الخلفيّة: تعدّ تحت جمهرة الخلايا التائيّة المنظِّمة Tregs لمفاوياتٍ احترافيةً ذات قدرةٍ فريدةٍ على تعديل العديد من أوجه الاستجابة المناعيّة. يعدّ عزل Tregs بأعدادٍ كافية ونقاوةٍ عالية شرطاً لازماً لمحاولة سبر آليات كبت المناعة التي تنسب إليها وتحرّي إمكانيّة منابلتها سلباً أو إيجاباً في المُخْتَبَر in vitro وفي الأحياء in vivo.

الهدف: هدفت هذه الدّراسة إلى عزل الخلايا التّائيّة المنظِّمة عالية التّعبير عن CD25 (أي (CD4⁽⁺⁾CD25^(high) بنقاوةٍ عالية، وتقييم قدرتها على كبت تكاثر الخلايا التّائيّة المستفعلة CD4⁽⁺⁾CD25^(-) وإفرازها للإنترلوكين 2 (IL-2) في المختبر.

الطرق: جرى أولاً عزل الخلايا التّائيّة  CD4⁽⁺⁾بطريقة الإنتقاء السّلبي من متبرعين أصحاء. تلا هذه الخطوة وسم الخلايا التّائية المغناة بأضدادٍ مفلورةٍ موجهةٍ لـ CD4 وCD25، وجرى فرزها تفريقيّاً إلى تحت جمهرتين خلويتين باستعمال الجريان الخلوي اعتماداً على مستوى التّعبير السّطحي عن المستضد CD25. أجريت مقايسة الكبت في المختبر واستعيض عن الخلايا المقدّمة للمستضد بخرزات مكسوة بضدي anti-CD3 وanti-CD28، وعُينت القدرة الكابتة لـ CD4⁽⁺⁾CD25^{(high/bright)} بقياس تثبيطها لتكاثر الخلايا المستجيبة ((Tresp واصطناعها للـ IL-2.

النتائج: أمكننا عزل التائيّات المنظِّمة CD4⁽⁺⁾CD25^{(high/bright)} والتائيّات المساعدة المستفعلة CD4⁽⁺⁾CD25^(-) متعدّدة النّسائل بنقاوةٍ فائقة تجاوزت نسبة الـ 99%. بيّنت نتائج مقايسة الكبت في الزّجاج قدرة الخلايا المنظِّمة CD4⁽⁺⁾CD25^(high)علىتثبيط انقسام الخلايا التّائيّة المستفعلة وكبت إنتاجها لـ IL-2 وذلك بصورةٍ متناسبة مع أعداد الخلايا المنظِّمة المضافة إلى المقايسة.

الاستنتاج: يمكن استخدام البروتوكول الموصوف في هذه الدّراسة للحصول على كلٍ من تحت جمهرتي الخلايا التّائيّة المنظِّمة والمستفعلة اللازمتين لإجراء مقايسة الكبت في المختبر من المتبرّع نفسه     أو المريض بنقاوة عالية دون تلوّث المحضرات بالخلايا المستفعلة المنشطة CD4⁽⁺⁾CD25^(lo).

Background: The regulatory T cells subpopulation (Tregs) are professional suppressor lymphocytes that perform unique functions as modulators of almost

all aspects of the immune response. Isolation of Treg subpopulation in sufficient numbers and high purity is a precondition to gain insights into Treg cell suppressor mechanisms and exploring the possibility of manipulating their functionsboth positively or negatively in vitro and in vivo.

Objective: This study aimed at isolating highly purified CD4⁽⁺⁾CD25^{(high/bright)} and evaluating their function measured by their suppressing the proliferation of activated CD4⁺CD25^?and their production of Interleukin-2 (IL-2) in vitro.

Methods: CD4⁺ T cells were first isolated by negative selection. This step was followed by Flow sorting of two subpopulation based on their expression levels of CD25. In vitro suppression assay was performed using anti-CD3 and anti-CD28 beads as surrogate antigen presenting cells, and the suppression ability of CD4⁽⁺⁾CD25^{(high/bright)} was determined via measuring their inhibition of responding cells (Tresp) proliferation and IL-2 production.

Results: We isolated polyclonal CD4⁽⁺⁾CD25^(hi/bright) Tregs and effector helper T cells CD4⁽⁺⁾CD25^(-) from peripheral blood of healthy subjects at purities exceeded 99%. In vitro suppression assay clearly revealed that CD4⁽⁺⁾CD25^(hi/bright) Tregs potently suppressed both the proliferation of activated CD4⁺CD25^? and production of IL-2. The observed suppression was dependent on numbers of Tregs added to the assay.

