| الملخص Abstract |
| اقترحت بعض الدراسات أضداد بروتين فيروس التهاب الكبد البائي المضفّر (HBSP) واصماً واعداً للمرض الكبدي المرتبط بفيروس التهاب الكبد البائي. عمدنا في دراستنا إلى تصميم مقايسة غير مباشرة للمُمْتَزِّ المَناعِيِّ المُرْتَبِطِ بالإِنْزِيْم (ELISA) بناءً على التسلسلات الجينومية العائدة للنمط الجيني D والمستنبطة من ذراري فيروس التهاب الكبد البائي لمصول مرضى سوريين. جرى اختيار التسلسل الببتيدي المأخوذ من بروتين HBSP وفق مصونيته، وألفة ارتباطه بمعقد التوافق النسيجي من الصف الأول، وتغطيته 80% من التغير بين التسلسلات المدروسة. حيث غُطيت الصفائح الصغرية عالية الارتباط بالببتيد الصنعي المختار وحُددت الشروط المثلى من الحجب، وتمديد العينة، وشروط الحضن. ومن ثم جرى التحقق من مصدوقية المقايسة باختبار مصول مرضى التهاب كبد بائي مزمن ومصول شاهدة. تضمنت خطة العمل استخدام ببتيد صنعي مكون من 20 حمضاً أمينياً يمتد ما بين الموقعين 62 و81 من تسلسل البروتين المكون من 111 حمضاً أمينياً لتغطية آبار الصفيحة الصغرية للـ ELISA، ومزيج الحجب المكوّن من البولي ?ينيل بيروليدون PVP 1% والتوين 20 0.05% في الدارئة الفسفاتية PBS (pH=7.4)، وتمديد العينة بنسبة 100:1في محلول الحجب، والحضن في الدرجة 37°C مدة ساعة بعد إضافة العينة، ثم 30 د. بالدرجة 37°C بعد إضافة أضداد الغلوبولين البشري المقترن بالإنزيم. تميّزت مقايستنا نصف الكمية هذه بنوعيتها العالية. وبالتالي فإن تطويرالاختبار الموصوف هنا إلى مقايسة كمّية يمكن أن يوفر اختباراً غير باضع يمكن استخدامه في الدراسات المستقبلية للمرض الكبدي. |
| Studies have suggested antibodies to hepatitis B splice protein (HBSP) as a promising marker for HBV-associated liver disease. We designed an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on HBV genome sequences obtained from Syrian patients' sera which belonged to genotype D. HBSP-derived peptide sequence was chosen according to its conservation and MHC I binding affinity; and 80%-variability among studied sequences was covered. High binding microplates were coated with the chosen synthetic peptide and assay optimization was performed in terms of blocking, dilution and incubation conditions. The assay was then verified using chronic hepatitis B patients and control sera. Our concluded protocol involved using a 20 aa-length HBSP-derived peptide spanning aa 62 to 81 of the 111 aa-length protein to coat ELISA microplate wells, blocking with PVP1%, Tween 20 0.05% solution in PBS (pH 7.4), diluting serum sample by 1:100 of blocking solution, and incubating sera for 1 hour at 37°C, and anti-human IgG HRP conjugate for 30 minutes at 37°C. Our semi-quantitative assay proved to be highly specific. Consequently, developing the test described herein into a quantitative assay might provide a noninvasive test that can be utilized in the future liver-disease studies. |
| المقدمة Introduction |
يقدر عدد المصابين بالتهاب الكبد البائي المزمن عالمياً بأكثر من 240 مليون مصاب (23). وتعدّ سورية من البلدان ذات الوبائية المتوسطة بالنسبة لفيروس التهاب الكبد البائي، حيث يبلغ معدل انتشاره 7-5% (1). يتميز الفيروس بجينوم مكتنز يقيس 3.2 ألف نوكليوتيد تقريباً ويحوي أربع أطر متراكبة جاهزة للقراءة ORF. يتم انتساخ الجينوم إلى أربع جزيئات رنا مرسال تترجم إلى بروتينات الفيروس اللبي، والسطحي، والبوليميراز، وX (3). تمّ توثيق عدد من جزيئات الرنا المضفّرة في الأدب الطبي (8، 20، 21، 24) يمكن لها أن تتمحفظ وتُنتسخ عكسياً إلى دنا لتعطي جزيئات فيروسية معيبة (8، 22) ترتبط ارتباطاً وثيقاً بالحالة المزمنة من الإصابة دون الحادة (16).
