كانون الثاني (يناير) 2013 - SCLA مجلة التشخيص المخبري

المجلد 6 , العدد 8 , صفر 1434 - كانون الثاني (يناير) 2013

تقييم الفعالية المضادة للَيشمانِيَّة لهرمون الحمل على البلاعم البشرية المصابة بعدوى اللَيشمانِيَّة المدارية في المختبر

Evaluation of in vitro anti-Leishmanial Activity of hCG on L. tropica Human Infected Macrophages

د. إيناس أبو الشامات، د. أ. د. سعاد العقلة، د. شادي سكرية و أ. د. محمود قويدر

Abu Alshamat E; Al-Okla S; Soukkarieh Ch. and Kweider M.

كلية العلوم، جامعة دمشق
Faculty of Sciences, Damascus University

الملخص Abstract

أشارت دراسات سابقة إلى أن الهرمونات الجنسية تؤثر مباشرة في الاستعداد للإصابة بالمرض أو مقاومته، كما يمكن للعوامل المناعية المفتاح مثل السيتوكينات أو NO أن تُعَدَل وبشكل مختلف حسب الجنس أو الحمل. وأوضحنا في دراسة سابقة الدور الوقائي لهرمون الحمل على البلاعم البشرية المصابة بعدوى اللَيشمانِيَّة في المختبر. وفي هذه الدراسة فحصنا أثر المعالجة بهرمون الحمل على البلاعم المصابة بعدوى الليشمانية المدارية في المختبر بدراسة إنتاج NO وإنتاج تحت الوحدة p40 للانترلوكين- 12 [IL-12(p40)] والإنترلوكين-6 (IL-6) والإنترلوكين-10 (IL-10). وأوضحت هذه الدراسة أن هرمون الحمل يزيد بشكل معتد به إنتاج NO من قبل بلاعم مصابة بعدوى الليشمانية المدارية ومعالجة بالانترفيرون-غاما INFγ، وترافق ذلك مع انخفاض في عدد البلاعم المصابة بالعدوى، وعدد الأشكال عديمة السوط داخل البلعم، بطريقة معتمدة على الجرعة. كما يمتلك هذا الهرمون أثراً معدلاً للمناعة على البالعات بزيادته إفراز IL-12(p40) وIL-6. لكن ظهرت الزيادة الأعلى في الفعالية البَلْعَمِيّة للبلاعم وإنتاج NO وIL-12(p40) وIL-6 بتركيز 500 وحدة/ مل.
بالنتيجة، يستطيع هرمون الحمل تحريض الفعالية المضادة لليشمانية للبلاعم البشرية المصابة بالعدوى، من خلال إنتاج NO والسيتوكينات المترافقة مع الالتهاب.

Previous studies have shown that sex hormones can directly influence disease resistance or susceptibility, and key immunological factors such as cytokines or NO can be differentially modulated as a result of gender or pregnancy. Our previous study demonstrated prevention role of hCG on in vitro leishmania infected-human macrophages. In this study, we examined the effect of the treatment with hCG on the in vitro L. tropica infected-human macrophages by studying, NO, IL-12(p40), IL-6 and IL-10 production. This study demonstrated that hCG significantly increased the NO production by L. tropica infected IFNγ-primed macrophages, which was correlated with decreasing in the number of infected macrophages as well as the number of amastigotes per macrophage, in a dose dependent manner. This hormone has also an immunomodulatory effect on macrophages by increasing IL-6 and IL-12(p40) secretion. However, the greatest increase in macrophage phagocytic activity and in NO, IL-6 and IL-12(p40) production was shown with the 500 U/ml concentration. In conclusion, hCG can induce anti-leishmanial activity of infected human macrophages, through NO and pro-inflammatory cytokines production.

