بحث في أعداد المجلة الجملة   المؤلف

المجلد 6 , العدد 7 , ذو القعدة 1433 - تشرين أول (أكتوبر) 2012   العلاقة بين شُذُوذات النطاف الصِبْغِيّة والنطاف غير السوية مورفولوجياً لدى عينة من المرضى السوريين المصابين بقِلَّةُ النِّطاف الوخيمة والمعتدلة The relationship between sperm chromosomal abnormalities and morphologically abnormal sperm in sample of Syrian patients with moderate and severe oligozoospermia هلا أيوبي1، سعاد العقلة1، علي العجلوني2، و سعد نانو2 AYOUBI H.1, AL-OKLA S.1, AL-AJLOUNI A.2 and NANO S.2 1 كلية العلوم، 2 كلية الطب، جامعة دمشق 1Faculty of Sciences, 2Faculty of Medicine, Damascus University الملخص Abstract تُعد طريقة حقن النطفة داخِلَ الهَيولَى ICSIأحد أهم الطرق المستخدمة لحالات العقم الذكري، خاصة عندما يكون العقم مرتبطاً بمتثابتات مَنِيّ شاذة. ولقد أظهرت دراسات عدة تواتراً زائداً لشذوذات صبغية في نطاف رجال مصابين بحالات معينة من العقم ويخضعون لـ ICSI. لذلك جرت المحاولة لإيجاد ما إذا كان وجود شذوذ مورفولوجي معين يمكن أن يكون مرتبطاً بشذوذ صبغي عددي معين لدى رجال عقيمين ولديهم تركيز نطاف منخفض (قلة نطاف وخيمة ومعتدلة). دُرس 23 رجلاً عقيماً مصاباً بقلة النطاف و 5 حالات شاهدة. جُمعت عينات المَنِيّ لتقييم المني والشذوذات الصبغية العددية للصبغيات 13 و 18 و 21 والصبغيين الجنسيين باستخدام تقنية التهجين التألقي في الموضع. وأظهرت النتائج وجود علاقة عكسية بين تركيز النطاف ومعدلات اخْتِلالُ الصِّيغَةِ الصِّبْغَيَّة للصبغيين 13 و21 والصبغيين الجنسيين. ولقد وجدت بعض الترابطات الضمنية للنسب المئوية للنِطاف مع تشوهات معينة وشذوذات صبغية خاصة، فلقد وجدنا أن الرؤوس المتطاولة ترتبط بتضاعف الصبغي 13، وكان الرأس الكبير مرتبطاً بتضاعف الصبغيين XY، كما يظهر عيب القطعة المتوسطة غير المنتظمة علاقة مع تضاعف الصبغي 21، وأخيراً ارتبط غياب الذيل مع حالات اخْتِلالُ الصِّيغَةِ الصِّبْغَيَّة للصبغيين الجنسيين (X وY). وفي الختام تقترح نتائجنا تجنب اختيار النطاف التي تحمل هذه الأنماط من الشذوذات المورفولوجية حين استخدام طريقة الـ ICSI، خاصةً لدى الأشخاص الذين يكون لديهم عدد النطاف الكلي منخفضاً جداً (عينات هذه الدراسة) وهي الحالات التي يصعب فيها إيجاد نطاف سوية مورفولوجياً. كما تؤكد على أهمية استخدام طريقة الـ FISH على النطاف، لكونها تعطي النسبة المئوية للشذوذات الصبغية في النطاف، وتظهر انتهاء صلاحية استخدام طريقة الـICSI لمرضى العقم، وفي حال عدم إمكان ذلك، ينبغي توجيه الأزواج الذين يعانون من العقم بسبب قلة النطاف الوخيمة والذين يخضعون للعلاج بـ ICSI لإجراء الاختبار الخاص بالتشخيص الوراثي قبل التعشيش PGD الذي يكشف اخْتِلالُ الصِّيغَة الصِّبْغَيَّة للصبغيات في الأجنة قبل نقلها إلى الرحم.   Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) technique is considered to be one of the most important methods which are used for infertility cases of men, especially when the infertility is correlated with abnormal semen parameters. Many studies show an increased frequency of chromosome abnormalities in the sperms of men with certain cases of infertility and undergoing ICSI. Trying to find weather the presence of a defined morphological abnormality of sperm can be related to a defined numerical chromosomal abnormality in infertile men with low sperm concentration (severe and mild oligozoospermia). 23 infertile men with oligozoospermia were studied and 5 control cases. Semen samples were collected for semen evaluation, and the numerical chromosomal abnormalities of the chromosomes 13, 18, 21, and sex chromosomes using the fluorescence in situ hybridization. These results showed the presence of a reverse correlation between the concentration of sperms and the aneuploidy rates of chromosomes 13, 21, and sex chromosomes. And some incorporeal correlations were found between the percentages of spermatozoa with specific malformations and particular chromosomal abnormalities, we found that the elongated heads correlate