كانون الثاني (يناير) 2013 - SCLA مجلة التشخيص المخبري

المجلد 6 , العدد 8 , صفر 1434 - كانون الثاني (يناير) 2013

أهمية Nested-PCR في الكشف السريع عن الإصابات الرشاشية الغَزْوِيَّة لدى مثبطي المناعة مقارنة مع فحوصات القشع الروتينية

The Importance of Nested-PCR for Fast Detection of Invasive Aspergillosis in Immunsupression Patients Comparing with Routine Sputum Examination Methods

د. آلاء رمضان* و أ.د. محمد طاهر اسماعيل** و د. شادي سكرية*

Ramadan A;* Ismail M. T.** and Soukkaria Sh.*

*كلية العلوم، جامعة دمشق، **كلية الصيدلة، الجامعة العربية الدولية الخاصة
* Science Faculty, Damascus University, ** Faculty of Pharmacy, AIU

الملخص Abstract

يلعب التشخيص المبكر لداء الرشاشيات الغَزْوِيّ Invasive Aspergillosis، المسبب بالنوع Aspergillus. Fumigatus، لدى المرضى مثبطي المناعة دوراً أساسياً في الحد من وقوع الوفيات، غير أن الأدوات التشخيصية الاعتيادية، المستخدمة حالياً لكشف العداوى، وهي زرع القشع، ذات حساسية ونوعية منخفضة.
جرى في هذه الدراسة تطبيق Nested-PCR لتشخيص العدوى على نوعين من العينات (قشع ودم)، جُمعت من مرضى مثبطي المناعة. وأظهرت الدراسة حساسية ونوعية عاليتين للـ Nested-PCR لكشف العدوى في القشع أكثر من عينات الدم، بالمقارنة مع طريقة التشخيص المستخدمة في مختبرات جامعة دمشق، وهي الزرع في وسط سابورو الذي يتطلب زمناً أطول. وهذا يظهر أهمية استخدام هذه التقانة الحديثة في الوصول إلى التشخيص المبكر.

Early diagnosis of Invasive Aspergillosis, caused by Aspergillus fumigates, in immunocomromised patient is playing essential role in reducing mortality, But the conventional diagnostic tools, currently used to detect the infections, which is sputum culture, have low sensitivity and specificity.
In this study, we applied Nested- PCR to diagnose the infection on two kinds of samples (sputum and blood), collected from immunosuppressed patients. The study shows high sensitivity and specificity of Nested-PCR to detect the infection in sputum better than blood samples, compared with diagnosis method used in the laboratories of Damascus university, which are culture in Sabouraud that need more time. This shows the importance of using this modern technology to reach early diagnosis.

المقدمة Introduction

تعد الإصابة بداء الرشاشيات الغزوي من الأمراض ذات الإنذار السيء، حيث تصل نسبة وفاة المصابين إلى مستويات عالية، تتراوح بين 50-100%، خاصة وأن المرضى المعرضين للإصابة به هم مضعفو المناعة أو مثبطوها (5). وبالتالي يلعب التشخيص المبكر دوراً هاماً في حسن تدبير المرض والحفاظ على حياة هؤلاء المرضى، ولكن يجري عادة تشخيص هذا الداء بشكل متأخر، مما يؤدي إلى انخفاض فعالية العلاج وبالتالي موت المريض (7) أو قد يجري تأكيده بشكل قاطع عند تشريح الجثة لتحديد سبب الوفاة (3).
والطريقة التشخيصية الرئيسية المستخدمة في مختبرات دمشق في الوقت الحاضر هي طريقة زراعة عينات من القشع أو سائل من الغسالة القصبية، إذ تُعدّ إيجابية نتائج الزرع للرشاشية في وسط زرع عقيم دليلاً مؤكداً للإصابة بالمرض(7، 8). ولكن لا بد من الانتظار مدة زمنية قد تصل إلى 4 أسابيع لنمو الزرع وتأكيد التشخيص (5)، مما يجعل هذه الطريقة لا تفيد في التشخيص المبكر، لحاجتها لمدة زمنية طويلة قد يتفاقم خلالها المرض ولانخفاض نسبة حساسية هذه الطريقة بشكل عام إلى 50– 70% تقريباً (7).
ونظراً للحاجة إلى وسيلة تشخيصية مبكرة ذات موثوقية عالية، يمكن استخدامها لدى المرضى مثبطي المناعة (مرضى الأورام الدموية الذين يتلقون علاجاً كيميائياً أو الذين يتلقون جرعات عالية من الستيرويدات القشرية ومرضى زراعة الأعضاء)، فقد اعتمدت دراستنا على الكشف عن الرشاشية بتقانة PCR، باعتباره مؤشراً حساساً لأي مرحلة من مراحل الإصابة مهما كانت بدئية، وإن سلبية هذا التحليل تعني عدم وجود أية متعضية (4، 7).
نظراً لهذه المعطيات، اعتمدنا في دراستنا وسيلة تشخيصية سريعة، ذات حساسية ونوعية عاليتين، في الكشف المبكر عن هذه الإصابة. وهي طريقة Nested-PCR (يجري فيها تفاعلين متتاليين من الـ PCR) للكشف النوعي عن الرشاشية الدخناء، في عينات دم وقشع لمرضى مثبطي مناعة خاضعين للعلاج، في قسم أمراض الدم في مستشفى البيروني الجامعي بدمشق.