المقدمة Introduction

يصنف داءُ اللِّيشْمانِيَّات كأحد "الأمراض المدارية المهملةneglected tropical diseases (NTD)" التي تشكل عبئا كبيراً على الصحة العامة (1). ويعرف لهذا الداء ثلاثة أشكال سريرية حسب نوع الطفيلي والتظاهرات السريرية: داء الليشمانيات الجلديcutaneous leishmaniasis (CL)، داء الليشمانيات الجلدي المخاطيmucocutaneous leishmaniasis (MCL)، داء الليشمانيات الحشوي visceral leishmaniasis (VL). ينتشر داء اللِّيشْمانِيَّات الجلدي في المناطق المدارية وشبه المدارية، خاصة منطقة شرق البحر المتوسط، في دولٍ مثل سورية والسعودية وإيران وأفغانستان. وهو ينجم عن الإصابة بعدة أنواع من الليشمانية. ينتشر في سورية بشكل كبير نوعان رئيسان: النوع الجاف تسببه الليشمانية من النوع L. tropica، والنوع الرطب تسببه الليشمانية من النوع L. major . ويمر الطفيلي أثناء دورة حياته بطورين: طور أمامي السوط promastigotes الذي تنقله ذبابةِ الرمل sand fly إلى الفقاريات، وتتحوَّل هذه الأشكال المتحركة إلى أشكال غير متحركة أو عديمة السوط amastigotes مسؤولة عن الإمراضية وتتكاثر في المضيف الفقاري الخازن (2). تستطيع أنواع الليشمانية أن تتطفل على البلاعم وحيدات النوى (3) والخلايا المتغصنة (4) والعدلات (5)، لكن تشكل البلاعم النسيجية الخلايا المضيفة الرئيسة لليشمانية. وتؤدي البلاعم دوراً هاماً في كل من المناعة الطبيعية والنوعية وذلك عبر القيام بوظائف نوعية مثل التخلص من الخلايا التالفة، والأحياء الدقيقة، وإنتاج الجذور الأكسجينية oxygen radicals والسيتوكينات (6). ومن المثير للاهتمام أن البلاعم تمتلك مستقبلات لكل من الأندروجين (7) والاستروجين (8) والبروجستيرون (9)، وهذا يفسر قدرة هذه الهرمونات على التآثر المباشر مع الخلايا المناعية، مما يؤدي إلى تعديل الاستجابات المناعية، ومن ثم اختلاف في مصير العديد من الأمراض ومنها الليشمانية بين الذكر والأنثى وأيضاً بين الإناث الحوامل وغير الحوامل (10). يُفَعِل كل من الإسترُوجِين والبروجستيرون والبرولاكتين، في البلاعم، الآليات السامة عبر تحرير أنواع الأكسيجين التفاعلية reactive oxygen species (11) وإنتاج NO (12)، حيث تبين أن الاستروجين يحرض التعبير عن الإنزيم الصانع للـ NO، وإنتاج NO، ويزيد التعبير عن مستقبلاته في البلاعم البرتوانية للجرذ (13). وبينت دراسات حديثة أن معالجة البلاعم والعدلات المعزولة من الهامستر بالاستروجين أو البروجسترون تؤدي إلى زيادة في إنتاج NO وقتل الليشمانية من نوع L. panamensis (14). وعلى العكس، تبين أن معالجة إناث الهامستر المصابة بعدوى L. panamines بهرمون التستوستيرون يؤدي إلى تشكل آفات أكبر حجماً من الآفات في الحالات الشاهدة، وترافق ذلك مع زيادة في التعبير عن عامل النمو الاستحالي بيتا TGFΒ، والإنترلوكين-10 (IL-10)، والإنترلوكين-4 (IL-4) (15). ونظراً للدور الهام للهرمونات الجنسية الأنثوية المرتبطة بالحمل (الاستروجين والبروجستيرون) في الآليات المبيدة لليشمانية داخل البلاعم، وإلى حقيقة أن إنتاج هذين الهرمونين خلال المراحل المبكرة من الحمل يحرضه الهرمون موجه القند المشيمائيhuman chorionic gonadotropin (hCG) أو ما يسمى بهرمون الحمل (16)، وباعتبار أن العديد من الدراسات أكدت على أن ترافق استعمال هذا الهرمون مع IFNγ يؤدي إلى تعزيز عملية البلعمة وزيادة في إنتاج NO والسيتوكينات من قبل البلاعم (17)، ولعدم وجود دراسات عالمية تتناول أثر هذا الهرمون على العداوى بالليشمانية، باستثناء دراسة واحدة فقط قمنا بها في المختبر in vitro، وتوصلنا من خلالها إلى أن المعالجة المسبقة للبلاعم البشرية بهرمون hCG والمقترنة مع IFNγ ومن ثم إصابتها بعدوى الليشمانية المدارية L. tropica تؤدي إلى تعزيز إنتاج NO وبعض السيتوكينات مثل IL-6 وIL-12 (p40). وترافق ذلك مع زيادة في قتل الطفيلي (18)، مما يشير إلى دور وقائي لهرمون الحمل تجاه العدوى بالليشمانية المدارية. لذلك فإن دراسة أثر هرمون hCG على البلاعم البشرية بعد إصابتها بعدوى L. tropica قد يكون مهماً في تطوير استراتيجيات علاجية بديلة فعالة وآمنة.

