بحث في أعداد المجلة الجملة   المؤلف

المجلد 7 , العدد 2 , ربيع الأول 1435 - كانون الثاني (يناير) 2014   دراسة مستويات أضداد النمط الثاني من الكولاجين لدى مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ Studying levels of Anti-Type II Collagen Antibodies in Rheumatoid Arthritis Patients د. سهير آغا*، أ.د. حسان لايقة**، أ.د. خليل القوتلي* Agha S*; Layka H**. and AL- Kwatli Kh* *كلية الصيدلة، **كلية الطب، جامعة دمشق *Faculty of Pharmacy, **Faculty of Medicine, Damascus University الملخص Abstract التهاب المفاصل الروماتويديّ (RA) هو اضطراب التهابي جهازي مع إمراض مناعي ذاتي. وتكون الأضداد الذاتية المرافقة لالتهاب المفاصل الروماتويدي أدوات مصلية مساعدة تفيد في التشخيص الدقيق. يشكل النمط الثاني من الكولاجين Type II collagen واحداً من أهم المستضدات الذاتية في التهاب المفاصل الروماتويديّ (RA) لتواجد الأضداد الذاتية للنمط الثاني من الكولاجين لدى مريض التهاب المفاصل الروماتويدي، وبصورة خاصة في المراحل الباكرة من المرض. تهدف الدراسة إلى تقييم المستويات المصلية لأضداد النمط الثاني من الكولاجين وتقييم حساسيتها ونوعيتها في مصول مرضى مصابين بالتهاب المفاصل الروماتويديّ (RA). جرت مقايسة المستويات المصلية لأضداد النمط الثاني من الكولاجين Anti-type II Collagen باستخدام طريقة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ELISA لدى 70 مريضاً مصاباً بالتهاب المفاصل الروماتويديّ }29 منهم في المرحلة الباكرة للمرض (مضى على تشخيصهم أقل من عام) و41 مريضاً في مرحلة متأخرة من المرض (مضى على تشخيصهم أكثر من عام){ و 18 شاهداً صحيحاً. كانت مستويات اضداد النمط الثاني من الكولاجين مرتفعة بشكلٍ يعتد به إحصائياً لدى مجموعة مرضي التهاب المفاصل الروماتويديّ، مقارنة مع مجموعة الشاهد (P=0.0015)، خاصة في المراحل الباكرة، بقيمة حدية 5 وحدة دولية/ مل، وبحساسية ونوعية 24.4% و94.4%، على الترتيب. وكاستنتاج، ارتفعت مستويات أضداد النمط الثاني من الكولاجين لدى مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ، خاصة خلال المراحل الباكرة من المرض. لذلك فإن قياس المستويات المصلية لأضداد النمط الثاني من الكولاجين تدعم التشخيص الباكر لالتهاب المفاصل الروماتويديّ.   Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory systemic disorder with an autoimmune pathogenesis. Rheumatoid arthritis associated auto antibodies are helpful serological tools in stating the definite diagnosis. Type II collagen is one of the most important auto-antigens in Rheumatoid arthritis, because of presence of antitype II collagen auto antibodies in rheumatoid arthritis patient, especially in early stages of the disease. The study aims to evaluate serum levels of anti-type II collagen antibodies and its specificity and sensitivity in sera of patients with rheumatoid arthritis (RA). Serum levels Anti-type II collagen antibodies levels were assayed in 70 RA patients {29 of them in early-disease (less than year of diagnoses), and 41 patients of late disease (more than year of diagnoses)} and 18 healthy control using Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA. levels of Anti-type II collagen were significantly elevated in Rheumatoid Arthritis patients, compared to the control group (P=0.0015), especially in early stages, with cut-off value 5 lU/ml, the sensitivity and specificity of anti-type II collagen assay was 24.4%, 94.4%, respectively. As conclusion, levels of Anti-type II collagen elevated in Rheumatoid Arthritis patients, especially in early stages. Therefore, measuring serum levels of anti-type II collagen support the early diagnosis of Rheumatoid arthritis.   