يعد البروتين المضفّر لفيروس التهاب الكبد البائي Hepatitis B Splice-generated Protein (HBSP) المكوّن من 111 حمضاً أمينياً من النواتج المرمَّزة بإحدى جزيئات الرنا المضفرة والتي تقيس 2.2 ألف نوكليوتيد تقريباً. ولقد كُشف هذا البروتين في عينات خزعة الكبد وكذلك أضدادُه في مصول ما يقارب 45% من مرضى التهاب الكبد البائي المزمن (17، 18)؛ كما جرى تأكيد العلاقة المباشرة بين هذا البروتين ووخامة التليف الكبدي، مما يقترح تورطه في الإمراضية الكبدية (11).
كلّ ذلك يقترح أضداد HBSP كواصم واعد للمرض الكبدي المرتبط بفيروس التهاب الكبد البائي (11،18) ويجعلها موضع اهتمام الباحثين محلياً وعالمياً. إنّ توسيع نطاق البحث حول هذه المتثابتة الفيروسية منوطٌ بتطوير مقايسة مناعية خاصةٍ به؛ وحيث أنه لا تتوفر عتيدة تجارية معتمدة لتحري هذه الأضداد، أو طريقة منشورة مصمّمة خصيصاً للنمط الجيني الفيروسي D السائد في بلدنا؛ عمدنا في دراستنا إلى تصميم مقايسة مناعية غير مباشرة مرتبطة بالإنزيم ELISA بناءً على التسلسلات الجينومية لذراري فيروس التهاب الكبد البائي الجائلة محلياً، ومن ثمّ تحديد شروطها المثلى، واختبار فعاليتها لدى بعض المرضى السوريين المزمنين لتكون ركزاً للأبحاث المستقبلية.
|
| المواد والطرق Materials and Methods |
تصميم المقايسة Assay design
|
1. انْتِقاء ببتيد مشتق من بروتين HBSP
Selection HBSP-derived peptide
قمنا بمراجعة بنك الجينات Genbank للحصول على تسلسلات جينوم ذراري HBV المأخوذة من مصول مرضى سوريين، بلغ عددها سبعين تسلسلاً (GenBank Accession No. JN257148-JN257217)، ثم أجري لها رصف متعدد بالنسبة لتسلسلات النمط الجيني D المرجعية بوساطة أداة ClustalW2 (7، 12). جرى بعدها تحديد موقع التضفير الأحادي واستحداثه الكترونياً على هذه الجينومات جميعها ما بين الموضعين النوكليوتيديين 2447 و489. ثم جرت ترجمة التسلسلات النوكليوتيدية المضفّرة الناتجة إلى تسلسلات الأحماض الأمينية الممثّلة للبروتين الناجم عن التضفير الأحادي HBSP للحصول أخيراً على تسلسله المُجمَع عليه consensus. استُخدمت برمجيتان الكترونيتان هما: HLA Peptide Binding Predictions (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hlabind) (14) وSYFPEITHI epitope prediction (http://www.syfpeithi.de) (15) للتنبؤ بألفة ببتيدات بطول تسعة أحماض أمينية (9-mer) مأخوذة من تسلسل البروتين HBSP المجمع عليه للارتباط بنمطي معقد التوافق النسيجي السائدين من الصف الأول (HLA-A*0201 وHLA-B*0702) (13). اختير التسلسل الببتيدي بناءً على مدى مصونيته، وألفة ارتباطه بمعقد التوافق النسيجي، وشموليته للتنوع المشاهد في تسلسلات الذراري المدروسة الجائلة محلياً؛ ومن ثمّ أرسل إلى الشركة المصنّعة لتصنيعه.
2. تغليل الببتيد coating Peptide
أذيب 0.2 ملغ من كلّ متغاير ببتيدي على حدة في 10مل من دارئة كربونات/ بيكربونات الصوديوم ذات pH 9.6. ووزع 50 مكرولتراً من المحلول الناتج ضمن آبار صفيحة الإليزا المصنعة من البولي ستيرين عالي الارتباط (R&D Systems، الولايات المتحدة) بحيث حوى كل بئر 1 مكغ من أحد الببتيدات الصنعية، وحُضنت الصفائح في درجة الحرارة +4°C مدةً تراوحت بين 20-16 ساعة.
|
| تحديد الشروط المثلى Optimization |
1. العينات Samples
استخدمت في تحديد الشروط المثلى مصول أصحّاء، ومصول مرضى التهاب الكبد البائي المزمن منفردةً ومجمَّعة pooled.