Conclusion: The protocol adapted in this study can be used to obtain highly-pure Tregs and effector T lymphocyte subpopulations needed to perform the in vitro suppression assay from the same donor/patient, and evade contamination with activated effector T cells CD4⁽⁺⁾CD25^(lo).

المقدمة Introduction

أثمر العمل البحثي الذي قام به ساكاغوشي وزملاؤه Sakaguchiet al. عام 1995 عودةً قويّة للاهتمام بفرضيّة وجود خلايا مناعيّة كابتة، وأسّس لنشوء حقلٍ بحثيٍّ جديد يُعنى بدراسة تحت جمهرة خلويّةٍ تدعى الخلايا التائيّة المنظِّمة regulatory T cells (Tregs) والتي تشكّل أقليةً صغيرةً من الخلايا التّائيّة المساعدة CD4⁺ T Cells (1). قام فريق ساغاكوشي بسلسلةٍ من التّجارب التي استنفدوا فيها تحت جمهرة الخلايا التّائيّة CD4⁺ التي تعبّر عن السّلسلة a للمستقبل منخفض الألفة لـ IL-2 (CD25) من جمهرة الخلايا التّائيّة الطبيعيّة الناضجة، الأمر الذي نجم عنه حدوث طيفٍ واسعٍ من أمراض المناعة الذّاتيّة لدى فئران موهنة المناعة تلقت الخلايا CD4⁽⁺⁾CD25^(-)، في حين أمكن حماية هذه الفئران بعمليّة نقلٍ مشاركٍ للخلايا CD4⁽⁺⁾CD25⁽⁺⁾ (1). تتالت بعد هذا الكشف الدّراسات التي استقصت الأدوار التي تلعبها هذه الخلايا في تحريض حدوث تحمّل الذات self-tolerance وكبح الاستجابات المناعيّة المفرطة، وأميط اللثام عن إسهام الخلايا Treg في منع حدوث أمراض المناعة الذّاتيّة التي تتسبّب بها الخلايا التّائيّة المفعّلة ضد الذاتautoreactive T cell ، وتجنّب رفض الجسم للأعضاء المزروعة وحدوث داء الطعم ضد المضيف graft-versus-host disease (2-7). كما أشارت بحوث أخرى إلى الدّور السّلبي الذي تلعبه هذه الخلايا والمتمثّل في تثبيط الاستجابة المناعيّة تجاه الأورام anti-tumor immune response، حيث تعزو بعض الدّراسات إخفاق الجهاز المناعي في كبح نمو السّرطانات إلى زيادةٍ في تواتر هذه الخلايا أو فرطٍ في وظيفتها الكابحة، في حين يترافق انخفاض نسبة الخلايا المنظِّمة ضمن جميعة اللمفاويات المرتشحة في سرير الورم tumor infiltrating lymphocytes (TILs) مع تحسّن البقيا وتناقص قدرة السّرطان على تشكيل النقائل (8- 10).

ينسب إلى هذه الخلايا جملةٌ من الآليات التي تثبّط بموجبها أنماطاً متنوعةً من الخلايا المناعيّة، منها: الخلايا التّائيّة (11) والخلايا المقدّمة للمستضد (13، 12) واللمفاويات البائيّة (14) والبلاعم/الوحيدات (15). رُبطت قدرة الكبت المناعي الذي تتفرّد بها تحت جمهرة الخلايا التائيّة CD4⁽⁺⁾CD25⁽⁺⁾ بامتلاكها لعامل الانتساخ Foxp3 (forkhead box P3) الذي ينتمي إلى عائلة عوامل الانتساخ ذات الحلزون المجنّح/المتفرّع الرأس (الشبيه بالشوكة) forkhead/winged-helix family، وهذا ما انعكس على تعريف هذه الخلايا على أنّها Foxp3⁺ regulatory T cells (16، 17).