المواد والطرق Materials and Methods

1- عزل الطفيلي وزراعته
عزلت الطفيليات من مرضى في مستشفى الأمراض الجلدية بجامعة دمشق، وجرت زراعتها في وسط نصف صلب (مكون من أغاء، وكلور الصوديوم NaCl) يحتوي على مضادات حيوية (100 وحدة/ مل من بنسلين/ ستربتومايسين penicillin/streptomycin؛ Cytogen, Germany)، وحضنت في الدرجة 26 مْ، وجرت مراقبتها يومياً للتأكد من نمو الأشكال أمامية السوط. وعندما أصبح عدد هذه الطفيليات ملائماً (2×610)، نقلت إلى الوسط السائل RPMI- 1640 المُدَعَم بالغلوتامين L. glutamine (sigma, Germany)، والمضادات الحيوية، و10% من مصل بقري جنيني FBS ((Cytogen, Germany بعد تخريب بروتينات جملة المتممة بالحرارة. ونُمِّطَ الطفيلي في مختبرنا بتقنية التفاعل السلسلي للبوليميراز (PCR) وتبين أنه من نوع الليشمانية المدارية L.tropica (19).

2- عزل الوحيدات البشرية human monocytes

أخذت عينات من الدم المحيطي لمتبرعين في بنك الدم في دمشق. وبعد تحويلها إلى ما يسمى بالغِلاَلَةُ الشَّهْباء buffy coat، خففت بنسبة 4:1 باستخدام دارئة ملحية فسفاتية PBS لا تحوي شوارد كالسيوم Ca⁺² أو مغنزيوم Mg⁺² (Sigma, Germany). صُبَت العينة فوق مدروج كثافة من الفيكول تركيزه 1.077 غرام/ مل (GE. Healthcare)، ثم نُبِذَت بسرعة 800xg مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وجمعت وحيدات النوى من السطح البيني. غُسِلَت الخلايا بالدارئة الملحية الفسفاتية، وجمعت بالنبذ بسرعة 400xg، لمدة 15 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة. حُلَّت كريات الدم الحمراء بالحضن لمدة دقيقتين مع دارئة حل تتكون من: 0.1 مول KHCO₃، و0.15 مول NH₄Cl، وقيمة pH 7.4.
غُسِلَت الخلايا ثلاث مرات بالدارئة الملحية الفسفاتية وبالنبذ مرة بسرعة 400xg ومرتين بسرعة 200xg، مدة 15 دقيقة في كل مرة. جرى تقييم عَيُوشِيَة الخلايا cell viability بتلوينها بأزرق التريبان وحساب عددها باستخدام عدادة نيوباور، ثم نقلت إلى أطباق زرع تتكون من 12 بئراً (gerinebio-one/cellstar)، بمعدل 3×⁶10 خلية/ بئر/ 2 مل، من وسط زرع (IMDM Sigma, Germany) يحوي 2% مصل بشري Sigma, Germany)) منزوع المتممة و100 وحدة/ مل بنسلين /ستربتومايسين، وحضنت في حاضنة (OSK, Tokyo)، في الدرجة 37° مْ وبوجود 5% من غاز ثاني أكسيد الكربون. وبعد ساعتين من الحضن جرى التخلص من الخلايا غير الملتصقة بالغسل بالدارئة الملحية الفسفاتية، وأُضيف 2 مل من وسط الزرع IMDM المدعم ب %10 مصل بشري منزوع المتممة. وجرى استبدال وسط الزرع بوسط جديد في اليوم الثاني والخامس من الاستنبات، وتمايزت الوحيدات إلى بلاعم في اليوم السابع.