المقدمة Introduction  التهاب المفاصل الروماتويديّ (RA) Rheumatoid arthritis مرضٌ التهابيٌ جهازيٌ مناعي ذاتي مزمن يصيب 0.4-1% من السكان في جميع أنحاء العالم (1-3). ويُشخّص التهاب المفاصل الروماتويديّ استناداً إلى مجموعة من المعايير السريرية والمصلية والشعاعية. وتمنع المعالجة الباكرة للمرض تضرر المفاصل غير العكوس وتخفض العلامات التآكلية وتحسن أداء المفصل، مما يتطلب تشخيصاً موثوقاً خلال المراحل الباكرة من المرض. يترافق التهاب المفاصل الروماتويديّ مع مجموعة من الأضداد الذاتية التي تساعد في التشخيص الباكر للمرض (4-6). يعد النمط الثاني من الكولاجين أهم المستضدات الذاتية في الغضروف المفصليarticular cartilage وهدفاً أساسياً للاستجابة المناعية في التهاب المفاصل الروماتويديّ (7). تتواجد أضداد النمط الثاني من الكولاجين في كل من السائل الزليلي Synovial fluid ومصل مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ (RA)؛ تتألف هذه الأضداد من مجموعة من الصفوف الثانوية للغلوبولينات المناعية (IgG) وتبلغ ذروة ارتفاعها خلال المراحل الباكرة من التهاب المفاصل الروماتويديّ Early RA (8). قد تتدخل أضداد النمط الثاني من الكولاجين في إمراضية التهاب المفاصل الروماتويديّ (RA)، حيث ترتبط هذه الأضداد على سطح الغضروف المفصلي محفزةً إبتداء الاستجابة الالتهابية. فتقوم بتثبيت المتممة وشطر مكون المتممة (C5) إلى شكله المتدرك (C5a)، القادر على جذب العدلات والبلاعم وتفعيلها. وتفرز البلاعم المفعلة السيتوكينات المؤيدة للالتهاب وأهمها: αTNF-، IL-1β، IL8، IL-6، بالإضافة إلى البروستاغلاندينات وأكسيد النترات. تؤدي هذه العوامل بدورها إلى جذب العديد من الخلايا المناعية المتنوعة كالخلايا التغصنية (DC) dendritic cells، الخلايا التائية والبائية، بالإضافة إلى ارتشاح وتفعيل الخلايا المناعية كالأرومات الليفية Fibroblast الزليلة المسؤولة عن إنتاج إنزيمات تدرك المطرس خارج الخلوي (ECM) extra cellular matrix، خاصة إنزيمات الكولاجيناز المسؤولة عن تدرك النمط الثاني من الكولاجين والتي تؤدي بالتالي إلى زيادة تدرك الكولاجين )9). تمتلك أضداد النمط الثاني من الكولاجين أهمية حيوية تشخيصية وإنذارية، فلقد أظهرت الدراسات السريرية ارتفاع مستويات الواصمات الالتهابية كمستويات البروتين المُتَفاعِلُC (CRP) و سُرْعَةُ تَثَفُّلِ الكُرَيَّاتِ الحُمْر (ESR)، بالإضافة إلى مستويات السيتوكينات المؤيدة للالتهاب كعامل التنخر الورمي ألفا ( (TNF-α والانترلوكين 6 (IL-6) لدى المرضى إيجابيي أضداد النمط الثاني من الكولاجين، مقارنة مع المرضى سلبيي هذه الأضداد (10، 11).   المرضى والمواد والطرق Patients, Materials and Method   المرضى Patients شملت الدراسة 70 مريضاً (51 أنثى و19 ذكراً)، المتوسط الحسابي والانحراف المعياري لأعمارهم SD±X = 42.8±12.83 عاماً. جرى تشخيص إصابتهم بالتهاب المفاصل الروماتويديّ حسب معايير الجمعية الامريكية لأمراض الروماتيزم عام 1987 في العيادات والشعب المفصلية لكل من مستشفى الأسد الجامعي ومستشفى المواساة. قسمت مجموعة مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ، تبعاً لمدة التشخيص، إلى: 1- مجموعة مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ الباكر (التشخيص منذ أقل من عام): شملت هذه المجموعة 29 مريضاً (20 أنثى و 9 ذكور). 2- مجموعة مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ المتأخر (التشخيص منذ أكثر من عام): شملت هذه المجموعة 41 مريضاً (31 أنثى و 10 ذكور). 