with the 13 Disomy, and the big head was related to the XY Disomy, the irregular middle piece defect shows relation with the 21 Disomy, and at last the absent tail correlated with the total aneuploidy cases of sex chromosomes (XY). In conclusion, our results suggest avoiding choosing sperms with such morphological abnormalities while using ICSI technique, especially in the persons whom they have a very low total count of sperm (the samples of this study) where it’s difficult to find morphologically normal sperms. And they insure the importance of using FISH technique on sperm, because it gives the percentage of chromosomal abnormalities in sperm, and shows the expiry of using ICSI technique for infertility patients, and in case this was not possible, advice the couples who suffer from infertility caused by severe oligozoospermia and undergoing ICSI to do the PGD test which explore the aneuploidy of chromosomes in the fetus before transfer it into the uterus.   المقدمة Introduction  تُعَد طريقة حقن النطفة داخل الهيولى Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) تقدماً ثورياً في مجال علاج حالات العقم الذكري، التي تشكل 50% تقريباً من حالات العقم بصورة عامة، وتتجاوز طريقة اختيار النطفة لإجراء هذه الطريقة العديد من خطوات الانتقاء التي تحدث عادة لإتمام عملية الإخصاب الطبيعي، ولذلك فهي قد تساهم في نقل الشذوذات الصبغية التي قد تتواجد في النطاف إلى الأجنة الناتجة عن الإخصاب 1، 2. تقسـم الشذوذات الصبغية التي قد تحملها النطاف إلى شذوذات صبغية بنيوية مثل الخبن deletion أو الإزفاء translocation أو الانقلاب inversions أو التضاعف duplication، أو شذوذات صبغية عددية تتضمن وجود خلل في عدد الصبغيات مثل حالات تعدد الصيغة الصبغية polyploidy (التي تحمل النطفة فيها عدداً مضاعفاً من الصبغيات كاملة) أو حالات اختلال الصيغة الصبغية Aneuploidy (التي تتضمن زيادة أو نقصاً في أحد الصبغيات)؛ وتنتج هذه الشذوذات الصبغية العددية عادة عن حدوث خلل أثناء الانقسام المنصف للمنسليات المنوية يؤدي إلى عدم افتراق الصبغيات. ولقد أثبتت العديد من الدراسات زيادة معدل الشذوذات الصبغية العددية في نطاف الذكور المصابين بالعقم بشكل عام والمرشحين للعلاج بطريقة الـ ICSI، على الرغم من امتلاكهم نَّمَطّاً نَّوَوِيّاً سوياً Normal Karyotype في خلاياهم الجسدية 1. يتطلب إجراء طريقة الـ ICSI دراسة المعايير المختلفة للمني (للسائل المنوي) والتي تتضمن كلاً من تركيز النطاف concentration وحركتها motility وشكلها morphology واختبار قدرة نفاذ النطاف sperm penetration test إلى البويضة وتطبيق تقنيات القُدْرَةُ التَّلْقيحِيَّة capacitation للنطاف n 3، ولكن تبقى المرحلة الأخيرة هي الأكثر أهمية لأنها تعتمد على انتقاء نطفة واحدة فقط تتميز بالمواصفات الأفضل وخاصة من حيث الشكل، إذ يجب أن تكون خالية من الشذوذات المورفولوجية التي قد تصيب أحد أجزائها. وبما أن الوظيفة الأساسية للنطفة هي نقل المعلومات الوراثية فمهما حاولنا اختصار الخطوات وتسهيلها لتحقيق الإخصاب، يبقى الهدف الأساسي هو إيصال هذه المعلومات بالشكل السوي الذي يضمن تطور أجنة سوية وراثياً. تُعَد تقنية التهجين التألقي في الموضع (FISH) fluorescent in situ hybridization من أهم الطرق التي تستعمل في الأبحاث لتحليل الصفات الوراثية الخلوية للنطاف 4؛ فهي الأكثر شيوعاً وفاعلية في تحديد نسبة الشذوذات الصبغية العددية في النطاف. استخدمت هذه التقنية منذ عام 1990 في العديد من الدراسات والأبحاث، حتى أن بعض الباحثين اقترح استعمالها في جميع حالات مرضى العقم الذكري المرشحين للخضوع للعلاج بتقنية الـ ICSI كتحليل متمم لدراسة التعداد والحركة والشكل 4. ولقد أثبتت العديد من الدراسات التي اعتمدت على استخدام تقنية الـ FISH لتحديد النسب المئوية لحالات الاختلال الصبغي وجود علاقة بين زيادة معدل ظهور حالات اختلال الصيغة الصبغية Aneuploidy في النطاف ووجود خلل في معايير السائل المنوي الأخرى؛ فمثلاً في الدراسة التي قام بها L. Bernardini عام 1997 والتي تضمنت 15 حالة عقم ذكري شديد (سواء في ما يتعلق بتركيز النطاف، أو حركتها أو أشكالها) ومقارنتها