المواد والطرق Materials and Methods

شملت دراستنا 51 فرداً وزعوا إلى مجموعتين:
1- مجموعة مرضى أورام دم خاضعين للعلاج الكيميائي بحالة تثبيط مناعي (41 مريضاً)، منهم 16 أنثى و25 ذكراً، تراوحت أعمارهم بين 6 و83 عاماً (متوسط أعمارهم ± الانحراف المعياري 40.12±19.83 عاماً).
2- مجموعة الشاهد، وتضم 10 أفراد أسوياء، منهم 4 إناث و6 ذكور تراوحت أعمارهم بين 15- 72 عاماً (متوسط أعمارهم ± الانحراف المعياري 34.4±18.30 عاماً).
جُمعت العينات المرضية من شعبة أمراض الدم في مستشفى البيروني الجامعي بدمشق، بينما جُمعت عينات المجموعة الشاهدة من متطوعين أصحاء لا يراجعون أي مركز طبي.
جُمعت عينات القشع ضمن علب بلاستيكية عقيمة، بينما جرى أخذ عينات الدم باستخدام أنابيب عقيمة مفرغة من الهواء تحوي على EDTA. وأُجري تفاعل Nested-PCR على عينات الدم والقشع، كما أُجري زرع عينات القشع على وسط سابورو.

الزرع على وسط سابورو
هو الطريقة المستخدمة في مختبرات جامعة دمشق للكشف عن الإصابات الفطرية عموماً. وهو يجري في شروط التعقيم المعروفة، على وسط سابورو كلورامفينيكول أغار (Biomerieux)، والحضن في الدرجة 27مْ مدة أسبوع.

التفاعل السلسلي العُشي للبوليميراز Nested- PCR
اُستخلص الـ DNA من سلالة مرجعية، لاستخدامه كشاهد إيجابي في تفاعلي الـ PCR، ولقد جرى الحصول على السلالة المرجعية للرشاشية الدخناء من أحد المختبرات المرجعية الخاصة بدمشق.
A. طريقة عزل DNA: استخدم نوعان من العتائد Kits لعزل الـ DNA، أحدهما للعزل من الدم (شركة Invetik، ألمانيا) والآخر للعزل من القشع (شركة AJ، ألمانيا). وذلك تبعاً للتعليمات الورادة في العتيدة، أي من1 مل بالنسبة لعينات الدم و200 مكرولتر بالنسبة لعينات القشع.

B. التفاعل السلسلي العُشي Nested-PCR: وهو يتضمن تفاعلي PCR، يجري في التفاعل الأول تضخيم قطعة معينة من المجين (الجينوم). وفي االثاني يجري تضخيم قطعة داخلية من القطعة التي تم تضخيمها في التفاعل الأول.
استخدم في تفاعل PCR الأول حجم ثابت من DNA المستخلص وزوج من المرئسات يقترن مع تسلسلات محافظة للجين المرمزة للـ RNA الريبوزومي، rRNA-18S، ويضخم شدفة طولها 405 bp، مميزة لجنس الرشاشية. وللتأكد من ناتج التفاعل الأول ونوعيته، أُجري تفاعل PCR ثانٍ لهذا الناتج، باستخدام حجم ثابت منه وزوج من المرئسات يقترن مع تسلسل نوعي ضمن الشدفة الناتجة عن التفاعل الأول، ويضخم شدفة أخرى طولها 236 bp، مميزة لنوع الرشاشية الدخناء (1)، وصُنعت المرئسات المستخدمة، الموضح تسلسلها في الجدول 1، من قبل شركة Alpha DNA الكندية.