3- تفعيل البلاعم

أُحدثت عدوى البلاعم بطفيلي الليشمانية من النوع L. tropica المأخوذ من الطور المُخمِج بنسبة 5 طفيلي: 1 بلعم، وحضنت في الدرجة 37مْ و5% من ثاني أكسيد الكربون. وجرى التخلص من الطفيليات غير المرتبطة بالبلاعم بغسل الخلايا بالدارئة الملحية الفسفاتية، بعد ساعتين من الحضن، وأضيف وسط الزرع IMDM المدعم ب %10 مصل بشري منزوع المتممة. أزيل وسط الزرع بعد 48 ساعة، وأضيف 5 نانوغرام/ مل من الإنترفيرون غاما IFNγ (Sigma, (Germany. وبعد 6 ساعات من الحضن، عولجت الخلايا بتراكيز مختلفة من هرمون hCG (100، أو 250، أو 500 وحدة/ مل،LG Life Science ). جُمِعَ السائل الطافي للخلايا بعد 48 ساعة للكشف عن NO ومعايرة السيتوكينات، وثُبِتَت الخلايا ولُوِنَت بملون غيمزا لتقييم قدرة البلاعم على قتل الطفيلي.

4- تقييم فاعلية البلاعم المضادة لليشمانية

فُحِصَت الخلايا المُلونة باستعمال مجهر مقلوب (Olympus, Japan)، وجرى عد 300 خلية في البئر. ولتقييم الفاعلية المُضَادة لليشمانية، حُسِبَت التبدلات في كل من النسبة المئوية للبلاعم المصابة بعدوى الليشمانية، ومتوسط عدد الأشكال عديمة السوط داخل البلعم بعد المعالجة بتراكيز مختلفة من هرمون الحمل ومقارنتها مع الشاهد.

5- معايرة NO

جرى تقييم إنتاج NO في السائل الطافي للخلايا باستخدام عتيدة خاصة Griess reagent Kit، حسب التعليمات الموصى بها من قبل الشركة (Oxford Biomedical, USA). مُزِج 100 مكرولتر من السائل الطافي مع 10 مكرولتراً ZnSO4 تركيزه 30% و90 مكرولتراً ماءً مقطراً، وحُضنت مدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نُبّذ المزيج بسرعة 800xg مدة 5 دقائق، ونُقِلَ السائل الطافي إلى أنبوب يحتوي على 0.5 غرام من حبيبات الكادميوم الجاف، وحضن مدة ليلة كاملة مع التحريك المستمر في درجة حرارة الغرفة. نُبّذت العينات بسرعة 800xg مدة 5 دقائق، وأخذ السائل الطافي بحجم يتراوح بين 20 و 100 مكرولتر ووضع في الآبار. أكمل الحجم بالماء المقطر حتى 100 مكرولتر، وأضيف 50 مكرولتر من الكاشف الأول ثم 50 مكرولتر من الكاشف الثاني. استعملت تراكيز متزايدة (0.5-100 مكرولتر) من نتريت الصوديوم NaNO2 كشاهد معياري، وقيست الكثافة الضوئية في موجة طولها 450 نانومتر، باستخدام قارئ ELISA (HS Human, Germany).

6- معايرة السيتوكينات

جرت معايرة تراكيز السيتوكينات بتقنية المقايسة المناعية الإنزيمية ELISA باستخدام عتيدة خاصة لكل من IL-6 وIL-12(p40) وIL-10، تبعاً للتعليمات الموصى بها من قبل الشركة المصنّعة (DRG Instruments GmbH, Germany). وبشكل عام، تحتوي كل عتيدة على صفيحة ذات آبار مغطاة بأضداد ضد- السيتوكين. أضيف إلى كل بئر 100 مكرولتر من السائل الطافي للخلايا أو المحلول المعياري و100 مكرولتر من دارئة الحضن Incubation Buffer، وحُضنت على الهزازة مدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. وكان يجري كشف السيتوكين المرتبط مع الأضداد بإضافة 50 مكرولتر/ بئر من أضداد السيتوكين المقترنة بإنزيم بيروكسيداز فجْل الخَيْلanti IL-HRP و100 مكرولتر/ بئر من محلول تخفيف العينة Specimen Diluent، والحضن مدة ساعتين مع التحريك المستمر، في درجة حرارة الغرفة. وأضيف في المرحلة الأخيرة 200 مكرولتر/ بئر من محلول ركازة رُباعِيُّ ميثيل البنزيدين TMB-Substrate الخاصة بإنزيم HRP وحضنت على هزازة، في الظلام، لمدة 30 دقيقة، وتُبِعَت بإضافة 50 مكرولتر/ بئر من محلول التوقف Stop Solution. فُصِلَت مراحل العمل جميعها بغسل الآبار بمحلول الغسل Wash Solution، وقيست الكثافة الضوئية في موجة طولها 450 نانومتر.

