| الملخص Abstract |
يتصف ابيضاض الدم النقوي الحادAcute Myeloid Leukemia (AML) بزيادة الخلايا النقوية ضمن النقي مع توقف نضجها. وتلعب العديد من الطفرات دوراً في هذا المرض. وطفرات جين (FLT3) Fms-Like Tyrosine Kinase 3 هي واحدة من هذه الطفرات.
تلعب جين FLT3 وهي إحدى أفراد عائلة مستقبلات التيروزين كينازclass III دوراً هاماً في بقيا ونضج وتمايز الخلايا الجذعية المُكَوِّنَةُ للدَّم. تؤدي الطفرات في Fms-Like Tyrosine Kinase 3 إلى تكاثر غير مضبوط للخلايا الابيضاضية مع إنذار سيء. المرضى المصابون بابيضاض دم نقوي حاد مع طفرات تضاعف ترادف داخلي FLT3 internal tandem duplication (ITD) لديهم معدلات شفاء سريرية قليلة، بينما لا تزال الأهمية الإنذارية للميدان /(TKD) Tyrosine Kinase domain D835 غير واضحة. وصفت طفرات جين FLT3 لأول مرة في عام 1997 واعتبرت أكثر الطفرات الجزيئية تواتراً في ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML). وفي سورية لا توجد حتى الاَن معلومات كافية عن طفرات FLT3 لدى المرضى السوريين المصابين بالـ AML.
لذلك هدفت دراستنا إلى تعيين تواتر طفرة FLT3 (D835) ودراسة العلاقة بين هذه الطفرة ونُميطات AML، تبعاً لتصنيف (FAB) French American British Classification، لدى 70 مريضاً ناكساً يعاني من ابيضاض الدم النقوي الحاد (36 ذكراً و34 أنثى)، باستخدام PCR متبوعاً بالهضم بإنزيم EcoRv.
كان تواتر طفرة FLT3 (D835) 4.3% في دراستنا. كما كشفت هذه الدراسة عدم وجود علاقة يعتد بها بين طفرة FLT3 (D835) والعمر، والجنس. وعدم وجود علاقة بين هذه الطفرة وأي نُميط من نُميطات AML.
|
Acute myeloid leukemia (AML) is characterized by an increase in the number of myeloid cells in the marrow and an arrest in their maturation. Many mutations play a role in this disease, Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) gene mutations is one of these mutations.
FLT3 gene, a member of the class III receptor tyrosine kinase family, plays an important role in hematopoietic stem cell survival, development and differentiation. Mutations in Fms-like tyrosine kinase 3 genes lead to uncontrolled proliferation of leukemic cells with a poor prognosis. AML patients with FLT3 internal tandem duplication (ITD) mutations have poor cure rate, the prognostic significance of tyrosine kinase domain (TKD)\ D835 is still unclear. Mutations of FLT3 were first described in 1997 and account for the most frequent molecular mutations in acute myeloid leukemia (AML).There is no sufficient data currently exist about FLT3 mutations in Syrian AML patients. So, our study aimed to determine the frequency of FLT3 (D835) mutation and study the correlation between this mutation and AML subtypes, according to (FAB) French American British classification, in 70 relapsed AML patients (36 males and 34 females), by using PCR followed by digestion with EcoRV enzyme.
Frequency of FLT3 (D835) mutation in our study was 4.3%. This study revealed no significant correlation between FLT3 mutation and age and sex. And no correlation between this mutation and any AML subtypes.
|
| المقدمة Introduction |
يعد ابيضاض الدم النقوي الحاد خباثة دموية تتصف بغزو الخلايا الأرومية Blast cells لنقي العظم وخصوصاً الأرومات النقوية. يصنّف ابيضاض الدم النقوي الحاد إلى ثمانية مجموعات تبعاً لـ (FABC)French American British Classification. وتختلف هذه المجموعات عن بعضها بنسبة الأرومات في النقي والدم المحيطي بالإضافة إلى درجة تمايز هذه الأرومات. منذ القدم يعد النمط النووي من أهم عوامل الإنذار لدى مرضى ابيضاض الدم النقوي الحاد (1).
وبعد اكتشاف الطفرات في الجينات المسؤولة عن بقيا وتكاثر وتمايز الخلايا الدموية جرى إضافتها كمؤشرات لإنذار المرض. يعد وجود بعض هذه الطفرات عامل إنذار جيد لدى مرضى ابيضاض الدم النقوي الحاد مثل الطفرة في جين الـ NPM1 ((Nucleophosmin1 ويعد بعضها عامل إنذار سيء مثل طفرات جين FLT3
(Fms-Like (Tyrosine Kinase-3 (2).