3- المجموعة الشاهدة/ شملت 18 عينة (13 أنثى و 5 ذكور) لأشخاص أصحاء لم يعانوا آلاماً مفصليةً أو أمراضاً مناعيةً ذاتيةً سابقة. ويوضح الجدول 1 توزع العينات المرضية والشواهد. المواد والطرق Materials and Method الاعتيان وتخزين العينات Sampling and Storage جرى جمع 5 مل دم في أنابيب جافة ثم نُبذت العينات خلال 45 دقيقة كحد أقصى بسرعة 1200 دورة/ دقيقة ولمدة خمس دقائق، بدرجة حرارة 18C °، وحفظت المصول في أنابيب ايبنورف في درجة حرارة -80C °. مقايسة مستويات أضداد النمط الثاني من الكولاجين Anti-Type II Collagen جرت المقايسة باستخدام عتيدة ELISA Kit Anti-Type II Collagen (2051) المصنعة من شركة Chondrex الأمريكية، الولايات المتحدة الامريكية، تسمح هذه العتيدة بالمعايرة الكمية لمستويات أضداد النمط الثاني من الكولاجين في المصل بطريقة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ELISA. الدراسة الإحصائية جرى التعبير عن القيم بالمتوسط الحسابي والانحراف المعياري ومجال القيم لكل مجموعة واعتمد اختبار T-Student لتحديد ما إذا كان الفارق بين المتوسطات ناجماً عن المصادفة أم حقيقياً، واعتمدت أيضاً القيمة P<0.05 كقيمة يعتد بها إحصائياً. تم حساب الحساسية والنوعية اعتماداً على القانون: المجموعة المرضية والمجموعة الشاهدة (الشكل 1). 2- مقارنة المستويات المصلية لأضداد النمط الثاني من الكولاجين بين المراحل المرضية الباكرة والمتأخرة والمجموعة الشاهدة:     النتائج Results  المستويات المصلية لأضداد النمط الثاني من الكولاجين لدى مجموعات الدراسة 1- المجموعة المرضية والمجموعة الشاهدة: بلغت قيمة المتوسط الحسابي ± الانحراف المعياري لتراكيز أضداد النمط الثاني من الكولاجين (IgG) Anti-CII X±SD: 3.96±3.5 U/ml لدى مجموعة مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ، بينما بلغت هذه القيم لدى المجموعة الشاهدة X±SD: 2.2±1.9 U/ml. وعند إجراء اختبار T-Student لوحظ فارق يعتد به إحصائياً (P=0.001515) بين بلغت قيمة المتوسط الحسابي ± الانحراف المعياري لتراكيز أضداد النمط الثاني من الكولاجين X±SD: 4.98±3.7 U/ml لدى المجموعة الباكرة وX±SD: 3.25±3.21 U/ml لدى المجموعة المتأخرة. وعند إجراء اختبار T -Student لوحظ فارق معتد به إحصائياً (P= 0.047) بين مجموعة الحالات الباكرة ومجموعة الحالات المتأخرة من التهاب المفاصل الروماتويديّ. ولوحظ أيضاً فارقٌ هامٌ جداً (P= 0.000812) بين مجموعة مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ الباكرة والمجموعة الشاهدة، بينما لم يلاحظ أي فارقٍ إحصائيٍ هامٍ بين مجموعة مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ المتأخرة والمجموعة الشاهدة (P= 0.0875) (الشكل 2). 3- القيمة التشخيصية لأضداد النمط الثاني من الكولاجين جرى حساب القيمة الحدية لتشخيص التهاب المفاصل الروماتويديّ (RA) عبر العلاقة: القيمة الحدية = المتوسط الحسابي لتراكيز الشواهد + ضعفي قيمة الانحراف المعياري لها. ولقد اعتمدت هذا العلاقة بناءً على توصيات الشركة المصنعة للعتيدة واستناداً إلى العديد من الدراسات العلمية السابقة (10). ولدى تطبيق هذه العلاقة حصلنا على القيمة الحدية 5 وحدة دولية/ مل. ولقد ظهرت الإيجابية لدى 17 عينة من أصل 70 عينة مرضية عند هذه القيمة. وعينة واحدة من أصل 18 عينة من الشواهد، حيث بلغت الحساسية التشخيصية لأضداد النمط الثاني من الكولاجين IgG Anti-CII في تشخيص التهاب المفاصل الروماتويديّ عند هذه القيمة الحدية (القاطعة) 24.4% وبلغت النوعية 94.4%.     