7- الدراسة الإحصائية

أجريت جميع التجارب باستعمال مكررين لكل شرط تجريبي في التجربة الواحدة وذلك في ثلاث تجارب كاملة مكررة. ولمقارنة المعايير المختلفة في المجموعات المختلفة استخدم اختبار ANOVA، واعتمد اختبار Kruska-Wallis Post hoc لتحديد في ما إذا كان الفارق بين المتوسطات معتداً به إحصائياً، واعتمدت P<0.05 كقيمة لهذا الاعتداد، واستخدم برنامج SPSS (SPSS version 15) لمعالجة البيانات وتحليلها إحصائياً ورسم المنحنيات البيانية.

النتائج Results

1- أثر هرمون hCG على الفعالية المضادة لليشمانية في البلاعم
بينت نتائجنا أن المعالجة بالانترفيرون غاما بمفرده تؤدي إلى انخفاض في النسبة المئوية للبلاعم البشرية المصابة بعدوى الليشمانية المدارية L. tropica (64%) بالمقارنة مع البلاعم المصابة بالعدوى وغير المعالجة (82%). وترافق ذلك مع انخفاض في متوسط عدد الطفيليات داخل البلعم الواحد. ومن المثير للاهتمام أن معالجة البلاعم المصابة بالعدوى بـ 100 أو250 أو500 وحدة/ مل من هرمون الحمل المسبوق بإضافة INFγ تؤدي إلى زيادة ملحوظة في انخفاض النسبة المئوية للبلاعم المصابة بالعدوى، بعلاقة منوطة بالجرعة ومعتد بها إحصائياً (P<0.05)، حيث بلغت 48 و38 و34%، على الترتيب (الشكل 1، أ). وترافق ذلك مع انخفاض في متوسط عدد الطفيليات داخل البلعم الواحد، بالمقارنة مع البلاعم المصابة بالعدوى وغير المعالجة (8.9) أو المعالجة فقط بـ IFNγ (6.7) أو هرمون hCG (5.4) (الشكل 1، ب)، مما يقترح أثراً تآزرياً لهرمون الحمل وINFγ يؤدي إلى تعزيز الفعالية المضادة لليشمانية في البلاعم البشرية. وبلغت هذه الفعالية أعلى مستوياتها لدى المعالجة بالجرعة 500 وحدة/ مل من هرمون الحمل (الشكل 1، د).

2- أثر هرمون hCG على إنتاج NO
لوحظ ارتفاع هام في قيم NO المفرزة من قبل البلاعم المصابة بالعدوى والمعالجة بهرمون الحمل (بعلاقة منوطة بالجرعة)، بالمقارنة مع البلاعم المصابة بالعدوى وغير المعالجة والبلاعم المصابة بالعدوى والمعالجة فقط ب IFNγ أو فقط بهرمون hCG، ولوحظت أعلى قيمة لإنتاج NO باستعمال الجرعة 500 وحدة/ مل من الهرمون، وتبين وجود فروق معتد بها إحصائياً في تراكيز NO المفرزة من قبل الخلايا المعالجة بالجرعات المختلفة من الهرمون (P<0.05) (الشكل 2).

3- أثر هرمون hCG على إنتاج السيتوكينات

تؤدي معالجة البلاعم بتراكيز مختلفة من هرمون الحمل، المسبوق بإضافة INFγ، إلى ارتفاع كبير في إفراز هذين السيتوكينين، بعلاقة منوطة بالجرعة ومعتد بها إحصائياً (P<0.05). ولم تؤثر هذه المعالجة في إنتاج IL-10، فلم يلاحظ أي تبدل في إفرازه، حتى لدى استخدام الهرمون بالجرعة الأعلى (500 وحدة/ مل) والتي كانت الأكثر فعالية في ما يتعلق بإنتاج كل من IL-6 وIL-12(p40) (الشكل 3).