ينتمي مستقبل FLT3 (Fms-like tyrosine kinase-3) والمسمّى أيضاً بـ FLK2 (fetal liver kinase-2) وSTK1 (human stem cell kinase-1) إلى عائلة (RTK) Class-III receptor tyrosine kinase (3). يجري التعبير عن هذا المستقبل بشكل طبيعي في الخلايا المكوّنة للدم الموجودة سواء في نقي العظم، أو الغدة الصّعترية أو الغدد اللمفاوية. كما يُعبّر عنه ضمن نسج أخرى مثل المشيمة، الدماغ، المخيخ والغدد التناسلية (4).
يلعب مستقبل FLT3 دوراً هاماً في بقيا، وانقسام وتمايز الخلايا الجذعية المكونة للدم (5). وتقع الجين المرمّزة لهذا المستقبل لدى الإنسان على الصبغي 13 الذراع q بالموقع 12. تتألف جين FLT3 من 24 إكسوناً مرمزاً لبروتين سكّري مرتبط بغشاء الخلية الجذعية المكونة للدم ويتكون من 993 حمضاً أمينياً بوزن جزيئي 130-143 كيلودالتون (6) (الشكل 1).
يجري التعبير عن جين FLT3 بشكل يفوق السوي (70-100%) في كلّ من ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML)وابيضاض الدم اللمفاري الحاد (ALL) (8، 9)، ففي كلا المرضين يحدث نوعان
من الطفرات: طفرة D835 وهي طفرة نقطية تحدث في الموقع الجيني المرمّز للتيروزين كيناز Tyrosine Kinase Domain (TKD )، وطفرة ITD(Internal Tandem Duplication) وهي تكرار لتسلسلات معينة من الجين في الموقع الجيني المرمّز لجزء البروتين القريب من الغشاء (Juxtamembrane Region). تؤدي كل من الطفرتين السابقتين إلى تفعيل مستقبل التيروزين كيناز بشكل مستقل عن وجود الربيطة (10، 11).
تعد طفرة ITD من أكثر الشذوذات حدوثاً لدى مرضى ابيضاض الدم النقوي الحاد، حيث تظهر لدى 20-25% من المرضى، كما تظهر طفرة D835 لدى 6-10% من المرضى (5، 12). لقد أكدت العديد من الدراسات بأن طفرة ITD ترتبط مع نسب شفاء قليلة بسبب حدوث النّكس، كما أكدت العديد من الدراسات بأن طفرة D835 تملك أهمية قليلة أو لا تملك أهمية كعامل إنذار سيء لدى مريض ابيضاض الدم النقوي الحاد.
وبسبب انتشار طفرات FLT3 لدى مرضى ابيضاض الدم النقوي الحاد الكبار بالسن والأطفال وبسبب أهمية هذه الطفرات، فقد هدفت دراستنا إلى تحديد انتشار طفرة D835 لدى مرضى سوريين بالغين ودراسة علاقة هذه الطفرة بالجنس والعمر، بالإضافة إلى تحديد علاقة طفرة D835 مع نُميطات AML.
|
 |
| المواد والطرق Materials and Methods |
المرضى Patients
شملت الدّراسة 70 مريضاً يعاني من ابيضاض دم نقوي حاد (34 من الإناث و36 من الذكور)، تراوحت أعمارهم بين 16 و78 عاماً. جرى الاعتيان من المرضى عند مراجعتهم مستشفى المواساة وتشخيص أول نكس لديهم.
معايير الاستبعاد Exclusion criteria
استبعدت عينات المرضى الذين جرى تشخيص إصابتهم بابيضاض دم نقوي حاد حديثاً أو إصابتهم بابيضاض دم نقوي حاد ثانوي.
|
| الطرق Methods |
اسخلاص الدنا DNA isolation
بُزل 3 مل من الدم الكامل، من كل مشارك في الدراسة، ضمن أنابيب EDTA، ووزعت كل عينة ضمن 3 أنابيب إيبندورف وحُفظت بدرجة حرارة C°20-. جرى استخلاص الدنا من أحد العينات المحفوظة بعد حل العينة بوضعها في الحمام المائي بدرجة حرارة C°37 لمدة خمس دقائق، وذلك باستخدام عتيدة عزل الدنا من الدم الكاملGene JET Genomic DNA Purification Kit من شركة Fermentas (Lithuania).