2. انتقاء محلول الحجب Blocking solution selection
جرت مقارنة عددٍ من محاليل الحجب البروتينية (محلول الألبومين البقري BSA بتراكيز 1% و2% و3% و4% و5%، محلول الحليب المقشود skimmed milk بتراكيز 1% و2% و3% و4% و5%، مصل الأرنب 10%، مصل الدجاج 10%) وغير البروتينية (توين 0.05%، PVP 1%) في الدارئة الفسفاتية PBS ذات pH 7.4.
3. انتقاء تمديد العينة Sample dilution selection
اختبرت العينات بدون تمديد وبعد تمديدها بمحلول الحجب المنتقى بنسبتين مختلفين (20:1 و100:1)
وقورنت النتائج جميعها.
4. انتقاء شروط الحضن Incubation conditions selection
قورن عدد من شروط الحضن الزمنية والحرارية المقتبسة من الأدب الطبي، بعد تثبيت الشروط الأخرى، باستخدام محلول الحجب وتمديد العينة المُنتقين؛ حيث حُضنت العينات، ثم جرى الحضن مع أضداد الغلوبولين البشري المقترنة بالإنزيم في: (i) الدرجة 25°C مدة 2 سا ثم 2 سا، أو (ii) الدرجة 25°C مدة 1 سا ثم 1 سا (9)، أو (iii) الدرجة 37°C مدة 1 سا ثم 30 د (17)، على الترتيب.
|
| تَوثيقُ مَصْدوقِيَّة المقايسة المناعية ELISA validation |
1. الاعتيان Sampling
أُخذت مصول 80 مريضاً بالغاً (64 من الرجال، 16 من النساء) يعانون من التهاب الكبد البائي المزمن وفق تشخيص طبيب سريري. كما أُخذت مصول 46 فرداً من الأصحّاء (29 من الرجال، 17 من النساء) السليمين من التهابي الكبد B وC، وعُدت مصول شاهدة. حُفظت العينات في -80°C إلى حين المعايرة؛ كما استُحْصِلَ على موافقة مستنيرة من المشاركين في الدراسة جميعهم.
2. التحقق من المقايسة ELISA verification
طُبقت شروط المقايسة، بعد اعتمادها، على مصول المرضى والمصول الشاهدة لكلّ متغاير ببتيدي على حدة، مثنى مثنى، حيث مُددت بمحلول الحجب الأمثل، حسب التمديد المعتمد، ثم وزعت في الآبار المغلّلة بحجوم تساوي 50 مِكْرُولِتراً. وبعد الحضن في الشروط المثلى المعتمدة، غُسلت الآبار ثلاث مرات بمحلول الغسل (الدارئة الفسفاتية PBS ذات pH 7.4 المضاف له توين 20 بنسبة 0.05%) وأضيف50 مكل من أضداد الغلوبلين البشري المقترن بالإنزيم horseradish peroxidase-conjugated antibodies (Promega، الولايات المتحدة) لتُحضَن ثانيةً وفق الشروط المثلى المعتمدة. بعد غسل الآبار ثلاث مرات بمحلول الغسل نفسه أضيف 50 مكل من محلول الركازة O-phenelene diamine (OPD) المحضّر بتركيز 0.04% في محلول حمض الليمون 0.1 مول مع تعديل درجة PH إلى 5 بواسطة NaOH، وإضافة الماء الأكسجيني 30% بنسبة 0.5 مل/ لتر. بعد الحضن في درجة حرارة الغرفة 15 دقيقة أضيف محلول حمض الكبريت 1 مول لإيقاف التفاعل وقُرئت الآبار باستخدام مقياس الطيف الضوئي (مجال القراءة ما بين 0.000 و3.000) على موجة طولها 490 نم. حُسب متوسط فرق القراءات لكلّ متغاير ببتيدي، حيث جرى الحصول على ثلاث قراءات لكلّ عينة. اعتُمد في تحديد القيمة الحدية cutoff value على قراءات المصول الشاهدة بعد جمع متوسطات القراءات مع ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري (cut-off value = Mean + 3SD)، واعتبرت العينة إيجابية إذا تجاوزت قراءتها القيمة الحدية المحسوبة لمتغاير ببتيدي واحد على الأقل. أعيد اختبار العينات الإيجابية على آبار فارغة غير مغللة بالمستضد للتحقق من نوعية الإشارة الضوئية.