المناقشة Discussion

دُرس في هذا البحث أثر هرمون hCG على البلاعم المصابة بعدوى طفيلي الليشمانية المدارية. خاصة وأن دراستنا السابقة، بينت أن لهرمون الحمل دوراً وقائياً، حيث توصلنا إلى أن معالجة البلاعم بهرمون الحمل قبل إصابتها بعدوى الطفيلي يؤدي إلى تعزيز قتل الطفيلي من قبل البلاعم، وترافق ذلك مع زيادة في إنتاج NO وIL-6 وIL-12 (p40) (18). وبشكل مشابه، توصلنا في هذه الدراسة إلى أن معالجة البلاعم البشرية، المصابة بعدوى الليشمانية المدارية، بتراكيز مختلفة من هرمون hCG، الذي سُبِقَ بإضافة 5 نانوغرام من IFNγ، يؤدي إلى زيادة منوطة بالجرعة ومعتد بها إحصائياً في إنتاج NO. ولقد ترافق هذا الإنتاج المرتفع من NO مع نسبة منخفضة للإصابة بالعدوى، حيث لوحظ انخفاض في النسبة المئوية لعدد البلاعم المصابة بالعدوى وعدد الأشكال عديمة السوط داخل البلعم، في المجموعات المعالجة بالهرمون بالمقارنة مع غير المعالجة. وبلغت هذه الفعالية أعلى مستوياتها لدى المعالجة بجرعة 500 وحدة/ مل من هرمون الحمل. بينما بينت دراستنا السابقة، التي اعتمدت معالجة البلاعم بالهرمون قبل العدوى بالليشمانية المدارية، أن الجرعة التي تؤدي إلى الفعالية الأعلى هي 250 وحدة/ مل.

تتوافق هذه النتائج مع دراسات سابقة، بينت أن معالجة البلاعم بهرمون hCG مسبوقاً ب IFNγ تعمل على زيادة إنتاج كل من NO والوسائط الأكسجينية الفعالة ROS (17). ويُعَد إنتاج NO أساسياً في آليات قتل الليشمانية في البلاعم المعزولة من الفئران (12)، كما يزداد هذا الإنتاج بوجود مستويات فيزيولوجية مرتفعة من هرموني الاستروجين والبروجستيرون في إناث حوامل تنتمي إلى أنواع مختلفة، فعلى سبيل المثال لُوحِظَ انخفاض في عدد الأشكال عديمة السوط في البلاعم والعدلات المعزولة من إناث هامستر حوامل مصابة بعدوى L. panamensis، بالمقارنة مع خلايا الإناث غير الحوامل والمصابة بالعدوى، وتبين أن معالجة هذه الخلايا بالاستروجين أو البروجستيرون تؤدي إلى زيادة في إنتاج NO وقتل الليشمانية (14). وبشكل مشابه، تبين أن البلاعم المشتقة من نقي العظم والمعزولة من إناث فئران من السلالة DBA/2 هي أكثر مقاومة للإصابة بعدوى طفيلي L. mexicana من البلاعم المعزولة من ذكور السلالة نفسها، كما أن معالجة البلاعم المعزولة من الإناث والذكور بالاستروجين يزيد من إنتاج NO وقتل الطفيلي، لكن دون أن يؤثر في إنتاج السيتوكينات المهيئة للالتهاب مثل IL-6 و IL-12 وعامل نخر الورم TNF (20). وهذا لا يتوافق مع نتائجنا، حيث ترافقت الفعالية المبيدة لليشمانية بزيادة في إنتاج IL-6 