التنميط الوراثي Genotyping
جرى تضخيم المنطقة مقيدة الطول من جين FLT3 والمرمزة لجزء البروتين كيناز من مستقبل FLT3 بتفاعل البوليميراز التسلسلي باستخدام المشرعين التاليين:
For 5‛-CCG CCA GGA ACG TGC TTG-3
Rev 5‛-GCA GCC TCA CAT TGC CCC-3‛
من شركة VBC-biotech (Vienna, Austria)، بناء على دراسة Zaker F. et al, 2010، بعد مطابقة المَشْرع مع تسلسل الجين.
استُخدم إنزيم Hot Start DNA Polymerase من شركة Solis BioDyne (Estonia)، بدلاً من إنزيم Taq DNA polymerase وهو إنزيم بوليميراز معدل كيميائياً غير فعال بدرجة حرارة الغرفة، أي لا يملك قدرة على البلمرة ويحتاج إلى 15 دقيقة حضن بدرجة حرارة 95 C°ليصبح فعالاً، مما يحمي ارتباطات المشارع غير النوعية مع الدنا، كما يحمي من ارتباط المشارع مع بعضها وتشكيل primers-dimer والتي قد تحدث بدرجات الحرارة المنخفضة خلال مراحل الـ PCR. واستخدمت محاليل دارئة التفاعل وMgCl2 و DNTPsمن الشركة نفسها.
جرى تطبيق البرنامج الحراري التالي: 95°C لمدة 12 دقيقة، 35 دورة من النظام التالي: تمسخ الدنا بدرجة حرارة 95 C°لمدة دقيقة، ثم الالتحام مع المشرع بدرجة حرارة 56 C°لمدة دقيقة، ثم إطالة بدرجة حرارة 72 C°لمدة دقيقة. والإطالة النهائية بدرجة حرارة 72 C°لمدة 10 دقائق، وذلك بناء على دراسةFrӧhling S. et al, 2010 .
جرى تظهير ناتج تفاعل PCR بالرحلان الكهربائي على هلامة الأغاروز 3.5% وذلك للتأكد من نجاح تفاعل التضخيم. ثم هُضمت العينات باستخدام إنزيم EcoRv بدرجة حرارة 37 C°لمدة ساعتين. ومن ثم جرى إظهار نواتج الهضم بالرحلان الكهربائي على هلامة الأغاروز 3.5%.
التحليل الإحصائي Statistical Analysis
جرى حساب النتائج باستخدام اختبار كاي مربع لدراسة العلاقة بين طفرةD835 والجنس، والعمر و نُميطات AML تبعاً لتصنيف FAB واعتمدت قيمة P<0.05 كقيمة يعتد بها إحصائياً.
|
| النتائج Results |
- ناتج تفاعل تضخيم جين FLT3(D835) بعد الهضم بإنزيم EcoRv: يظهر الشكل 1 العصابات الناجمة عن هذا التضخيم على هلامة الأغاروز.
- تنتشر طفرة D835 بنسبة 4.3% لدى مرضى ابيضاض الدم النقوي الحاد السوريين (الجدول 1).
- يبين الجدول 2 غياب علاقة وجود طفرة D835 بالجنس. ويبين الشكل 2 غياب هذه العلاقة مع العمر. – ويبين الشكل 3 عدم وجود علاقة لهذه الطفرة وأي نُميط من نُميطات AML تبعاً لتصنيف FAB.
|
|
| المناقشة Discussion |
تعد طفرات FLT3 من أكثر العيوب الجينية انتشاراً لدى مرضى ابيضاض الدم النقوي الحاد، حيث تحدث لدى 25-35 % من المرضى. وتعد طفرة FLT3 (ITD) واحدة من أكثر التبدلات الجينية المذكورة لدى مرضى AML، حيث تبدي تكراراً يتراوح بين 20-27% عند الكبار و10-16% لدى المرضى صغار العمر، بينما تبدي طفرة FLT3 (D835) انتشاراً أقل (13).
أظهرت هذه الدراسة أنّ انتشار طفرة FLT3 (D835) لدى مرضى ابيضاض الدم النقوي الحاد السوريين هو 4.3% وهذا يتوافق مع نتائج دراسة جرت في ألمانيا وشملت 3082 مريضاً وجرى تشخيص طفرة FLT3 (D835) لدى 147 مريضاً منهم (4.8%) (14)، كما توافقت مع نتائج دراسة شملت 97 مريضاً سعودياً جرى تشخيص هذه الطفرة لدى 4(4.1%) منهم (13)، لكن تخالفت نتائج هذه الدراسة مع العديد من الدراسات السابقة منها دراسة انتشار الطفرة لدى مرضى بريطانيين (7.2%) (15). ويمكن أن يفسر هذا الاختلاف بأن الفترة التي جرى فيها الاعتيان تختلف بين هذه الدراسة وبين الدراسات الأخرى (في هذه الدراسة جرى الاعتيان عند أول نكس، بينما جرى الاعتيان في الدراسات السابقة عند التشخيص لأول مرة)، بالإضافة إلى اختلاف نوع العينات المدروسة (في هذه الدراسة جرى بزل عينة دم كامل من كل مريض بينما جرى بزل عينة نقي العظم في الدراسات الأخرى).