المناقشة Discussion  يشكل النمط الثاني من الكولاجين البنية الأساسية للغضروف المفصلي وأحد أهم المستضدات الذاتية في التهاب المفاصل الروماتويديّ، حيث أُثبت وجود أضداد النمط الثاني من الكولاجين بصورة متكررة في كل من المصل والسائل الزليلي. واتصفت معايرة هذه الأضداد سابقاً بصعوبة تطبيقها روتينياً في الاختبارات السريرية، إلا أن مقايسة الأضداد الذاتية لحواتم epitopes النمط الثاني من الكولاجين أصبحت أكثر سهولة في الوقت الحالي. ومن الممكن أن تساعد في تشخيص التهاب المفاصل الروماتويديّ، نتيجة ارتفاعها الملحوظ في الفترة القريبة من التشخيص حيث تبلغ ذروتها (12). أظهرت نتائج الدراسة ارتفاعاً واضحاً في المستويات المصلية لأضداد النمط الثاني من الكولاجين (Anti-CII) لدى مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ، مقارنة مع المجموعة الشاهدة وبفارق إحصائي يعتد به وعند القيمة الحدية (القاطعة) 5 وحدة دولية/ مل بلغت الحساسية 24.4% والنوعية 94%. ولقد أظهرت نتائج دراستنا تقارباً مع دراسة العالم Kim وزملائه (10) عام 2000، التي وجدت فارقاً يعتد به إحصائياً في مستويات أضداد النمط الثاني من الكولاجين بين مجموعة مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ (عددهم 297 مريضاً) ومجموعة الشواهد (عددها 50 شخصاً)، حيث بلغ متوسط القيم 5.1 لدى مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ و2.6 لدى الشواهد، بفارقٍ إحصائيٍ معتدٍ به (P<0.0001)، وبلغت الحساسية 37% والنوعية 92%. ولقد فسرت دراسة Kim وزملائه (10) عام 2000 ارتفاع هذه الأضداد كنتيجة لإفرازها من قبل الخلايا البائية المنتجة للأضداد والموجودة في السائل الزليلي للغضروف المفصلي، حيث تمتلك هذه الأضداد القدرة على الارتباط بسطح الغضروف المفصلي وتحويل مكون المتممة (C5) الى الشكل الفعال (?C5) محفزةً الاستجابة الالتهابية الموضعية في المفاصل. أظهرت نتائج دراستنا توافقاً مع كل من دراسة العالم Jiang Xugan وزملائه (13) عام 2008 والتي أجريت على 124 مريضاً مصاباً بالتهاب المفاصل الروماتويديّ و54 شخصاً من الشواهد. ولقد بلغت الحساسية التشخيصية في دراستهم 19.35% والنوعية 98.1%، ومع دراسة العالم Yasuyuki Ohnish وزملائه (14) عام 2003، حيث بلغت الحساسية التشخيصية 30% والنوعية 98%، بينما كانت الحساسية والنوعية التشخيصية لأضداد النمط الثاني من الكولاجين في دراسة العالم Shengyun L وزملائه (15) عام 2000 22.3%، 98%، على الترتيب. اختلفت نتائج دراستنا عن دراسة العالم Mullazehi وزملائه (16) عام 2007 التي لم تجد فارقاً يعتد به إحصائياً في مستويات أضداد النمط الثاني من الكولاجين بين مجموعة مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ (عددهم 279 مريضاً) ومجموعة الشواهد (عددها 100 شخص) وقد يعزى السبب في ذلك إلى الاختلاف في مجموعة الدراسة والمجموعة الشاهدة. كما اختلفت دراستنا أيضاً عن دراسة العالم Cook وزملائه (17) عام 2004 ، التي أجريت على 96 مريضاً مصاباً بالتهاب المفاصل الروماتويديّ ومجموعة 98 شخصاً من الشواهد، التي لم تجد فارقاً يعتد به إحصائياً في مستويات أضداد النمط الثاني من الكولاجين بين هاتين المجموعتين. وقد يعود السبب إلى الاختلاف في المراحل المرضية لالتهاب المفاصل الروماتويديّ. فلقد شملت دراسة العالم Cook وزملائه عدداً كبيراً من الأشخاص قديمي التشخيص، حيث كان متوسط أعوام المرض 13 عاماً، بينما بلغ متوسط أعوام المرض خمس سنوات ونصف في دراستنا. ارتفعت مستويات أضداد النمط الثاني من الكولاجين في المراحل الباكرة من المرض، مقارنة مع المراحل المتأخرة وبفارق إحصائي معتد به. ولقد جاءت نتائج دراستنا متوافقة مع دراسة العالم Kim وزملائه (10) عام 2000، التي وجدت فارقاً يعتد به إحصائياً بين المرحلة الباكرة والمتأخرة من التهاب المفاصل الروماتويديّ، حيث عزا العالم هذا الانخفاض في مستويات أضداد الكولاجين إلى حدوث التشوهات وتخرب وفقدان الغضروف المفصلي خلال مدة طويلة نتيجة للعملية الالتهابية، مما يؤدي إلى ضياع المستضدات الذاتية، خاصةً النمط الثاني من الكولاجين، فينجم عنه انخفاض إنتاج أضداد النمط الثاني من الكولاجين.   الاستنتاج Conclusion  ترتفع المستويات المصلية لأضداد النمط الثاني للكولاجين لدى مرضى التهاب المفاصل الروماتويديّ بصورة يعتد بها إحصائياً مقارنة مع الشواهد. وتبلغ ذروة الارتفاع في المراحل الباكرة من الإصابة، لذلك يمكن أن تستخدم هذه الأضداد في تشخيص التهاب المفاصل الروماتويديّ في مراحله الباكرة.  