طوّر عددٌ من الفرق البحثيّة مقايسةً في المختبر لتقييم قدرة الخلايا Tregs على كبح انقسام الخلايا CD4⁽⁺⁾CD25^(-) وإنتاجها للانترلوكين 2 (IL-2). تعدّ هذه المقايسة الطريقة الوحيدة المعتمدة في التّطبيق السّريري لتقييم القدرة الكابحة للخلايا المنظِّمة المستحصلة من مرضى يعانون من اضطرابٍ مناعي يؤهّب للإصابة بأدواء مناعيّة ذاتيّة (مثل الداء السّكّري من النّمط الأوّل T1D) بالمقارنة مع Tregs معزولة من أفرادٍ أصحاء. غير أنّ نتائج هذه المقايسة تتّسم بالتفاوت الشّديد بين مخبرٍ وآخر نتيجة الاختلافات في شروط إجرائها، بما في ذلك عدد الخلايا التّائيّة المستجيبة (Tresp) المستعملة ونمطها، وطبيعة التّحريض المستعمل وقوّته، ونقاوة الخلايا Tregs، ونسبة Treg:Tresp، وعدد الخلايا المقدّمة للمستضد APC ونمطها (18). وفي كثير من الأحيان كانت القدرة الكابتة للخلايا المنظِّمة في هذه المقايسة غير كاملةٍ، حتّى لدى إضافتها بأعداد كبيرة، ويعزى ذلك إلى تلوّث المحضّرات بالخلايا المستفعلة المفعّلة activated effector T cells التي تعبّر أيضاً عن CD25 وتعرّف بأنّها CD25⁺Fox3^- والتي تستجيب لـ IL-2 المنتج من قبل الخلايا المستجيبةresponder cells CD4⁺CD25^- (19). ونجم ذلك عن قيام غالبيّة هذه الدّراسات بتنقية الخلايا Treg البشريّة ((CD25+ باستعمال كواشف تعتمد حبيبات مغناطيسيّة مقرونة ًبأضداد anti-CD25، عوضاً عن استحصال خلايا تتسّم بكونها عالية التّعبير عن CD25 (أي CD25^bright أو CD25^hi) والتي لا يمكن تفريقها وعزلها عن الخلايا منخفضة التعبير عن CD25 إلا بوسم الخلايا بضدٍّ نوعيٍّ مفلور موجهٍ لـ CD25 واستعمال تقنيّة الجريان الخلوي والفرز للحصول على جمهرتين؛ عالية التّعبير عن CD25 (CD25^high/bright) وسلبيّة CS25 (CD25^-) واستبعاد CD25^lo. ولهذا، لم تتمكّن هذه الدّراسات من ضبط نسبة الخلايا إيجابيّة Foxp3⁺ في محضراتها، ممّا أدّى إلى تلوّث الجمهرات الخلويّة المعزولة بطريقة الحبيبات وبصورة متكرّرة بخلايا CD25⁺Foxp3^- التي تمثّل خلايا تائيّة مستفعلة مفعّلة activated effector T cells.

بناءً على ما سبق، قمنا في هذه الدّراسة بتنقية الخلايا المنظِّمة اعتماداً على تعبيرها العالي عن CD25 وذلك باستعمال الفرز على جهاز الجريان الخلوي، بعد خطوة أولى جرى فيها عزل الخلايا التّائيّة CD4⁺ بطريقة الانتقاء السّلبي، وقيّمت القدرة الكابتة لها بمقايسة كبتٍ في الزجاج وذلك باستعمال حبيبات ميكرويّة حديديّة aCD3: aCD28 كخلايا مقدّمة للمستضد وإضافة أعدادٍ متزايدةٍ من الـ Tregs لتحديد العدد الأمثل الموافق لقدرة كبتٍ شبه كاملة. 

تكاثر الخلايا المستجيبة دون وجود الخلايا المنظِّمة بالمقارنة مع متوسط تكاثرها بوجود الـ Tregs معتدّاً به إحصائيّاً (P-value<0.01)، حتّى لدى إضافتها بالعدد الأدنى المستخدم في المقايسة. ومن الجدير بالملاحظة أنّ إضافة الخلايا المنظِّمة Tregs بأعداد مكافئة لأعداد الخلايا المستجيبة أحدثت تثبيطاً شبه كامل لتكاثرها (الشّكل 3).وبصورة موازية لتأثير الخلايا  Tregs(CD4⁺CD25^hi) الكابت (الكابح) لتكاثر الخلايا المستجيبة، ثبّطت الخلايا Tregs لدى إضافتها بعدد مكافئ لعدد الخلايا CD4⁺CD25^- وبصورة شبه كاملةٍ إنتاج IL-2 في معايرة الكبت في المختبر (الشّكل 4(.

