Peru water frog) 
 
Score = 81.6 bits (200),Expect=2e-19,Method:Compositional matrix adjust. 
 Identities = 37/50 (74%), Positives = 43/50 (86%), Gaps = 0/50 (0%)
 
Query 1
VHLTDQELKSMNAIWSKVDDKHIGGEALARLLIVYPWTTQYFSSANNNAA 50
VHLTDQE+K +NAIWSKVD K+ GGEALARLLIVYPWT +YFS+ N A+
Sbjct 1 
VHLTDQEIKYINAIWSKVDYKQVGGEALARLLIVYPWTQRYFSTFGNLAS 50

وبما أن الببتيد 14 كيلودالتون استخلص من جلد الضفدع R. esculenta ، فلقد جرت مقارنة تتالي الأحماض الأمينية في النهاية الأمينية للببتيد 14 كيلودالتون 11) - 47 ) (Query ) مع التتالي في النهاية الأمينية للسلسلة بيتا لهيموغلوبين هذا النوع من الضفادع ( 5 - 41 ) (Sbjct )، فظهرت نسبة من التماثل قدرها 59 % فقط. 

LOCUS HBB_RANES 140 aa linear VRT 05-OCT-2010
DEFINITION RecName: Full=Hemoglobin subunit beta; AltName: Full=Beta-globin; AltName: Full=Hemoglobin beta chain. 
SOURCE Rana esculenta (edible frog)
Score= 55.1 bits(131),Expect = 1e-13, Method: Compositional matrix adjust.
 Identities = 22/37 (59%), Positives = 28/37 (76%), Gaps = 0/37 (0%)
Query  11   MNAIWSKVDDKHIGGEALARLLIVYPWTTQYFSSANN    47
                     ++ W  KVD               IGGEALARLL+VYPWT  +YF++      N
Sbjct    5   VSGFWGKVDAHKIGGEALARLLVVYPWTQRYFTTFGN    41

تؤكد نتائج السلسلة أن الببتيد 14 كيلودالتون المستخلص من جلد ضفدع R. esculenta والذي يمتلك فاعلية ملئمة للجروح، هو ببتيد جديد لم يسبق أن جرت سلسلته ودراسته، ويمكن تصنيفه ضمن فوق العائلة الشبيهة بالغلوبين.