و IL-12(p40) من قبل البلاعم المصابة بعدوى L. tropica والمعالجة بجرعات متزايدة من هرمون hCG مسبوقاً ب IFNγ، دون أن يؤثر ذلك على إنتاج IL-10. كما أن نتائجنا تخالف نتائج الدراسات التي أشارت إلى أن إفراز IL-6 الناجم عن الإصابة بالليشمانية الجلدية أو الحشوية يعمل على تخفيض الآليات الالتهابية، ويخفض من تفعيل البلاعم ومن الآليات المبيدة للمكروبات. وجرى توثيق ذلك عندما تبين أن الفئران التي تفتقر إلى جين 6-IL والمصابة بعدوى الليشمانية من النوع L. donovani تستطيع أن تسيطر على الداء بتحريض استجابة مناعية من النمط Th1 تؤدي إلى قتل الطفيلي وزيادة مستوى IFNγ (21، 22). ومع ذلك، تتوافق نتائجنا مع نتائج دراسات أجريت على البلاعم والخلايا المتغصنة غير المصابة بالعدوى والمعالجة بهرمون الحمل مسبوقاً IFNγ. وأوضحت أن الهرمون يزيد من إفراز IL-6 وIL12، بينما لا يؤثر على إفراز كل من IL-10 وعامل النخر الورمي من النمط ألفا TNFγ. وقد يعود هذا الاختلاف في النتائج إلى أثر هرمون hCG الذي يعرف بقدرته على زيادة إفراز IL-6 الذي يفاقم عادة التظاهرات السريرية لليشمانية؛ فعلى سبيل المثال، تؤدي معالجة الخلايا المتغصنة المفعلة بـ LPS (عديد السكاريد الشحمي) بهرمون الحمل بمفرده إلى زيادة في إفراز IL-10، وتناقص في إفراز TNFγ وIL-6، وتبدلت هذه الفعالية لدى ترافق المعالجة بهرمون الحمل مع IFNγ، مما أدى إلى ارتفاع في إفرز IL-10 و TNFγ و IL-6 (23). كما يبدو أن أثر الهرمونات الجنسية في إفراز السيتوكينات يرتبط بالتركيب الجيني للمضيف؛ حيث ترافقت الفعالية المبيدة للـ L. mexicana للبلاعم المشتقة من نقي العظم والمعزولة من إناث الفئران C57BL/6 بإنتاج كميات مرتفعة من IL-12 وIL-6 وبالتعبير عن مستويات مرتفعة أيضاً من السلسلة ألفا لمستقبل INFγ (24). بينما لم يترافق قتل الطفيلي في السلالة DBA/2 مع إنتاج السيتوكينات المهيئة للالتهاب مثل IL-6 وIL-12 وعامل النخر الورمي TNF (20).
ويعد ترافق الزيادة في إفراز NO مع زيادة تركيب IL-12(p40)، بعد معالجة البلاعم المصابة بعدوى الليشمانية المدارية بهرمون الحمل ذو أهمية كبيرة، خاصة وأن المناعة الوقائية اتجاه أنواع الليشمانية ترتبط بـ IL-12 المفرز من قبل البلاعم أو الخلايا المتغصنة. وهو يقود بدوره إلى إنتاج IFNγ من قبل خلايا تعود لكل من آليات المناعة الطبيعية (الخلايا الفاتِكَةٌ بطَبيعِتها NK) والمناعة النوعية (الخلايا التائية CD4+ من النمط Th1) (25). وتجدر الإشارة إلى أن الإنتاج الأمثل ل IL-12 يتطلب تحفيزاً مساعداً من قبل IFNγ (17).