1- تفاعل PCR الأول
حُضر حجم نهائي 50 ميكرولتر لكل تفاعل PCR، وهو يحوي دارئة خاصة بالإنزيم )بتركيز 1X) و1.5 mM من MgCl2 و0.2mM من كل نيكليوتيد ثلاثي الفسفات منزوع الأكسجين dNTPs و 1µM من كل مرئسة (AFU7S, AFU7AS) و1.25U من Taq بوليميراز، وأُخذ 10 مكرولتر من الـ DNA المستخلص من كل عينة. وتضمنت كل تجربة شاهداً إيجابياً Positive control (عينة DNA من سلالة الرشاشية الدخناء) وشاهداً سلبياً Negative control (ماء مقطر عوضاً عن DNA لمراقبة التلوث Contamination) ووضعت الأنابيب في جهاز PCR لإجراء تمسخ أولي بدرجة حرارة 95مْ لمدة دقيقتين، يليها 35 دورة، يجري في كل منها: تمسخ بدرجة 95مْ لمدة 40 ثانية، تلدين بالدرجة 60مْ لمدة دقيقة، تطويل بالدرجة 72مْ لمدة دقيقة، فتطويل نهائي بالدرجة 72مْ لمدة 5 دقائق.

2- تفاعل Nested-PCR (التفاعل الثاني)
حُضّر حجم نهائي 50 مكرولتر لكل تفاعل PCR، بتراكيز التفاعل الأول نفسها وباستخدام 1µM من كل مرئسة (AFU5S, AFU5AS) و µl 10 من ناتج تضخيم تفاعل PCR الأول. وتضمنت كل تجربة شاهداً إيجابياً وشاهداً سلبياً. توضع الأنابيب في جهاز PCR، حيث يُجرى تمسخ أولي بدرجة حرارة 94مْ لمدة دقيقتين، يليه 45 دورة تتألف كل دورة من: تمسخ بالدرجة 94مْ لمدة 40 ثانية، ثم تلدين بالدرجة 62مْ لمدة دقيقة، ثم تطويل بالدرجة 72مْ لمدة دقيقة، يليه تطويل نهائي بالدرجة 72مْ لمدة 5 دقائق.
أجري بعد ذلك ترحيل لنواتج التضخيم على هلامة أغاروز بتركيز 2%، ضمن دارئة من TBE 1X وبقوة تيار كهربائي 135 فولط لمدة 25 دقيقة.

الجدول 1: تسلسل المرئسات المستخدمة في الدراسة.

الموقع	التسلسل	المرئسة
1436-1459	AGG GCC AGC GAG TAC ATC ACC TTG	AFU5S
1648-1771	GG G (AG)GT CGT TGC CAA C(CT)C (CT)CC TGA	AFU5AS
1296-1313	CGG CCC TTA AAT AGC CCG	AFU7S
1681-1700	GA CCG GGT TTG ACC AAC TTT	AFU7AS

النتائج Results

1- نتائج زرع القشع
أظهرت نتائج الزرع الفطري للعينات المرضية والشاهدة المدروسة الإصابة في حالتين من أصل 41 حالة مرضية.
2- نتائج تطبيق Nested-PCR
أظهرت نتائج الرحلان الكهربائي التحليلي لتفاعلي PCR سلبية كاملة للعينات جميعها التي جرى استخلاصها من الدم، أما بالنسبة لحالات المرضى المشتبه بها، التي أبدت أعراض الإصابة الأساسية، والتي أُجري تفاعل Nested-PCR على عينات القشع المأخوذة منها، فلقد وجد أن هنالك حالتان مرضيتان فقط من أصل 41 حالة، وأظهرت نتائج الرحلان الكهربائي التحليلي لنواتج التفاعل الأول وجود شدفة بطول 405bp والمحددة لجنس الرشاشية (الشكل 1).
وبإجراء تفاعل الـ PCR الثاني لنواتج التفاعل الأول، أظهر الرحلان الكهربائي التحليلي للنواتج ظهور الشدفة النوعية والمحددة لنوع الرشاشية الدخناء بطول 236 bp (الشكل 2).