|
| الدراسة الإحصائية Statistical analysis |
| حُسبت متوسطات قراءات الكثافة الضوئية optical density (OD) وانحرافاتها المعيارية، وجرت المقارنة بين المتوسطات باستخدام اختبار ستيودنت واعتُبرت قيمة p<0.05 معتداً بها إحصائياً. واستخدم برنامج إكسل 2010 لإجراء الدراسة الإحصائية. |
| النتائج Results |
1. الببتيد المنتقى Selected peptide
انتقي ببتيد مكوّن من 20 حمضاً أمينياً أحرز مستوىً عالياً من المصونية وألفة الارتباط، واخترنا العمل على ثلاثة متغايرات variants له:
المتغاير 1: LLLKEPLCIPPVAVPNLRTE؛ المتغاير 2: LLLKEPLCIPPAAVPNLRTE؛ المتغاير 3: LLLKEPLCIPPVAVQNLRTE غطّت 80% من التنوّع المشاهد في التسلسلات الببتيدية المدروسة جميعها. ولقد جرى اصطناع هذه المتغايرات الببتيدية بنقاوة تزيد على 80% (piProteomics، الولايات المتحدة).
2. محلول الحجب المنتقى
Selected blocking solution
تراوحت قراءات العينات المختبرة بين 1.199 و2.806 وخارج المجال (3.000 < OD)، عند استخدام محلول الألبومين البقري BSA 1%، وبين 0.835 و2.911 عند استخدام الحليب المقشود 1%. بلغت متوسطات القراءات عند استخدامBSA بتراكيز 1-5% القيم التالية: 0.89، 0.91، 0.98، 1.10، 1.22، على الترتيب. وعند استخدام الحليب المقشود بتراكيز 1-5% كانت القيم 1.25، 1.08، 1.04، 0.99، 0.81، على الترتيب، فلم يكن هنالك فروق إحصائية بين القراءات عند زيادة تراكيز أي من محلولي الحجب آنفي الذكر (p>0.05).
لم تبدِ القراءات فروقاً إحصائية في حال وجود محاليل الحجب البروتينية الأخرى (مصل الأرنب 10%، حيث بلغ متوسط القراءات عند وجوده 0.43، مصل الدجاج 10%، حيث بلغ متوسط القراءات عند وجوده 0.74)؛ بينما كان متوسط القراءات بدون محلول حجب 0.56 (p>0.05). وبدا الفرق معتداً به إحصائياً عند استخدام محاليل الحجب غير البروتينية (توين 0.05%، حيث بلغ متوسط القراءات عند وجوده 0.39،PVP 1%، حيث بلغ متوسط القراءات عند وجوده 0.37؛ بينما كان متوسط القراءات بدون محلول حجب 0.56) (p<0.05).
لذلك اخترنا أن نستخدم، من أجل الحجب، مزيجاً مكوناً من PVP 1% والتوين 0.05% في الدارئة الفسفاتية PBS (الجدول 1).
3. تمديد العينة Sample dilution
كانت معظم قراءات المصول الشاهدة خارج المجال (3.000 < OD) عند عدم تمديد العينة، وتراوحت ما بين 1.106 و2.253 (بمتوسط 1.63) عند استخدام التمديد 20:1، وبين 0.37 و0.826 (بمتوسط 0.56) عند استخدام التمديد 100:1 مع فارق معتد به إحصائياً (p<0.001) بالمقارنة مع قراءات التمديد 20:1 (الجدول 1).
4. شروط الحضن Incubation conditions
لم يكن هنالك فارق إحصائي بين متوسط القراءات الناتجة عن حضن العينات، ثم الحضن مع أضداد الغلوبولين البشري المقترنة بالإنزيم في الدرجة 25°C مدة 2 سا ثم 2 سا، والدرجة 25° Cمدة 1 سا ثم 1 سا، على الترتيب (p=0.07)، وكذلك بين الدرجة 25° Cمدة 1 سا ثم 1 سا، والدرجة 37°C مدة 1 سا ثم 30 د، على الترتيب (0.4p=) (الجدول 1).