المراجع References  1-Bax M; Heemst J; Huizinga T. and Toes R. Genetics of rheumatoid arthritis: what have we learned? Immunogenetics, 63: 459-466, 2011. 2-Liao K. and Karlson E. Classification and epidemiology of rheumatoid arthritis. in “Rheumatology 5ed” ED: Hochberg M; Silman A; Smolen J; Weinblatt M. and Weisman M. Mosby Elsevier, 796-780, 2010. 3-Ishihara Y. Autoantibodies. Rinsho Byori; 53(6): 562-569, 2005. 4-Conrad K; Roggenbuck D; Reinhold D. and D?rner T. Profiling of Rheumatoid Arthritis Associated Autoantibodies; Autoimmunity Reviews, 9(6): 431-435, 2010. 5-Steiner G. and Smolen J. Autoantibodies in rheumatoid arthritis and their clinical significance. Arthritis Res; 4(2): 1-5, 2002. 6-Van Boekel MAM; Vossenaar E; van den Hoogen FHJ. and van Venrooij WJ. Autoantibody systems in rheumatoid arthritis: specificity, sensitivity and diagnostic value. Arthritis Res; 4: 87-93, 2002. 7-Mark K. Structure, Biosynthesis and Gene Regulation of Collagens in Cartilage and Bone; in “Dynamics of Bone and Cartilage Metabolism. 2nd ed. Seibel M; Robins S. and Bilezikian J. Elsevier Inc, 7-33, 2006. 8-Mullazehi M. Anti-Collagen Type II Autoantibodies in an Acute Phenotype of Early Rheumatoid Arthritis. Uppsala Universitet. 36-37, 2009. 9-Cho Y; Cho M; Min S. and Kim H. Type II collagen autoimmunity in a mouse model of human rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev; 7 (1): 65-70, 2007. 10-Kim W; Yoo W; Park W; Kang YM; Kim SI. and Park JH. IgG antibodies to type II collagen reflect inflammatory activity in patients with rheumatoid arthritis. J Rheumatol, 27: 575-581, 2000. 11-Kim Wu; Cho Ml; Jung Yo; Min Sy; Park Sw. and Min DJ. Type II collagen autoimmunity in rheumatoid arthritis. Am J Med Sci; 327(4): 202-211, 2004. 12-Hulmes D. Collagen Diversity, Synthesis and Assembly in “Collagen Structure and Mechanics” Ed: Fratzl P; Springer Science Business Media, LLC 2008. 15-40 13-Xugan J; Shengxia C; Qin W; Junming T; Jianfen M; Qing C; Liang W; Xioayun Y; Di L; Jiaping Y. and Huaxi X. Establishment of Enzyme-linked Immunosorbent assay for Anti-collagen Type II Antibodies and its Clinical Significance in Rheumatoid Arthritis. Chinese Journal of Clinical Laboratory Science. 26(3): 178-183, 2008. 14-Ohnishi Y; Tsutsumi A. and Sumida T. Antibodies to type II collagen and their association with HLA DR1 alleles in Japanese patients with rheumatoid arthritis. Mod Rheumatol, 13(1): 69-72, 2003. 15-Shengyun L; Qingyu Z. and Subiao C. Anti type II collagen antibodies in Rheumatoid Arthritis. Chinese Journal of Rheumatology. 3(7), 2000. 16-Mullazehi M; Mathsson L; Lampa J. and Ronnelid J. High anti-collagen type-II antibody levels and induction of pro-inflammatory cytokines by anti-collagen antibody containing immune complexes in vitro characterise a distinct rheumatoid arthritis phenotype associated with acute inflammation at the time of disease onset. Ann Rheum Dis; 66: 537-541, 2007. 17-Cook A; Gray R; Ramshaw J; Mackay I. and Rowley M. Antibodies against the CB10 fragment of type II collagen in rheumatoid arthritis. Arthritis Research, 6: 477-483, 2004.         المجلد 7 , العدد 2 , ربيع الأول 1435 - كانون الثاني (يناير) 2014 SCLA