مع 3 حالات سوية لا تعاني من العقم، لوحظ أن نسب حالات الاختلال الصبغي في النطاف تزداد كلما تراجعت خواص المني (السائل المنوي)5. وجرى البرهان أيضاً على وجود هذه العلاقة العكسية عند مقارنة نسب حالات الاختلال الصبغي بين مرضى يعانون من ارتفاع في نسبة الإِمِّسَاخٌ النُطْفِيّ Teratozoospermia (عدد 10) وأفراد أسوياء (عدد 9) 6. وبمقارنة نسب الاختلال الصبغي للنطاف في ثلاث مجموعات من المرضى المصابين بقلة النطاف المعتدلة (عدد10 ) والمتوسطة (عدد 10) والشديدة (عدد 10)، جرى البرهان على أنه كلما قل تركيز النطاف ارتفع معدل حدوث حالات الاختلال الصبغي 2. برهنت معظم الدراسات التي تمت على حالات العقم الناتجة عن قلة النطاف والتي اعتمدت على تقنية الـ FISH على ارتفاع معدل الشذوذات الصبغية العددية بشكل عام في نطاف الرجال الذين يعانون من العقم بسبب قلة النطاف ويخضعون للعلاج بتقنية ICSI 2، إلا أن استعمال تقنية الـ FISH غير متاح في جميع المخابر بسبب الكلفة العالية لهذه التقنية التي ستشكل عبئاً مادياً إضافياً على المرضى الذين يخضعون للمعالجة بتقنية الـ ICSI، خاصة في حالات العقم الشديد. كما أنه لا يوجد إلى اليوم دراسات موثقة تشير بشكل حاسم إلى وجود علاقة بين أنماط محددة من الشذوذات المورفولوجية للنطاف وارتفاع معدل حالات التعدد الصبغي بصورة عامة، أو وجود خلل صبغي محدد. لذلك جرى في هذا البحث دراسة العلاقة بين النسبة المئوية للنطاف المشوهة مورفولوجياً بشكل عام و/ أو أنماط محددة من الشذوذات المورفولوجية المختلفة للنطاف مع الشذوذات الصبغية العددية لبعض الصبغيات في النطاف، لدى ذكور مصابين بقلة النطاف الشديدة والمتوسطة، وذلك بغية تحديد مدى ارتباط الصفات الشكلية للنطفة بحالة الصبغيات في النواة، والتوصل إلى طرق بديلة وناجعة وأقل كلفة تمكننا من اعتماد تشوه مورفولوجي معين للنطفة كمؤشر أولي على وجود خلل وراثي، لتجنب استخدامها لإلقاح البويضة وإتمام الإخصاب. وبالتالي فإن إثبات وجود مثل هذه العلاقة يحسن من طريقة اختيار النطفة المناسبة لإجراء تقنية ICSI ويقلل، قدر الإمكان، من فرص حدوث فشل في التعشيش مما يزيد من نسب حدوث الحمل واستمراره وولادة أطفال أسوياء لا يحملون أي خلل وراثي.   المواد والطرق Materials and Methods  عينات المرضى جرى جمع عينات البحث، خلال الفترة الواقعة بين 2008 و2010، من مراجعين لمختبر الذكورة في شعبة العقم والإخصاب المساعد طبياً (طفل الأنبوب) في مستشفى التوليد الجامعي، جميعهم راجعوا للعلاج بإحدى طرق الإخصاب المُسَاعَد طبياً. جُمعت عينات المني (السائل المنوي) من 15 رجلاً يعانون من حالات عقم ناتجة عن قلة النطاف الشديدة (عدد النطاف أقل من مليون نطفة/ مل)، و8 رجال يعانون من حالات عقم ناتجة عن قلة النطاف المتوسطة (يتراوح عدد النطاف بين 1-9 مليون نطفة/مل). وجرى تقييم السائل المنوي بإجراء فحص السائل المنوي spermogram والفحص الخلوي للسائل المنوي spermocytogram. وجرت مقارنة النتائج مع نتائج 5 عينات شاهدة أُخِذَت من أفراد أسوياء (كل معايير السائل المنوي لديهم طبيعية من حيث التركيز والشكل والحركة). كما جرى تطبيق تقنية الـ FISH على النطاف للكشف عن الشذوذات الصبغية العددية، وأُخِذَت عينات من الدم المحيطي من الأفراد العقيمين لدراسة الصيغة الصبغية والتأكد من أنهم أشخاص ذوي صيغة صبغية سوية. فحص السائل المنوي فُحِصَت عينات السائل المنوي بعد حوالي 30-60 دقيقة من جمعها ووضعها في درجة حرارة 37ْم؛ حيث دُرِسَت بعض الخصائص الفيزيائية الكيميائية كحجم السائل المنوي، ولونه، ولزوجته، ودرجة حموضته pH، وعُين عدد النطاف في الميلي لتر من السائل المنوي، وجرت مقارنة النتائج مع القيم الطبيعية المعتمدة من قبل منظمة الصحة العالمية WHO 7 (الجدول 1). الفحص الخلوي للسائل المنوي لدراسة الشذوذات المورفولوجية للنطاف، أضيف 1500مكرولتر من وسط غسيل النطاف (FertiPro, Belgium) إلى 500 مكرولتر من عينة السائل المنوي، ونُبِذ المزيج بسرعة 1700 دورة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة وفي درجة حرارة 25ْم، أُذيبت الرُسَابَة في وسط الغسل. وجرى تحضير لطاخة، ثبتت ولونت باستخدام عتيدة خاصة بتلوين النطاف (Morphology staining kit FertiPro, Belgium)، ثم درست أشكال النطاف باستخدام المجهر الضوئي بتكبير 1000 مرة، وصنفت أنماط الشذوذات حسب معاييرDavid وزملائه