5. التحقق من المقايسة Assay verification
بلغ متوسط قراءات عينات المرضى للمتغايرات الببتيدية 1 و2 و3: 0.72 و0.76 و0.81 وانحرافها المعياري 0.26 و 0.26 و0.27، على الترتيب. أمّا متوسط قراءات المصول الشاهدة للمتغايرات الببتيدية 1 و2 و3: 0.59 و0.55 و0.61 وانحرافها المعياري 0.17 و0.21 و0.18، على الترتيب. ولدى استخدام اختبار ستيودنت كان هنالك فارق يعتدّ به إحصائياً بين متوسط قراءات مجموعة المرضى والمصول الشاهدة، حيث كان الاحتمال أصغر من 0.001 للمتغايرات الببتيدية جميعها (الأشكال 1، 2، 3). وهكذا كانت القيم الحدية من أجل المتغايرات الببتيدية 1 و 2 و 3: 1.1 و 1.18 و 1.16 على الترتيب.
حصلنا على قراءات إيجابية لمتغاير واحد على الأقل في مجموعة مرضى التهاب الكبد البائي المزمن وبلغ عددها سبع عينات؛ منها خمس عينات تم كشفها بالمتغايرات الثلاثة جميعاً، واثنتان جرى كشفهما بأحد المتغايرين 1 و3. ولدى إعادة اختبار العينات الإيجابية السبعة على آبار فارغة غير مغلّلة بالمستضد كان هناك فارق إحصائي بين قراءات الآبار المغللة والفارغة وكانت الدلالة الإحصائية أصغر من 0.0001 للمتغايرات الثلاثة جميعها. ولم تتجاوز قراءة أي عينة من المصول الشاهدة القيمة الحدية للمتغايرات الثلاثة جميعها.
|
| الجدول 1. نتائج اختبارات تحديد الشروط المثلى للمُقَايَسَةُ غير المباشرة للمُمْتَزِّ المَناعِيِّ المُرْتَبِطِ بالإِنْزِيْم لتحري الأضداد المصلية لبروتين فيروس التهاب الكبد البائي المضفّر |
الدلالة الإحصائية2 |
نتيجة الاختبار (قراءة الكثافة الضوئية)1 |
الاختبار |
|
|
محلول الحجب blocking solution |
NA 4 |
تراوحت القراءات ما بين 1.199 و2.806 وأخرى خارج المجال 3 |
ألبومين بقري BSA 1% |
NA 4 |
تراوحت القراءات ما بين 0.835 و2.911 وأخرى خارج المجال 3 |
حليب مقشود 1% |
0.05 P > |
متوسط القراءات عند استخدام BSA 1%: 1.22
متوسط القراءات عند استخدام BSA 2%: 0.91
متوسط القراءات عند استخدام BSA 3%: 0.89
متوسط القراءات عند استخدام BSA 4%: 1.10
متوسط القراءات عند استخدام BSA 5%: 0.98 |
ألبومين بقري BSA (1%-2%)
ألبومين بقري BSA (1%-3%)
ألبومين بقري BSA (1%-4%)
ألبومين بقري BSA (1%-5%) |
0.05 P > |
متوسط القراءات عند استخدام الحليب المقشود 1%:1.25
متوسط القراءات عند استخدام الحليب المقشود 2%:1.04
متوسط القراءات عند استخدام الحليب المقشود 3%:1.08
متوسط القراءات عند استخدام الحليب المقشود 4%:0.99
متوسط القراءات عند استخدام الحليب المقشود 5%:0.81 |
حليب مقشود (1%-2%)
حليب مقشود (1%-3%)
حليب مقشود (1%-4%)
حليب مقشود (1%-5%) |
0.05 P > |
متوسط القراءات عند وجوده: 0.43
متوسط القراءات بدون محلول حجب: 0.56 |
مصل أرنب 10% |
0.05 P > |
متوسط القراءات عند وجوده:0.74
متوسط القراءات بدون محلول حجب: 0.56 |
مصل دجاج 10% |
P<0.05 |
متوسط القراءات عند وجوده: 0.39
متوسط القراءات بدون محلول حجب: 0.56 |
توين20 0.05% |
P<0.05 |
متوسط القراءات عند وجوده: 0.37
متوسط القراءات بدون محلول حجب: 0.56 |