المناقشة Discussion

تتولّد الخلايا التّائيّة CD4⁺ المنظِّمة الطبيعيّة nTreg في الغدّة الصعتريّة كتحت جمهرة من الخلايا التّائيّة الناضجة وظيفيّاً والتي تهاجر لتنضمّ إلى جميعة الخلايا التائيّة المحيطيّة (6). كما تنشأ خلايا منظِّمة محرّضة تعرف بـ iTregs في الدّم المحيطي كنتيجة لاستجابة مناعيّة تلاؤميّة (20). يتّسم كلا نمطي الـ Tregs بالتّعبير الدّائم عن مستويات عالية من السّلسلة a لمستقبل IL-2 (CD25) وعامل الانتساخ Foxp3 والذي يعدّ المنظّم الرئيس لتطوّر الخلايا Treg ووظائفها (16، 17). تتطلّب الدراسات التنميطيّة والوظيفيّة التي تتحرّى تولّد الخلايا التّائيّة المنظِّمة Treg وتمايزها في الأصحاء والمرضى استعمالها بنقاوةٍ عالية وتجنّب تلوّثها، على وجه الخصوص بالخلايا المستفعلة المفعّلة ذات التّعبير المنخفّض عن CD25. تمكّن الطريقة الموصوفة في هذا العمل الباحثين من وصم خلايا بشريّة تائيّة مساعدة CD4⁺ T cells مغناة بطريقة ثنائيّة اللون، وتنقية الخلايا CD4⁺CD25^hi التي يمكن في ما بعد استعمالها مباشرةً واختبارها وظيفيّاً في المختبر أو في الحي، أو إكثارها وتحريض تمايزها في المزارع الخلويّة لتوليد ما يعرف بالخلايا Treg المفعّلة. كما يمكن مستقبلاً إضافة

الشّكل 4: كبت (كبح) الخلايا Tregs (CD4⁺CD25^hi) لإنتاج الانترلوكين 2 (IL-2) من قبل الخلايا التّائيّة المستجيبة (CD4⁺CD25^-).

أضداد للكشف عن مستضدات أخرى بصورة تسبق خطوة الفرز الخلوي أو تليه، بما يتيح تمييز وفرز الخلايا التّائيّة المنظِّمة السّاذجة والتي تعرّف على أنّها إيجابيّة المستضد CD45RA (CD45RA⁺) أو الخلايا التّائيّة المنظِّمة المفعّلة/المتذكّرة activated/memory (CD45RA^-).

تظهر نتائج مقايسة الكبت (الكبح) في المختبر قدرة الخلايا (TregsCD4⁺CD25^hi) المنقّاة، وفق البروتوكول الذي اعتمدناه في هذا البحث، على تثبيط الخلايا التّائيّة المستفعلة وكبح تكاثرها وإنتاجها للانترلوكين 2 بصورة شبه كاملة، وذلك بآلية مستقلّة عن تأثيرها الكابت (الكابح) للخلايا المقدّمة للمستضد APCs، إذ أنّنا استعملنا في مقايسة الكبت (الكبح) حبيبات حديديّة رُبطت بأضدادٍ وحيدة النّسيلة (mAbs) موجّهة لـCD3/CD28 لإحداث تشابك تصالبي لكلٍّ من CD3 وCD28 على سطح الخلايا التّائيّة، مما مكّن من تفعيل الخلايا التّائيّة متعددة النسائل من النمط CD4⁺ وتكثيرها بصورة عالية الكفاءة. يتطلّب تحقيق الكبت (الكبح) الكامل تواجداً عددياً لخلايا Tregs مكافئاً لأعداد الخلايا المستجيبة، و يشير هذا إلى ضرورة القيام ببحوث مستقبليّة تهدف إلى تكثير هذه الخلايا في المختبر وفي الأحياء لكبت (لكبح) ردود الأفعال المناعيّة غير الملائمة أو المبالغ فيها في أمراض المناعة الذّاتيّة والأمراض الالتهابيّة وأمراض الأرجيّة وزرع الأعضاء.

الاستنتاج Conclusion

تبرهن هذه الدّراسة على تمكّننا من عزل الـ Tregs بنقاوةٍ فائقـة ومصونيّـة لوظائفـها الكابتة للاستجابة المناعيّة للخلايا التّائيّة المستفعلة في المختبر. ويمكن للنتائج التي عرضناها في هذه الدّراسة أن تسهم في فهم الوظائف البيولوجيّة لـ Tregs وتساعد على تطوير عوامل دوائيّة وبيولوجيّة يمكن استخدامها لتعديل وظائف الـخلايا المنظِّمة Treg ومنابلة قدراتها الكابتة للمناعة سلباً أو إيجاباً بما يحقّق الأهداف العلاجيّة.

كلمة شكر Acknowledgments

 الشكر الموصول للأستاذ الدكتور مارك تيكوسينسكسي في جامعة بنسلفانيا (حالياً في كلية الطب في جامعة توماس جيفرسون) لاستضافتي في مخابر شعبة المناعة في قسم علم الأمراض والطب المخبري في كلية الطب- جامعة بنسلفانيا. ووافر الشكر والعرفان للهيئة العامة للتقانة الحيوية لتوفير التجهيزات اللازمة لإتمام هذا البحث.