الاستنتاج Conclusion

إن الفعالية المضادة لليشمانية التي يبديها هرمون hCG، تقترح أن هذا الهرمون يعمل كمُعدِّل للاستجابات المناعية ليوجهها باتجاه مناعة من النمط Th1 الفعالة اتجاه الليشمانية. ويدعم المفهوم المتعلق بأن التبدلات الفيزيولوجية التي ترتبط بتبدلات في مستوى الهرمونات الجوالة في الدوران يمكن أن تؤثر في التوازن بين المضيف والعوامل الممرضة مثل الليشمانية. وتعد هذه النتائج الأولى من نوعها التي تقترح الدور الهام لهرمون الحمل في الاستجابات المناعية اتجاه الليشمانية. ومع ذلك، فلابد من إجراء دراسات إضافية لدراسة أثر هذا الهرمون في الأحياءin vivo، حيث يمكن عندئذ أن يكون مهماً لتطوير استراتيجيات معالجة جديدة وفعالة تجاه الليشمانية.

المراجع References

1-Hotez P.J., Pecoul B. “Manifesto” for advancing the control and elimination of neglected tropical diseases, PLoS Negl Trop Dis, 4:e718, 2010.
2-World Health Organization: The World Health Report. Geneva: World Health Organization, pp 192-197, 2010.
3-Alexander J, Russell D.G. The interaction of Leishmania species with macrophages, Advan Parastiol, 31, 175-254, 1992.
4-Moll H, Fuchs H, Blank G, Rollinghoff M. Langerhans cells transport Leishmania major from infected skin to the draining lymph node for presentation to antigen-specifc Tcell, Eur j Immunol, 23, 1595-1601, 1993.
5-Van Zandbergen G, Klinger M, Mueller A, Dannenberg S, Gebert A, Solbach W, Laskay T. Cutting edge: neutrophil granulocyte serves as a vector for Leishmania entry in to macrophages, J Immunol, 173, 6521-6525, 2004.
6-Vazquez-Torres, A, Jones-Carson J, Baumler A. J, Falkow S, Valdivia R, Brown W,Berggren R, Parks W.T, Fang F.C. Extraintestinal dissemination of Salmonella by CD18-expressing phagocytes, Nature, 401, 804-808, 1999.
7-Benten WP, Lieberherr M, Giese G, Wrehlke CH, Stamm O, Sekeris C.E, Mossmann H, Wunderlich F. Functional testosterone receptors in plasma membranes of T cells. FASEB J, 13, 123–133, 1999.
8-Cutolo M, Accardo S, Villaggio B, Barone A, Sulli A, Coviello D.A, Carabbio C, Felli L, Miceli D, Farruggio R, Carruba G, Castagnetta L. Androgen and estrogen receptors are present in primary cultures of human synovial macrophages, J Clin Endorcrinol Metab, 81, 820–827, 1996.
9-Jones L.A, Anthony J.P, Henrique F.L, Nickdel M.B, Carter K.C, Alexander J, Roberts C.W. Toll-like receptor-4-mediated macrophage activation is differentially regulated by progesterone via the glucocorticoid and progesterone receptors, Immunology, 125, 59–69, 2008.
10-Sinder H, CM Lezama-Davila, Alexander J, Satoskar A.R. Sex hormones and modulation of immunity against Leishmaniasis, Neuroimmunomodulation, 16(2), 106-113, 2009.
11-Cannon J.G, St Pierre B.A. Gender differences in host defense mechanisms, J Psvchiatr Res, 31, 99-
113, 1997.
12-Stenger S, Donhauser N, Thuring H, Rollinghoff M, Bogdan C. Reactivation of lanten Leishmania by inhibition of induces nitric oxide synthase, J Exp Med, 183, 1501-1514, 1996.
13-You H.J, Kim J.Y, Jeong H.G. 17-beta-Estradiol increases inducible nitric oxide synthase expression in macrophages, Biochem Biophys Res Commun 303, 1129–1134, 2003.
14-Osorio Y, Bonilla D.L, Peniche A.G, Melby P.C, Travi B.L. Pregnancy enhances the innate immune response in experimental cutaneous leishmaniasis through hormone-modulated nitric oxide production, J Leukoc Biol ,83, 1413-1422, 2008.
15-Travia B.L, Osorio Y, Melby P.C, Chandrasekar B, Arteaga L, Saravia N.G. Gander is a major determinant of the clinical evolution and immune response in hamsters infected with Leishmania spp, Infect Immun, 70, 2288-2296, 2002.
16-Keay S. D, Vatish M, Karteris E, Hillhouse E. W, Randeva H. S. The role of hCG in reproductive medicine, BJOG, 111, 1218-1228, 2004.
17-Wan H, Versnel M.A, Cheung W.Y, Leenen P.J, Khan N.A, Benner R, Kiekenes R.C. Chorionic gonadotropin can enhance innate immunity by stimulating macrophage function. J Leukoc Biol ,82(4),926-33, 2007.
18-Abu Alshamat E, Al-Okla S, Soukkarieh CH, Kweider M. Human Chorionic Gonadotropin (hCG) Enhances Immunity Against L.tropica by stimulating human macrophage functions, Parasite Immunology, In press.
19-Soukkarieh CH, Al-Okla S, Kweider M. Using of the PCR method for Identification Leishmania tropica in Syria, Damascus univ. J for basic Sciences. In press
20-CM Lezama-Davila, A.P Isaac-Marquez, J. Barbi, S. 17 ? Estradiol increases Leishmania mexicana killing in macrophages from DBA/2 mice by enhancing production of nitric oxide but not pro-inflammatory cytokines, Am J Trop. Med. Hyg, 76(6), 1125-1127, 2007.
21-Ansaria N.A, Saluja S, Salotra P. Elevated levels of interferon-? Interleukin-10 and Interleukin-6 during active disease in Indian Kala azar, Clin Immunol, 119,339-345, 2007.
22-Murray H.W. Accelerated control of visceral Leishmania donovani infection in Interleukin- 6- deficient mice, Infect Immun, 76, 4088-4091, 2008.
23-Wan H, Versnel M.A, Cheung W.Y. Chorionic gonadotropin can enhance innate immunity by stimulating macrophage function, J Leukoc Biol, 82(4), 926-933, 2008.
24-Lazama Davil. Role of phosphatidylinositol-3-kinase-?(PI3K?)-mediated pathway in 17?-estradiol-induced killing of L.mexicana in macrophages from C57BL/6 mice PI3K?-mediated pathway and L.mexicana, Immunol Cell Biol, 86, 539-543, 2008.
25-Alexander J, Satoskar A.R, Russell D.G. Leishmania species: models of intracellular parasitism, J Cell Sci, 112, 2993-3003, 1999.

المجلد 6 , العدد 8 , صفر 1434 - كانون الثاني (يناير) 2013

SCLA