عام 1975 والمعدلة من قبلAuger & Eustache عام 20008، في حوالي 13 مجموعة؛ تعود سبعة منها إلى تشوهات في الرأس، وتشوهان في القطعة المتوسطة، وأربعة تشوهات في السوط. تتضمن تشوهات الرأس اختلافاً في الحجم: فقد يكون الرأس متطاولاً، أو مستدقاً، أو صغيراً، أو كبيراً، ويمكن أن تكون النطفة برأسين، أو تبدي غياباً في الجُسيم الطرفي acrosome أو تبدلاً في حجمه وفي محيطه، وقد تتمركز التشوهات في قاعدة رأس النطفة، أما تشوهات القطعة المتوسطة فقد تتمثل بوجود بقايا هيولية تحيط الرأس، أو تكون هذه القطعة مستدقة، أو أن تشكل زاوية مع قاعدة الرأس. ويمكن أن تبدو النطفة بسوط غير منتظم العرض أو قصير وقد يغيب بشكل كامل، أو تكون النطفة مضاعفة السوط وقد ينحني السوط في بعض الحالات. كما جرى حساب النسب المئوية للنطاف الطبيعية والمشوهة وحساب النسب المئوية الخاصة بكل نمط من التشوهات الشكلية، في كل من الرأس والقطعة المتوسطة والسوط. ولقد أثبتت الدراسات أن نسب نجاح عمليات الإخصاب المساعد تزيد عندما تكون نسبة النطاف طبيعية الشكل أكبر من 14، كما أن أحد أسباب استخدام تقنية الـ ICSI هو أن تكون نسبة النطاف المشوهة أقل 5%. ولذلك اعتبرت الحالة الطبيعية في دراستنا هي أن لا تقل نسبة النطاف طبيعية الشكل فيها عن 14% وذلك حسب معايير كروجر، نظراً لأن جميع العينات المستخدمة في الدراسة عادت لمرضى عقم راجعوا للعلاج بإحدى تقنيات الإخصاب المُسَاعَد طبياً 6، بينما صنفت التشوهات الشكلية المدروسة كما ذكرنا حسب تصنيف David 8. فحص الصيغة الصبغية (الطابع النووي) استنبتت خلايا الدم (800 مكرولتر من الدم) في أنبوب مخروطي يحوي وسط استنبات كامل (Chromosome medium B) لتحريض انقسام الكريات البيض وذلك في حاضنة في الدرجة 37ْم، وبعد 72 ساعة، أُضيف 75 مكرولتر من الكالسميد لإيقاف انقسام الخلايا. نُبذ الناتج وحُلَت الخلايا بإضافة محلول الصدمة الملحي، ثم أضيف محلول التثبيت البارد (محلول كارنوى) وجففت الصفائح لليلة كاملة بدرجة حرارة 65ْم، ولونت بملون غيمزا، ودرست باستخدام مجهر ضوئي مزود ببرنامج حاسوبي خاص بدراسة الصيغة الصبغية للتأكد من سلامة الصيغة الصبغية لكل عينة والتي يجب أن تكون 46, XY. الفحص الوراثي للنطاف باستخدام تقنية FISH اتبعت تقنية التهجين التألقي في الموقع الخاصة بالنطاف والموصى بها من قبل شركةKreatech الهولندية المتخصصة في صناعة الكواشف والمواد الخاصة بالتحاليل الخلوية. نُبِذَت عينة المني (السائل المنوي) بسرعة 1750 دورة/ دقيقة لمدة 5 دقائق وفي درجة حرارة 25ْم، وغُسِلَت الرُسَابَة 3 مرات بإضافة 5 مل من دارئة ملحية فسفاتية PBS ذات درجة pH قيمتها 7.2، وأزيل السائل الطافي بالنبذ في الشروط نفسها، وثبتت النطاف بإضافة 1 مل من محلول التثبيت (بنسبة 1:3 حَمْضُ الأسيتيك الثلجي/ الميثانول)، وفرشت على صفيحة مجهرية، عولجت العينات بمحلول ماءات الصوديوم، وغُسلت مرتين بمحلول SSC 2X، ثم مررت على محاليل غولية (ايثانول) بتراكيز متزايدة 70، 90، 100 وذلك لمدة دقيقة في كل محلول وفي درجة حرارة الغرفة. غُسلت الصفائح بمحلول SSC 2X + توين 20، ثم جففت بتعريضها لدرجات حرارة متزايدة 70، 80، 95ْم، وأضيف 10 مكرولتر من المسابير الخاصة بدراسة كل من الصبغيات 13 و21 و18 والصبغيين الجنسيين X وY (UK Cytocell, )، وجرت تغطية الصفائح بسواتر. ولفصل سلسلتي الدنا DNA، في كل من النطاف والمسابير، جرى تسخين الصفائح لمدة دقيقتين في درجة حرارة 80ْم ثم تركت على صفيحة تسخين في الدرجة 37ْم لليلة كاملة في غرفة تؤمن الرطوبة والظلام، وأخيراً أضيف محلول الـ DAPI، ودرست العينات باستخدام المجهر التألقي في غرفة مظلمة. جرى عد 1500-2000 نطفة في كل عينة، سواء في حال استخدام المسابير الثنائية (الصبغيين 13+21 والصبغيين X,Y) أو المفردة (الصبغي 18فقط). وجرى عد الإشارات اللونية فقط في النطاف الواضحة الحدود والمتباعدة، وذلك حسب المعايير المتبعة في هذه التقنية6؛ حيث يعد وجود إشارة لونية واحدة فقط (حمراء أو خضراء) هي الحالة الطبيعية بالنسبة للمسبار الثنائي الخاص بالصبغيين X,Y. وهذا يعني وجود نسخة واحدة فقط من الصبغي الجنسي X (23; X) أو Y (23; Y). وتكون النطاف ثنائية الصبغي الجنسي عند ظهور إشارتين لونيتين متماثلتين بلون أخضر (24; XX) (الشكل 3-1) أو أحمر (24; YY) (الشكل 3-5) أو مختلفين إحداهما بلون أحمر والأخرى باللون الأخضر (24; XY) (الشكل 3-6)، أما غياب الإشارة اللونية فيعود إلى حالة انعدام الصبغيات الجنسية (22; 0) (الشكل 3-4). أما في حال المسبار الثنائي الخاص بالصبغيين 13 و21، فلقد اعتبر وجود إشارتين لونيتين مختلفتين (أحمر+ أخضر) هي الحالة الطبيعية 23; X/Y))؛ وتعني وجود نسخة واحدة فقط من كل من الصبغيين المدروسين. بينما يشير وجود ثلاث إشارات لونية (أحمر+ أحمر+ أخضر، أو أحمر+ أخضر+ أخضر) إلى وجود صبغي إضافي 13(24; X/Y,+13) أو 21 ( (24; X/Y,+21 (الشكل 3-3). واعتبر وجود إشارة لونية واحدة (أحمر فقط أو أخضر فقط) دليل على غياب الصبغي 13 أو الصبغي 18 22;X/Y)). أما في ما يتعلق بالمسبار المفرد 18 فلقد درست الحالة الطبيعية التي يشاهد فيها إشارة لونية واحدة فقط (حمراء)، والحالة التي يشاهد فيها إشارتين باللون الأحمر والتي تمثل حالة ثنائية الصبغي 18 (24;X/Y,+18) (الشكل 3-2)، أما حالة غياب الصبغي 18 فلم يجرِ اعتمادها لضرورة وجود مسبار آخر شاهد للتفريق بينها وبين الحالات التي لم يجرِ فيها التهجين أصلاً 6. الدراسة الإحصائية استخدم في هذه الدراسة برنامج SPSS الإحصائي؛ حيث جرى تطبيق اختبار ANOVA لدراسة وجود علاقة بين معايير مختلفة للمني (للسائل المنوي)، ولإجراء المقارنات الثنائية ما بين مجموعات الدراسة، بينما استخدم اختبار Pearson لدراسة قوة علاقات الارتباط ومعناها.     النتائجResults   1- تقييم المني (السائل المنوي) في مجموعات الدراسة جرى توزيع العينات إلى 3 مجموعات، قسمت حسب عدد النطاف في الميلي لتر من عينة المني (السائل المنوي): المجموعة (A)؛ تتكون من 5 عينات شاهدة تمتاز بمعايير السائل المنوي الطبيعية من حيث التركيز والحركة والشكل، والمجموعة(B) ؛ تتألف من 15 عينة لمرضى تركيز النطاف لديهم أقل من مليون نطفة/ مل (قلة النطاف الشديدة)، والمجموعة (C)؛ وتحوي 8 عينات لمرضى يتراوح عدد النطاف لديهم بين 1 و9 مليون نطفة/ مل (قلة النطاف المعتدلة). ويبين الجدول 2 تقييماً للسائل المنوي لأفراد المجموعات الثلاث المختلفة، يتضمن بشكل خاص تركيز النطاف والنسبة المئوية للنطاف الطبيعية الشكل. 2- دراسة التشوهات المورفولوجية للنطاف جرت دراسة أنماط التشوهات الشكلية المختلفة في أجزاء النطفة المختلفة سواء كان في الرأس أو في القطعة المتوسطة أو في الذيل، باستخدام المجهر الضوئي بالتكبير 1000 مرة، ويظهر في الشكل 1 بعض أنماط تشوهات النطاف المورفولوجية. وجرى عد حوالي 100 نطفة في كل عينة، وحسبت النسب المئوية للنطاف الطبيعية بشكل عام والنسب المئوية للأنماط المختلفة من التشوهات في العينات الشاهدة، وعينات الأفراد العائدة للمجموعتين B و C. 3- الشذوذات الصبغية العددية في النطاف جرى التأكد، قبل دراسة الشذوذات الصبغية في النطاف، من أن الصيغة الصبغية لخلايا الدم المحيطي لدى الرجال العقيمين طبيعية وذلك بتطبيق تحليل الصيغة الصبغية الذي بين امتلاكهم لصيغة صبغية سليمة (XY-46) (الشكل 2).     طبقت تقنية FISHعلى النطاف لدراسة كل من حالتي الاختلال الصبغي لوجود صبغي إضافي لكل من الصبغيات الجسدية 13 و18 و21 والصبغيين الجنسيين X وY، أو وجود نقص في أحد هذه الصبغيات. ويبين الشكل 3 بعض أنماط الشذوذات الصبغية العددية المدروسة في عينات نطاف المجموعتين B و C. وجرى حساب النسب المئوية للشذوذات الصبغية العددية المختلفة في أفراد المجموعات الثلاث المدروسة. 3-1- علاقة الشذوذات الصبغية العددية بتركيز النطاف. جرى حساب نسبة التبدل في النسب المئوية لمجموع اخْتِلالُ الصِّيغَةِ الصِّبْغَيَّة العددية Total aneuploidy، وجرت مقارنتها وبشكل ثنائي بين المجموعات (الجدول 3). أظهرت النتائج أن متوسط النسب المئوية لمجموع الشذوذات الصبغية المدروسة (الصبغيات الخمسة المدروسة) في المجموعة B (1.11%) يفوق المجموعة C (0.92%) وبلغ حده الأدنى في المجموعة الشاهدة A السوية (0.57%). جرت مقارنة نسبة أو معدل التبدل لمجموع الشذوذات الصبغية بين المجموعات الثلاث المختلفة، فلوحظ ارتفاع في نسبة التبدل بين المجموعة الشاهدة A والمجموعة العقيمة المصابة بقلة النطاف الوخيمة (المجموعة B)، حيث بلغت قيمته 0.32، وانخفضت القيمة إلى 0.24 لدى مقارنة المجموعة العقيمة المصابة بقلة النطاف المعتدلة (المجموعة C) مع المجموعة A، ولدى مقارنة المجموعة C مع المجموعة B بلغت نسبة التبدل 0.17، وهذا يشير إلى وجود علاقة عكسية بين عدد النطاف ومعدل