المناقشة Discussion 
إن استخدام الجزيئات البيولوجية المعزولة من الإنسان أو من الأنواع الأخرى قد تجد تطبيقات سريرية مستقبلية كثيرة. وتُعَد هذه الدراسة الأولى من نوعها لعزل وتوصيف ببتيدات ذات فاعلية في التئام الجروح مستخلصة من جلد ضفدع النوع R. esculenta. وتشكل عوامل النمو مرشحاً جيداً أيضاً لأنها تنتج بشكل طبيعي من قبل الخلايا، وتؤثر في خلايا تتدخل في ترميم النسج (الصفيحات الدموية والبلاعم والخلايا البطانية والخلايا الكيراتينية والأرومة الليفية). ولقد أظهرت الدراسات السريرية أن تطبيق عامل نمو الأرومة الليفية fibroblast growth factor (FGF) على التقرحات المزمنة والتقرحات عند مرضى السكري يسرع، وبشكل ذي معنى، ترميمها. إن دور السيتوكينات في تسريع التئام الجروح يعد أساسياً في الحالات التي تحتاج إلى استشفاء طويل الأمد أو عند الكهول، وكذلك الجروح التي تنتج عن حوادث طارئة، وفي حالات الحروق9. لذلك فإن استخدام السيتوكينات والإنزيمات في معالجة الجروح يمكن أن يؤدي إلى نتائج جيدة. كما تبين أن استخدام المعالجة الجينية بجينات مرَمِّزَة لعوامل النمو و/أو السيتوكينات بشكل مستقل أو مترافقاً مع الخلايا الجذعية قد يشكل أيضاً وسيلة جديدة لمعالجة الجروح المقاومة للعلاج بالطرق الأخرى التقليدية 10. ولقد قمنا في دراسة سابقة بعزل ببتيد منخفض الكتلة الجزيئية النسبية (14 كيلودالتون)، مستخلص من جلد الضفدع R. esculenta، وجرى البرهان على دوره في تسريع التئام جروح تجريبية وطبيعية على طرز حيوانية وعلى الإنسان؛ فإلتئام الجرح المعالج بهذا الببتيد كان يتم في خلال نصف المدة اللازمة لالتئام الجرح الشاهد 7،8.
تُنتِج الضفادع عادة الببتيدات الدوائية بكميات قليلة ولكنها تكفي لتعيين تتالي الأحماض الامينية والكشف عن الوظيفة الدوائية لها. وتعد سلسلة النهاية الأمينية للبروتينات الطريقة التحليلية التي تقدم معظم المعلومات المتعلقة بها. فلقد جرى تصنيف الببتيدات المضادة للمكروبات ضمن عائلات، بالاعتماد على التماثل في تتالي الأحماض الأمينية11. إن سلسلة 10 أحماض أمينية أو أكثر يكفي لإعطاء معلومات وافية عن هوية البروتين، للبحث في المعطيات المتوفرة في مصارف خاصة بالبروتينات وتحديد في ما إذا كان قد جرى تنسيل أو سلسلة هذا البروتين مسبقاً؛ حيث يمكن الإفادة من هذه المعطيات لتعيين الجين المسؤولة عن تركيب هذا البروتين، كي يجري لاحقاً دراسة إمكان تحضيره باستخدام تقنية DNA المأشوب. ولقد جرى في هذه الدراسة تعيين تسلسل 50 ثمالة حمض أميني للنهاية الأمينية للببتيد 14 كيلودالتون، وجرت مقارنتها مع المعطيات الخاصة بالبروتينات، باستخدام برنامج BLAST الذي صنفت فيه البروتينات وفقاً لدرجة التماثل في تسلسل الأحماض الأمينية. ولقد تبين أن تتالي الأحماض الأمينية في النهاية الأمينية لهذا الببتيد الملئم للجروح يبدي نسباً من التشابه مع تتالي الأحماض الأمينية للنهاية الأمينية للبروتينات التي تنتمي لفوق العائلة الشبيهة بالغلوبين globin-like superfamily، تراوحت بين 52-74%. وكانت أعلى نسبة للتشابه هي مع السلسلة بيتا-2 لهيموغلوبين ضفدع Telmatobius peruvianus (Peru water frog) (74%). وبما أن الببتيد 14 كيلودالتون استخلص من ضفدع R. esculenta؛ فلقد جرت مقارنة التتالي الخاص بهذا الببتيد مع التتالي المقابل للسلسلة بيتا لهيموغلوبين هذا النوع من الضفادع؛ فأبدى نسبة من التماثل قدرها 59%، مما يؤكد أن هذا الببتيد ليس هيموغلوبين هذا الضفدع. إن هذه النسبة المرتفعة للتشابه مع أفراد العائلة الشبيهة بالغلوبين تفسر الوظيفة الملئمة للجرح التي يتميز بها الببتيد 14 كيلودالتون، فقد يكون لهذا الببتيد دور شبيه بدور الغلوبين في تعديل الوظائف الخلوية خلال سيرورة ترميم الجرح؛ حيث بينت الدراسة التي قام بها Yoshida E. وزملاؤه، أن الغلوبين يحرض الأرومات الليفية البشرية على إنتاج ما يسمى بمُنَشِّطُ البلازمينوجين plasminogen activator الذي يؤدي دوراً هاماً في سيرورة التئام الجرح 12. وبرهنت دراسة أخرى على دور emodin، الذي يمثل أحد الأفراد التي تنتمي إلى عائلة الغلوبينات، في التنظيم الإيجابي للتعبير عن كل من urokinase plasminogen activator، وplasminogen activator inhibitor-1 في الأرومات البشرية، فيساهم بذلك في المراحل الأولى من سيرورة التئام الجروح 13. وتبين أن السيتوغلوبين cytoglobin، الذي يبدي درجة عالية من التتاليات المحفوظة في الغلوبينات عند الفقاريات وينتمي إلى فوق عائلة الغلوبينات يتصف بدور هام في سيرورة التئام الجروح من خلال تحريض تركيب الكولاجين، وتليف النسج tissue fibrosis 14-18.