1% PVP) Polyvinylpyrrolidone ) |
|
تمديد العينة في محلول الحجب المختار5
(حجم العينة: حجم الممدد) |
|
معظم القراءات خارج المجال3 |
بدون تمديد |
p < 0.001 6 |
تراوحت القراءات بين 1.106 و2.253، متوسط القراءات 1.63 |
20:1 |
تراوحت القراءات بين0.37 و0.826، متوسط القراءات 0.56 |
100:1 |
|
|
شروط الحضن7 |
p= 0.07 |
متوسط القراءات الناتجة عن الحضن بدرجة حرارة 25°C مدة 2 سا ثم 2 سا: 0.76
متوسط القراءات الناتجة عن الحضن بدرجة حرارة 25°C مدة 1 سا ثم 1 سا: 0.65 |
الدرجة 25°C مدة 2 سا ثم 2 سا |
الدرجة 25°C مدة 1 سا ثم 1 سا |
P= 0.4 |
متوسط القراءات الناتجة عن الحضن بالدرجة 37°C مدة 1 سا ثم 30 د: 0.64 |
الدرجة 25°C مدة 1 سا ثم 1 سا |
الدرجة 37°C مدة 1 سا ثم 30 د |
1 الكثافة الضوئية optical density (OD) تعبرعن امتصاصية الضوء الذي يتناسب مع التركيز وليس لها واحدة.
2 استخدم اختبار ستيودنت للمقارنة بين متوسطين، واعتبرت (P<0.05) هامة إحصائياً.
3 مجال القراءة: تتراوح قيم قراءات الكثافة الضوئية التي يعطيها قارئ الإليزا بين (0.000- 3.000).
4 Non applicable: NA لم يجر اختبار إحصائي.
5 محلول الحجب المختار: محلول PVP 1%، توين 20 0.05% في الدارئة الفسفاتية PBS ذي درجة باهاء 7.4.
6 كان الفارق هاماً إحصائياً بين متوسطي القراءات (1.63، 0.56) عند استخدام التمديدين 20:1 و100:1.
7 هناك زمنان للحضن الأول حضن العينات مع الصفائح المغللة والثاني حضن أضداد الغلوبولين البشري مع الصفائح.
 |
| المناقشة Discussion |
| عمدنا في دراستنا إلى تطوير اختبار إليزا ELISA غير مباشر لكشف الأضداد المصلية لبروتين HBSP، واخترنا منذ البداية أن يرتكز تصميم الطريقة على تسلسلات ببتيدية مستنبطة من ذرارٍ جائلة في سورية لتغليلها على آبار صفائح الإليزا. اعتمدنا في اختيار هذه التسلسلات الببتيدية على برمجيات حاسوبية تتنبّأ بألفة ارتباطها مع معقد التوافق النسيجي من الصف الأول، واحتوائها على حواتم epitopes، وقدرتها بالنتيجة على توليد الأضداد، حيث أبدى التسلسل المختار أحرازاً تنبّؤية جيدة، واحتوى أكثر من حاتمة مستضدية ممّا يرفع احتمال كشف الأضداد، كما نال استحسان الشركة المصنعة إثر استشارتها. إن اختيارنا للمنطقة الواقعة ما بين الحمضين الأمينيين 62 و81 من بروتين HBSP كان منوطاً كذلك بمصونيتها العالية، إذ لم تُبدِ سوى تغاير طفيف في تسلسل الأحماض الأمينية. وهكذا استخدمنا متغايرات variants ثلاثة تتفاوت فيما بينها في حمض أميني واحد كي نزيد قدرة كشف الطريقة، ونُخضعها للمقارنة التحليلية. |
تغليل المستضد Antigen coating
كان اختيارنا لدارئة كربونات/ بيكربونات الصوديوم ذات pH 9.6 في عملية التغليل يعوّل على تأمينه درجة pH أعلى بدرجتين من نقطة تساوي الكهربية (6.28) للمتغايرات الببتيدية الثلاثة جميعها (4)، لتصبح بالتالي ذات شحنة سالبة، وتلتصق بشكلٍ أفضل على سطح البئر. ولضمان كفاءة التغليل اخترنا أطول زمنٍ ممكن للحضن، كما تميزت صفائح الإليزا المستخدمة بأنها عالية الألفة لربط الببتيدات.