حدوث الشذوذات الصبغية. كما أن مقارنة النسب المئوية للشذوذات الصبغية العددية المختلفة أدى إلى التوصل إلى أن متوسط نسبة الاختلال في الصبغيين الجنسيين كان الأكبر في المجموعات الثلاث، بما فيها المجموعة الشاهدة، إلا أن مقارنة نسب التبدل في المجموعات الثلاث أظهرت أن نسب التبدل الخاصة بالصبغيين 13 و21 كانت الأكبر، تليها حالات الاختلال في الصبغيين الجنسيين، ثم حالات الاختلال في الصبغي 18. ولم تظهر نتائجنا وجود اختلاف كبير في نسب التبدل في جميع أنماط الشذوذات الصبغية العددية لدى مقارنة المجموعة B مع المجموعة C. ولتحديد في ما إذا كانت هذه الاختلافات معتداً بها اسـتخدم برنامج SPSS الإحصائي (اختبار (ANOVA، لإجراء مقارنات ثنائية. ويبين الجدول 4 أن متوسط نسبة مجموع الشذوذات الصبغية عند الأصحاء أصغر بشكل يُعتد به من متوسط نسبته في الأفراد العقيمين الذين ينتمون إلى المجموعتين BوC، حيث بلغت قيمة P-value 0.03 و0.026، على الترتيب. وهي قيم أصغر من 0.05، مما يؤكد وجود فرق يُعتد به. وهذا يدعو إلى الاستنتاج بأن ارتفاع نسبة مجموع الشذوذات الصبغية الواحدة يزداد كلما انخفض تركيز النطاف في عينة المني (السائل المنوي)، بينما أظهرت النتائج عدم وجود فرق يُعتد به بين متوسطي نسبة مجموع الشذوذات الصبغية للمجموعتين B وC، حيث بلغت قيمة P-value 0.08 (الجدول 4). 3. 3. 2. علاقة الشذوذات الصبغية العددية بأنماط التشوهات المورفولوجية. ِاستُخدم اختبار Pearson للبحث عن علاقة ارتباط بين النسب المئوية لحالات الشذوذات الصبغية المختلفة والنسب المئوية للتشوهات المورفولوجية، وأظهرت نتائجنا وجود علاقة ارتباط وبدرجات متفاوتة، وكانت العلاقة بين التشوهات المورفولوجية وحالات الاختلال للصبغيين 13 و21 هي الأعلى ومعتد بها إحصائياً؛ حيث بلغت نسبة قيمة الارتباط 0.378 (الجدول 5). كما أظهر البحث بشكل تفصيلي وباستخدام البرنامج الإحصائي ذاته وجود بعض الارتباطات بين بعض أنماط التشوهات المورفولوجية وحالات محددة من الاختلالات الصبغية المدروسة وبدرجات متفاوتة (الجدول 6). يلاحظ من الجدول 6 أن مجموع تشوهات الرأس يرتبط بالشذوذات العددية لتضاعف الصبغي 13، أي حالة 13 disomy، وذلك بقيمة قدرها 0.41، وهو ارتباط معتد به إحصائياً نظراً لأن قيمة P أقل من 0.05، فلقد بلغت في هذه الحالة 0.029، بينما ارتبطت تشوهات القطعة المتوسطة بالشذوذات العددية لتضاعف الصبغي 21 أي حالة 21 disomy، وهو ارتباط معتد به أيضاً (قيمته 0.45)، وقيمة P 0.017. وعلى الرغم من أن أكبر ارتباط لمجموع تشوهات الذيل كان مع حالة غياب أحد الصبغيين الجنسيين (X, or Y Nullisomy)، إلا أن هذا الارتباط لم يكن معتداً به إحصائياً، حيث بلغت قيمة P 0.168 وهي أكبر من 0.05. كما بينت نتائج الدراسة التفصيلية لهذه الارتباطات أن تشوهات تطاول الرأس ارتبطت بوجود تضاعف الصبغي 13 (13Disomy)، حيث بلغت قيمة الارتباط 0.45، وذلك عند قيمة P 0.016 (معتد بها إحصائياً)، وهي تعد أعلى قيمة ارتباط بالمقارنة مع القيم الأخرى، كم ارتبط تشوه الرأس الكبير مع حالة وجود كلا الصبغيين الجنسيين معاً (XY Disomy)، حيث بلغت قيمة الارتباط 0.42، وذلك عند قيمة P 0.024 (معتد بها احصائياً)، وهي ثاني أعلى قيمة ارتباط، أما تشوه القطعة المتوسطة غير المنتظمة فارتبط بالشذوذ الصبغي لتضاعف الصبغي 21، وذلك بقيمة ارتباط قدرها 0.39، وبلغت قيمة P هنا 0.041، وأخيراً ارتبط غياب الذيل في النطفة مع مجموع الشذوذات الصبغية المدروسة الخاصة بالصبغيين الجنسيين X وY، وبلغت قيمة الارتباط 0.41، وذلك عند قيمة P 0.032 (معتد بها احصائياً أيضاً).     المناقشة Discussion  أكـدت العديد من الدراسات ارتباط العقم بخلل في أحد متثابتات المني (السائل المنوي) أو معظمها، وأشارت الدراسات التي جرت على حالات العقم الناتجة عن قلة النطاف إلى ارتفاع معدل وجود الشذوذات الصبغية العددية في هذه النطاف. ومع ذلك، برهنت بعض الدراسات على ارتفاع في حالات الشذوذات العددية للصبغيات وبشكل خاص الصبغييات 18 وX وY، في نطاف رجال لديهم معدل طبيعي من النطاف المشوهة (حسب معايير كروجر) وهم غير قادرين على الإنجاب 4، وهذا يدعو إلى البحث عن وجود علاقة بين الشذوذات الصبغية وأنماط محددة من التشوهات، لذلك جرت في هذا البحث محاولة دراسة العلاقة بين الشذوذات الصبغية العددية في نطاف الرجال الذين يعانون من العقم بسبب قلة النطاف