وبالنظر إلى النسبة العالية من التشابه في تتالي الأحماض الأمينية في النهاية الأمينية، وفي الكتلة الجزيئية النسبية التي يبديها الببتيد 14 كيلودالتون مع البروتينات التي تنتمي إلى فوق العائلة الشبيهة بالغلوبين التي تتكون من عائلة الغلوبين globin، وعائلة الفيكوسيانين phycocyanin، وعائلة الهيموغلوبين المبتورة truncated hemoglobin (Matthew J. Blades K. 2005)، يبدو أن الببتيد 14 كيلودالتون يقوم بدوره في سيرورة التئام الجروح من خلال دور شبيه بأفراد هذه العائلة. ومن المستبعد أن يقوم بهذا الدور من خلال فاعلية مضادة للمكروبات المستخلصة من جلد الضفادع، خاصة وأنه وبنتيجة البحث المكثف مع عدد كبير جداً من المعطيات المتوفرة، باستعمال برنامج BLAST، لم يبد هذا الببتيد أي تشابه مع الببتيدات المضادة للمكروبات المدروسة. الأمر الذي يقترح التوصل إلى ببتيد جديد ملئم للجروح لم يسبق أن جرت دراسته وسلسلته يمكن تصنيفة ضمن فوق العائلة الشبيهة بالغلوبين، ويبقى من المهم دراسة آلية تأثير الببتيد 14 كيلودالتون في سيرورة التئام الجروح التي جرى البرهان عليها.
كما جرى في هذه الدراسة فصل عصابتين بروتينيتين تهاجران متجاورتين وفي المستوى نفسه، تبلغ الكتلة الجزيئية النسبية لكل منهما حوالي 14 كيلودالتون. وعُين تتالي 10 ثمالات حمض أميني للنهاية الأمينية لكل من العصابتين، وتبين أن تتالي ثمالات الأحماض الأمينية لكل من العصابتين هو VHLTDQELKS، مما يؤكد أن العصابتين تعودان للببتيد نفسه، وقد يعود تماثل تتالي الأحماض الأمينية في النهاية الأمينية والاختلاف في الهجرة على هلامة بولي أكريلاميد إلى وجود شكلين مختلفين لهذا الببتيد. وبشكل عام توجد البروتينات بأشكال مختلفة تتضمن الأشكال التي تحوي زمراً كيميائية وظيفية مختلفة، أو تعديلات أخرى تجري بعد الترجمة. إن بعض التعديلات مثل فسفرة البروتين أو ربط السلاسل السكرية إليه يمكن أن تؤدي إلى هجرة للببتيد بسرعة تقل عن سرعة هجرة البروتينات نفسها المنزوعة السكاكر deglycosylated protein أوالتي بُتِرَت نهايتها الكربوكسيلية. وقد يشكل الببتيد 14 كيلودالتون أحد البروتينات المرتبطة إلى تكتلات19، ففي دراسة سابقة، ولدى فصل الببتيد 14 كيلودالتون بتقنية الاستشراب بالترشيح على الهلامة، أظهرت نتائجنا وجود الببتيد 14 كيلودالتون في الأنابيب الثلاث الأولى التي تشكل مكونات القمة الأولى مترافقاً مع بروتينات أخرى مرتفعة الكتلة الجزيئية النسبية، على الرغم من أن مبدأ الفصل بهذه التقنية يقضي بأن تغادر العمود في الأنابيب الأولى البروتينات ذات الكتلة الجزيئية النسبية المرتفعة لأنها تمر بين حبيبات الهلامة، في حين تغادر البروتينات منخفضة الكتلة الجزيئية النسبية في الأنابيب الأخيرة8. يشكل هذا السلوك غير العادي للببتيد خلال عملية الفصل بالاستشراب بالترشيح على الهلامة أيضاً مؤشراً لوجود شكلين مختلفين للببتيد، أحدهما مفرز والآخر يرتبط إلى الغشاء السيتوبلاسمي. وتتميز بعض البروتينات بوجود أشكالٍ مرتبطة إلى الشحوم والأغشية الهيولية.  
الاستنتاجات Conclusions 
تشير هذه الدراسة إلى أن جلد الضفدع يشكل مصدراً للعديد من الببتيدات ذات الفعاليات الدوائية المختلفة، ومن ثم يمكن أن تشكل الببتيدات الملئمة للجروح المستخلصة منه بديلاً آمناً عن عوامل النمو والسيتوكينات وبكلفة منخفضة، وذلك لما تتميز به هذه الببتيدات من فعاليات مميزة وكتل جزيئية نسبية منخفضة، الأمر الذي يسمح بتحضير هذه الببتيدات باستخدام تقنية DNA المأشوب. فمن المعلوم أن معظم الببتيدات المضادة للمكروبات والببتيدات الدوائية الطبيعية تنتج بكميات قليلة، لذلك فإن إنتاجها باستخدام التقنيات الجزيئية يقدم طرقاً بديلة لإنتاج هذه الببتيدات بكميات صيدلانية بغية استعمالها في المعالجات الدوائية السريعة ومنخفضة الكلفة، خاصة وأن الببتيد 14 كيلودالتون يتميز بفاعلية واضحة في إلتئام الجرح. كما يتوجب إجراء دراسات أخرى لتعيين آلية تأثير الببتيد 14 كيلودالتون في سيرورة الإلتئام.  
المراجع References 
1-Clarke B.T.
The natural history of amphibian skin secretions, their normal functioning and potential medical applications.
Biol Rev Camb Philos Soc; 72, 365-379, 1997.