المناقشة Discussion

بينت الدراسة ظهور إيجابية الزرع في عينتين، بعد أسبوع من الزرع، أما اختبارات تحليل Nested-PCR على عينات القشع فكانت إيجابية للعينتين ذاتهما، بعد ساعات من قيامنا بجمع العينات. كما أُجري اختبار Nested-PCR على 51 عينة دم للكشف عن الرشاشــية، حيث أن الدراسة كانت موجهة لاختبار الدم باعتباره الطريقة المفضلة لدى المخابر لإجـراء اختبارات الـ Nested-PCR بشكل فني (10). إلا أنه لم يعطِ تحليل Nested-PCR على الدم نتائج إيجابية بسبب عدة عوامل، أهمها عدم إمكان الحصول على كميات كافية من عينات دم هذه الفئة من المرضى (6)، بالإضافة إلى عوامل أخرى تتعلق بطريقة الاستخلاص بينتها الدراسات الحديثة التي صدرت بعد إنجاز دراستنا، ونشرتها المبادرة الأوروبية للتفاعل السلسلي للبوليميراز PCR على Aspergillus (EAPCRI) وأوضحت أن مراكز التحليل الأوروبية كانت تعاني من المشكلة نفسها في تحاليل الدم (9، 10). ولقد نشرت EAPCRI الطريقة التي يجب الاعتماد عليها في التعامل مع عينات الدم واستخلاص الـ DNA الفطري منها (2، 9). إن النتائج التي توصلنا إليها في تحليل Nested-PCR لعينات القشع، تفيد في أنه يمكن الاعتماد على هذه التقانة، باستخدام عينات من القشع في وضع التشخيص المبكر للإصابة بالمرض، فقد كانت نسبة الحساسية 100% ونسبة الدقة 100% وتعود دقة وحساسية التحليل إلى المرئسات النوعية المستخدمة في التفاعل والتي تستهدف تسلسلات من الجين المرمزة للـ RNA الريبوزومي، rRNA-18S لتضخم قطعة بطول 236 bp مميزة لنوع الرشاشية الدخناء (1).

الاستنتاجات Conclusions

أظهرت نتائج تحليل Nested-PCR لعينات القشع حساسية عالية خلال ساعات من الحصول على العينات، مما يجعله الطريقة المثلى للتشخيص المبكر للإصابة ضمن فئة المرضى المهيئين للإصابة بالرشاشيات من مرضى أورام الدم.

المراجع References

1-Bansod S; Gupta I. and Rai M.
Specific detection of Aspergillus fumigatus in sputum sample of pulmonary tuberculosis patients by two-step PCR.
African Journal of Biotechnology, 7: 16-21,2008.

2-EAPCRI
Aspergillus-DNA extraction using mechanical lysis step.
WHO, p. 2, 2011.

3-Groll AH; Shah PM; Mentzel C; Schneider M; Just-Nuebling G; Huebner K.
Trends in the postmortem epidemiology of invasive fungal infections at a university hospital.
J Infect, 33: 23-32, 1996.

4-Raad I; Hanna H; Sumoza D. and Albitar M.
Polymerase chain reaction on blood for diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis in cancer patients.
Cancer, 94, 2002.

5-Salonen J; Lehtonen OP; Terasjarvi MR. and Nikoskelainen J.
Aspergillus antigen in serum, urine and branchoalveolar lavage specimens of neutropenic patients in relation to clinical outcome.
Scand J Infect Dis, 32: 485-490, 2002.

6-Schulz B; Weber K; Radecke C; Scheer C. and Ruhnke M.
Effect of different sample volumes on the DNA extraction of Aspergillus fumigatus from whole blood.
Clin Microbiol Infec, 15: 686-688, 2009.

7-Steinbach WJ.
Clinical Aspects of the genus Aspergillus. In Goldman, G.H. and Osmani, S.A. (eds.), The Aspergilli Genomics, Medical Aspects, Biotechnology and Research Methods.
CRC Press, New york, p. 551, 2008.

8-Toy EC; Debord C; Wanger A; Castro G; Kettering JD. and Briscoe D.
Case Files Microbiology
Mc Graw Hill, New York, 2008.

9-White PL. et al.
Critical Stages of Extracting DNA from Aspergillus Fumigatus in whole-Blood Specimens.
J Clin Microbiol, 48: 3753-3755, 2010.

10-White PL. et al.
Aspergillus PCR: One Step Closer to Standardization.
J Clin Microbiol, 48: 1231-1240, 2010.

المجلد 6 , العدد 8 , صفر 1434 - كانون الثاني (يناير) 2013

SCLA