والخلل في متثابتات المني (السائل المنوي) لديهم وبشكل خاص النسب المئوية لأنماط محددة من التشوهات المورفولوجية، التي تفيد كأدوات تحصين تحول دون فشل المعالجة بطريقة ICSI أو الحصول على أجنة تحمل شذوذات صبغية عددية، خاصة وأنه يتعذر إجراء بعض الاختبارات مثل طريقة FISH في جميع حالات العقم بسبب الكلفة المرتفعة. أظهرت نتائجنا أن نسبة مجموع الشذوذات الصبغية تزداد كلما انخفض تركيز النطاف في عينة المني (السائل المنوي). وتتوافق هذه النتائج مع العديد من الدراسات التي أثبتت وجود علاقة بين الشذوذات الصبغية المختلفة وحالات قلة النطاف 2، 9، إلا أن هذه الدراسات لم تحدد تماماً الآلية التي أدت إلى حدوث هذه الشذوذات في هذه الحالات، فاقترحت بعضها دوراً للعوامل البيئية في الخصى والتي يمكن أن تؤثر على سيرورة الانقسام المنصف في بعض المنسليات، مما يؤدي إلى خلل في انفصال الصبغيات وتشكل نطاف تحمل شذوذات صبغية، بينما يتوقف الانقسام تماماً في خلايا أخرى مسبباً عدم قدرة هذه الخلايا على إتمام الانقسام فيؤدي بالنتيجة إلى قلة في تركيز النطاف في المني (السائل المنوي)3. ولقد قام Martin وزملاؤه عام 2003 بدراسة ركزت على المقارنة بين نسب حالات الاختلال الصبغي في ثلاث مجموعات تمثل ذكوراً مصابين بقلة النطاف الوخيمة والمعتدلة، وأشارت نتائجه إلى وجود فرق يُعتد به في معدل حالات الاختلال الصبغي، بين مجموعتي المصابين بقلة النطاف الوخيمة والمتوسطة، مع ذلك لم يلاحظ في دراستنا وجود فرق يُعتد به في متوسط نسبة مجموع الشذوذات الصبغية بين المجموعتين B وC. وقد يعود ذلك إلى الفرق في متوسط عدد النطاف العائدة إلى المجموعة التي تتكون من المرضى الذين يعانون من قلة النطاف المعتدلة (المجموعة (C بين الدراستين؛ حيث بلغ متوسط عدد النطاف في هذه المجموعة في دراستنا 3.2 مليون نطفة/ميلي لتر، بينما كان متوسط عدد النطاف للمجموعة نفسها في الدراسة التي قام بها Martin 5.9 مليون نطفة/ميلي لتر2. أثبتت معظم الدراسات والأبحاث أن المتثابتة المورفولوجية للنطاف هي مؤشر تنبؤي ممتاز لنجاح الإخصاب وحدوث الحمل، وجرى البرهان على وجود علاقة بين ارتفاع معدل التشوهات المورفولوجية وانخفاض معدلات الإلقاح بطريقة الـ IVF 10، مما دفع العديد من الباحثين إلى دراسة العلاقة بين معدل النطاف المشوهة مورفولوجياً ومعدل حالات الاختلال الصبغي في النطاف، لاعتقادهم بوجود علاقة ما بين الحالة المورفولوجية للنطاف وسلامة المادة الوراثية في نواتها. ولقد جرى بالفعل إيجاد علاقة طردية بينهما؛ حيث ترتفع نسب حالات الاختلال الصبغي بتزايد النسبة المئوية للنطاف المشوهة مورفولوجياً 2. وجرى في دراستنا البرهان على وجود علاقة مماثلة، حيث تبين وجود علاقة يُعتد بها إحصائياً وكانت الأعلى بين التشوهات المورفولوجية ككل وحالات الاختلال للصبغيين 13 و21. ومن خلال دراسة العلاقة بين الشذوذات الصبغية المختلفة وأنماط التشوهات المورفولوجية المختلفة بشكل تفصيلي أكثر، توصلنا إلى البرهان على وجود علاقات ارتباط بين: تطاول رأس النطفة وتضاعف الصبغي 13 (13 Disomy)، وارتبط تشوه الرأس الكبير مع حالة وجود كلا الصبغيين الجنسيين معاً (XY Disomy)، أما تشوه القطعة المتوسطة غير المنتظمة فارتبط بتضاعف الصبغي 21، وأخيراً ارتبط غياب الذيل في النطفة مع مجموع الشذوذات الصبغية المدروسة الخاصة بالصبغيين الجنسيين X وY. وهذا يتوافق مع دراسات أخرى أكدت على وجود علاقات مشابهة؛ فلقد جرى البرهان على ارتباط ازدياد نسبة الرؤوس المشوهة بارتفاع معدل حالات اختلال الصبغيات الجنسية، كما جرى ربط تطاول الرؤوس بوجود خلل في النواة، فلقد اقترح الباحثون أن تشوه مورفولوجية النواة الذي أدى إلى تشوه الرأس لابد أن يحمل بالضرورة مشاكل صبغية، وهذا ما أثبتته إحدى الدراسات عندما أكدت أن الرؤوس المتطاولة تحمل مادة صبغية فقيرة النوعية poor chromatin compaction 6. جرى في هذه الدراسة أيضاً الربط ما بين النطاف مشوهة الذيل وارتفاع معدل الاختلال للصبغي 13 ومجموع حالات اختلال الصبغي بشكل عام. وأشارت العديد من الدراسات الأخرى إلى وجود علاقة بين ارتفاع معدل حالات الاختلال الصبغي وازدياد النسبة المئوية للنطاف ذات الرؤوس الكبيرة macrocephalic, وبدت هذه العلاقة واضحة في حالة النطاف ذات الرؤوس الكبيرة والمتعددة الذيول macrocephalic multitailed spermatozoa 4، 11، 12، 13. وكإستنتاج، فإنه على الرغم من أن تقنية ICSI تعد تقدماً ثورياً في مجال علاج حالات العقم لدى الذكور، فإن أسلوب اختيار النطفة المستخدمة لإجراء هذه الطريقة قد يساهم في نقل الشذوذات الصبغية التي قد تتواجد في النطاف إلى الأجنة الناتجة عن الإخصاب، مما يؤدي إلى حدوث الإجهاض أو ولادة جنين مصاب بأحد الأمراض الوراثية أو المتلازمات الشائعة، مثل متلازمة ادوارد، متلازمة داون....