2-Boniotto M. et al.
A study of host defence peptide beta-defensin 3 in primates.
Biochem J; 374, 707-714, 2003.
3-Bevins C.L. and Zasloff M.
Peptides from frog skin.
Annu Rev Biochem; 59, 395-414, 1990.
4-Barra D. and Simmaco M.
Amphibian skin: a promising resource for antimicrobial peptides.
Trends Biotechnol; 13, 205-209, 1995.
5-Saberwal G. and Nagaraj R.
Cell-lytic and antibacterial peptides
that act by perturbing the barrier function of membranes: facets of their conformational features, structure-function correlations and membrane-perturbing abilities.
Biochim Biophys Acta, 1197, 109-131, 1994.
6-Sitaram N. and Nagaraj R.
Interaction of antimicrobial peptides with biological and model membranes: structural and charge requirements for activity.
Biochim Biophys Acta, 1462, 29-54, 1999.
7-Rizk H.K; Massouh L. and Al-Okla S.
A 14 KDa Wound-Healing Peptide from the Skin of the Frog Rana esculenta.
Arab Journal of Pharmaceutical Sciences, in press.
8-Al-Okla S.
Further Purification of the 14 KDa Wound-Healing Peptide from the Skin of the Frog Rana esculenta.
the Journal of Clinical Laboratory, in press.
9-Blumenfeld I; Gaspar R; Laufer D. and Livne E.
Enhancement of toluidine blue staining by transforming growth factor-beta, insulin-like growth factor and growth hormone in the temporomandibular joint of aged mice.
Cells Tissues Organs, 167, 121-129, 2000.
10-Branski L.K; Gauglitz G.G; Herndon D.N. and Jeschke M.G.
A review of gene and stem cell therapy in cutaneous wound healing.
Burns, 35, 171-180, 2009.
11-Conlon J.M.
Reflections on a systematic
nomenclature for antimicrobial peptides from the skins of frogs of the family Ranidae.
Peptides, 29, 1815-1819, 2008.
12-Yoshida E; Ohmura S; Sugiki M; Anai K. and Maruyama M.
A novel function of extraerythrocytic hemoglobin: identification of globin as a stimulant of plasminogen activator biosynthesis in human fibroblasts.
Thromb Haemost, 86, 1521-1527, 2001.
13-Radha K.S; Madhyastha H.K; Nakajima Y; Omura S. and Maruyama M.
Emodin upregulates urokinase plasminogen activator, plasminogen activator inhibitor-1 and promotes wound healing in human fibroblasts.
Vascul Pharmacol; 48, 184-190, 2008.
14-Nakatani, K. et al.
Cytoglobin/STAP, its unique localization in splanchnic fibroblast-like cells and function in organ fibrogenesis.
Lab Invest; 84, 91-101, 2004.
15-Schmidt, M. et al.
Cytoglobin is a respiratory protein in connective tissue and neurons, which is up-regulated by hypoxia.
J Biol Chem; 279, 8063-8069, 2004.
16-Mimura, I. et al.
Cytoglobin, a novel globin, plays an antifibrotic role in the kidney.
Am J Physiol Renal Physiol; 299, F1120-1133, 2010.
17-Schmidt M; Laufs, T; Reuss, S; Hankeln, T. and Burmester, T.
Divergent distribution of cytoglobin and neuroglobin in the murine eye.
Neurosci Lett; 374, 207-211, 2005.
18-Xu R. et al.
Cytoglobin overexpression protects against damage-induced fibrosis.
Mol Ther; 13, 1093-1100, 2006.
19-Dassouli A. et al.
76 and 14 kDa polypeptides, two major components released from amphibian urinary bladder epithelium. Localization and potential role.
Biol Cell; 66, 131-143, 1989.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
المجلد 6 , العدد 7 , ذو القعدة 1433 - تشرين أول (أكتوبر) 2012

 
 
SCLA