محلول الحجب Blocking solution
إنّ تغليل الآبار بالمستضد لا يضمن تغطيةً شاملةً لسطوحها الداخلية، وقد تبقى بعض مساحات منها فارغة. يفيد محلول الحجب في استكمال تغطية سطح البئر غير المرتبط مع المستضد لمنع أي ارتباط لا نوعي يؤثر في الكثافة الضوئية. إنّ القراءات المرتفعة التي بدت لدى استخدام محلولي الألبومين البقري والحليب المقشود، وخروجها عن مجال القراءة أحياناً (3.000
تمديد العينة Sample dilution
تنجم القراءات في المصول الشاهدة عادةً عن التفاعلات غير النوعية التي هدفنا إلى تخفيضها إلى حدودها الدنيا باختيارنا تمديد العينة الأعلى 100:1.
شروط الحضن incubation conditions
نظراً لعدم تفاوت أداء المقايسة ما بين مختلف شروط الحضن الحرارية والزمنية المختبرة، فقد وقع اختيارنا على شروط الحضن ذات الزمن الأقصر بهدف إنجاز المقايسة بأسرع وقت ممكن دون أن يؤثّر ذلك سلباً على جودتها.
محلول الغسل Washing solution
استخدم في عمليات الغسل الدارئة الفسفاتية PBS ذات pH 7.4 المضاف لها توين 20 بنسبة 0.05% باعتباره مادة فعالة على السطح تزيل المواد غير المرتبطة، ممّا يخفف التفاعلات غير النوعية، ويحسّن نوعية الطريقة.
التحقق من المقايسة Assay verification
إن الفرق الإحصائي الكبير بين قراءات مصول المرضى والمصول الشاهدة لهو دليل على نوعية الطريقة العالية، وارتباط الإيجابية بالمرض. تضمّنت مصول المرضى سبع عينات إيجابية بالنسبة لمتغاير واحد على الأقل، حيث لم يتمكن المتغاير 2 من كشف عينتين منها بدت إيجابيتهما باستخدام أحد المتغايرين 1 أو 3، لذا يمكن القول بأفضلية هذين الأخيرين من حيث الحساسية.
الاستنتاج Conclusion
قدمنا في دراستنا هذه مقايسةً مصلية مناعية غير مباشرة Indirect ELISA تهدف إلى التحري عن أضداد البروتين الناجم عن التضفير الأحادي anti-HBSP لدى مرضى التهاب الكبد البائي المزمن. وتميّزت هذه المقايسة بنوعيتها الجيدة، وتصميمها المعتمد على التسلسلات الجينومية العائدة للنمط الجيني D والمستنبطة من ذرارٍ فيروسية جائلة في سورية، كما قمنا بانتقاء شروطها المثلى. وباعتبارها نصف كمية فإنّ تطويرها في دراسات لاحقة إلى مقايسة كمّية مدروسة الحساسية سيفيد في توفير اختبار مصلي غير باضع قد يكون ذا مدلول سريري هام في ما إذا تمّ إثبات ارتباط هذه المتثابتة الفيروسية مع متثابتات المرض الكبدي الأخرى كخزعة الكبد.
|
| المراجعReferences |
1-Antaki N; Haffar S; Ali Deeb S; Assaad F; Abou Harb R; Zeibane N; Nasserelddine M; Ibrahim N; Alhaj N; Jabbour E; Aaraj R; Antaki F; Kebbewar K. and Syrian Working Group for the Study of Viral Hepatitis.
High prevalence of HBV genotype D in Syria and the clinical characteristics of hepatitis B e antigen-negative chronic hepatitis B.
Epidemiol Infect; 2010; 138: 40-44.
2-Berth M. and Bosmans E.
Prevention of assay interference in infectious-disease serology tests done on the Liaison platform.
Clin Vaccine Immunol; 2008; 15: 891–892.
3-Collier L; Oxford J. and Kellam P.
Human Virology,
4th edition. Oxford; Oxford University Press; 2011; 365 p.
4-Crowther JR.
ELISA: Theory and Practice.
Totowa, New Jersey; Humana Press; 1995; 256 p.
5-Dise T. and Brunell PA.
Anti-bovine antibody in human sera as a cause of nonspecificity in enzyme immunoassay.
J Clin Microbiol; 1987; 25: 987–990.
6-Gibbs J.