الخ. لذلك تقترح نتائجنا التأكيد على أهمية اختيار النطفة المناسبة لإجراء طريقة حقن النطفة في هيولى البيضة، خاصة في الحالات التي تقل فيها وإلى حد كبير نسبة النطاف الطبيعية، ففي هذه الحالة يجري اختيار نطاف قد تحمل تشوهاً لم يتم البرهان على ارتباطه بشذوذات صبغية. فيجب تجنب اختيار النطاف كبيرة الرأس والنطاف متطاولة الرأس والنطاف التي لا تحمل ذيلاً والنطاف التي تحمل قطعة متوسطة غير منتظمة، لكونها أكثر ارتباطاً من غيرها بالشذوذات الصبغية. كما ينصح، في حالات الذكور المصابين بقلة النطاف اللا انسدادية المنشأ Non-obstructive oligozoospermia، بإجراء تحاليل لدراسة الحالة الوراثية للنطاف (تجزؤ الحمض النووي النكليوتيدي، وتقانة التهجين التألقي في الموضع) فلقد أثبتت الدراسات أن ارتفاع معدل حالات الاختلال الصبغي أكثر من 5% قد يؤدي إلى فشل طريقة ICSI في الحصول على حمل ناجح، لذلك فمن الممكن إجراؤها للمرضى بعد ثلاث محاولات فاشلة للـ ICSI، أو إجراء فحص للصاء (السائل الأمنيوسي)، في حال حدوث الحمل، كما من الممكن توجيه الأزواج الذين يعانون من العقم بسبب قلة النطاف الوخيمة والذين يخضعون للعلاج بطريقة ICSI لإجراء التحليل الخاص بالتشخيص الوراثي قبل التعشيش PGD للتحري عن وجود شذوذات في صبغيات الأجنة قبل إعادتها إلى الرحم.   المراجع References  1-Martin RH; Rademaker AW; Greene C; Ko E; Hoang T; Barclay L. and Chernos J. Comparison of the frequency of sperm chromosome abnormalities in men with mild, moderate, and severe oligozoospermia. Canada. Biology of reproduction; 69(2): 535-539, 2003. 2-Moretti E. and Collodel G. Fluorescence In Situ Hybridization Studies of Sperm Aneuploidies in Infertile Men. Italy. Andrology journal; 1: 20-32, 2009. 3- أبو طالب و زينب مثنى. الحمل والولادة بعد استخدام تقنيات المساعدة على الإنجاب. السعودية. مركز الترجمة، 2007. 4-Martin RH. Cytogenetics of Human Sperm. Lands bioscience. 2000. 5-Bernardini L; Martini E; Geraedts J; Hopman A; Lanteri S; Conte N. and Capitanio G. Comparison of gonosomal aneuploidy in spermatozoa of normal fertile men and those with severe male factor detected by in-situ hybridization. Molecular human reproduction; 3(5): 431-438, 1997. 6-Tang SS; Gao H; Zhao Y. and Ma S. Aneuploidy and DNA fragmentation in morphologically abnormal sperm. International Journal of Andrology; 33(1): 163-179, 2009. 7-World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-Cervical Mucus Interaction. 3rd edn. UK, 1992. 8-Auger J. and Eustache F. Standardisation de la classification morphologique des spermatozoïdes humains selon la méthode de David modifiée. Andrologie; 10: 358-373, 2000. 9-Ohashi Y; Miharu N; Honda H; Samura O. and Ohama K. High frequency of XY disomy in spermatozoa of severe oligozoospermic men. Human Reproduction; 16(4): 703-708, 2001. 10-EL-Ghobashy A. and WEST CR. The Human Sperm Head: A Key for Successful Fertilization. Journal of Andrology; 24(2): 232-238, 2003. 11-Viville S; Mollard R; Lorraine Bach M; Falquet C; Gerlinger P. and Warter S. Do morphological anomalies reflect chromosomal aneuploidies. Human Reproduction; 15(12): 2563-2566, 2000. 12-Sun F; Ko E. and Martin RH. Is there a relationship between sperm chromosome abnormalities and sperm morphology. Reproductive Biology and Endocrinology; 10: 1186/ 1477-7827, 2006. 13-Kruger TF. and Cetzee K. The role of sperm morphology in assisted reproduction. Human reproduction Update; 5(2): 172-178, 1999.     المجلد 6 , العدد 7 , ذو القعدة 1433 - تشرين أول (أكتوبر) 2012 SCLA