Optimizing the immobilization of protein and other biomolecules: ELISA Technical Bulletin No. 2. New York: Corning Incorporated, Life Science; 8 p.
7-Goujon M; McWilliam H; Li W; Valentin F; Squizzato S; Paern J. and Lopez R.
A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI.
Nucleic Acids Res; 2010; 38: W695-W699.
8-Günther S; Sommer G; Iwanska A. and Will H.
Heterogeneity and common features of defective hepatitis B virus genomes derived from spliced pregenomic RNA.
Virology; 1997; 238: 363-371.
9-Holtzhauer M.
Basic methods for the biochemical lab.
Germany; Springer; 2006; 252 p.
10-Inter Bio Tech.
Buffers and saturating agents.
France; Inter Bio Tech; 2011; 5 p.
11-Kremsdorf D; Soussan P; Paterlini-Brechot P. and Brechot C.
Hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma: paradigms for viral-related human carcinogenesis.
Oncogene; 2006; 25: 3823-3833.
12-Larkin MA; Blackshields G; Brown NP; Chenna R; McGettigan PA; McWilliam H; Valentin F; Wallace IM; Wilm A; Lopez R; Thompson JD; Gibson TJ. and Higgins DG. Clustal W. and Clustal X version 2.0.
Bioinformatics; 2007; 23: 2947-2948.
13-Mancini-Bourgine M; Bayard F; Soussan P; Deng Q; Lone YC; Kremsdorf D. and Michel ML.
Hepatitis B virus splice-generated protein induces T-cell responses in HLA-transgenic mice and hepatitis B virus-infected patients.
J Virol; 2007; 81: 4963-4972.
14-Parker KC; Bednarek MA. and Coligan JE.
Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains.
J Immunol; 1994; 152: 163-175.
15-Rammensee H; Bachmann J; Emmerich NP; Bachor OA. and Stevanovi? S.
SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs.
Immunogenetics; 1999; 50: 213-219.
16-Rosmorduc O; Petit MA; Pol S; Capel F; Bortolotti F; Berthelot P; Brechot C. and Kremsdorf D.
In vivo and in vitro expression of defective hepatitis B virus particles generated by spliced hepatitis B virus RNA.
Hepatology; 1995; 22: 10-19.
17-Soussan P; Garreau F; Zylberberg H; Ferray C; Brechot C. and Kremsdorf D.
In vivo expression of a new hepatitis B virus protein encoded by a spliced RNA.
J Clin Invest; 2000; 105: 55-60.
18-Soussan P; Tuveri R; Nalpas B; Garreau F; Zavala F; Masson A; Pol S; Brechot C. and Kremsdorf D.
The expression of hepatitis B spliced protein (HBSP) encoded by a spliced hepatitis B virus RNA is associated with viral replication and liver fibrosis.
J Hepatol; 2003; 38: 343-348.
19-Studentsov YY; Schiffman M; Strickler HD; Ho GY; Pang YY; Schiller J; Herrero R. and Burk RD.
Enhanced enzyme-linked immuno-sorbent assay for detection of antibodies to virus-like particles of human papilloma virus.
J Clin Microbiol; 2002; 40: 1755–1760.
20-Su TS; Lai CJ; Huang JL; Lin LH; Yauk YK; Chang CM; Lo SJ. and Han SH.
Hepatitis B virus transcript produced by RNA splicing.
J Virol; 1989; 63: 4011-4018.
21-Suzuki T; Masui N; Kajino K; Saito I. and Miyamura T.
Detection and mapping of spliced RNA from a human hepatoma cell line transfected with the hepatitis B virus genome.
Proc Natl Acad Sci, USA; 1989; 86: 8422-8426.
22-Terré S; Petit MA and Bréchot C.
Defective hepatitis B virus particles are generated by packaging and reverse transcription of spliced viral RNAs in vivo.
J Virol; 1991; 65: 5539-5543.
23-World Health Organization. Hepatitis B: Fact sheet N204. WHO. 2012. Available:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/.
Accessed 27 March 2013.
24-Wu HL; Chen PJ; Tu SJ; Lin MH; Lai MY. and Chen DS.
Characterization and genetic analysis of alternatively spliced transcripts of hepatitis B virus in infected human liver tissues and transfected HepG2 cells.
J Virol; 1991, 65: 1680-1686.
|
| |
| |