في هذه الدراسة شكل الذكور 2.9% وشكلت الإناث 1.4% من مرضى AML الذين شخصت طفرة FLT3 (D835) لديهم، فلم تكن هنالك علاقة بين طفرة FLT3 (D835) والجنس (P=0.589). وتتوافق نتائج هذه الدراسة مع معظم الدراسات السابقة ومنها دراسة شملت مرضى عراقيين وجد بنتيجتها أن طفرة FLT3 (D835) تتكرر لدى الرجال أكثر من النساء، إلا أن الفارق غير معتد به إحصائياً (16).
كما جرى تشخيص طفرة D835 لدى 3 مرضى في هذه الدراسة، تراوحت أعمارهم بين 31-46 عاماً، ولكن لم يشكل ذلك قيمة يعتد بها إحصائياً (P=0.063 ) وهذا ما يتوافق مع معظم الدراسات السابقة، ومنها دراسة في المغرب أظهرت أنه على الرغم من كون أعمار مرضى ابيضاض الدم النقوي الحاد الحاملين للطفرة فوق 31 عاماً، إلا أنه لاتوجد علاقة بين طفرة D835 والعمر (17). وإن جود بعض الدراسات التي أشارت إلى أنه توجد علاقة بين طفرة D835 والعمر قد يعزى إلى الاختلاف في متوسط أعمار المرضى في العينات المدروسة عن متوسط أعمار المرضى في هذه الدراسة.
تتوافق نتائج هذه الدراسة مع معظم الدراسات السابقة (18، 19) بأنه لا توجد علاقة بين طفرة FLT3 (D835) و أي نُميط من نُميطات AML تبعاً لتصنيف FAB، على الرغم من أن تشخيص طفرة FLT3 (D835) في هذه الدراسة وجد لدى مرضى من نُميط M1,M2,M4 إلا أنه لم يبد إيجابية لدى أي مريض ابيضاض دم نقوي حاد من نُميط FAB (M0,M3,M5,M6,M7)، كما أن الفارق لا يعتد به إحصائياً، حيث كانت قيمة P تساوي 0.981.
|
| الاستنتاج Conclusion |
| كانت نسبة انتشار طفرة FLT3 (D835) لدى مرضى سوريين مصابين بابيضاض دم نقوي حاد 4.3%. ولا توجد علاقة تربط هذه الطفرة بالعمر أو الجنس أو أي نُميط من نُميطات AML تبعاً لتصنيف FAB. |
| المراجع References |
1-Vardiman JW; Thiele J; Arber DA; Brunning RD; Borowitz MJ; Porwit A; Harris NL; Le Beau MM; Hellström-Lindberg E; Tefferi A. and Bloomfield CD.
The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes.
Blood. 2009, 114(5): 937-951.
2- Haslam K; Chadwick N; Kelly J; Browne P; Vandenberghe E; Flynn C; Conneally E. and Langabeer SE.
Incidence and significance of FLT3-ITD and NPM1 mutations in patients with normal karyotype acute myeloid leukaemia.
Irish journal of medical science. 2010; 179 (4): 507-510.
3- Small D. et al.
STK-1; the human homolog of Flk-2/Flt-3; is selectively expressed in CD34+ human bone marrow cells and is involved in the proliferation of early progenitor/stem cells.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1994; 91(2): 459-463.
4- Rosnet O; Bühring HJ; Marchetto S; Rappold I; Lavagna C; Sainty D; Arnoulet C; Chabannon C; Kanz L; Hannum C. and Birnbaum D.
Human FLT3/FLK2 receptor tyrosine kinase is expressed at the surface of normal and malignant hematopoietic cells.
Leukemia. 1996; 10 (2): 238-248.
5- Gilliland DG. and Griffin JD.
The roles of FLT3 in hematopoiesis and leukemia.
Blood. 2002; 100 (5):1532-1542.
6- Markovic A; MacKenzie KL. and Lock RB.
FLT-3: a new focus in the understanding of acute leukemia.
International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 2005; 37(6): 1168-1172
7- Small D.
FLT3 mutations: biology and treatment.
Hematology/the Education Program of the American Society of Hematology. 2006: 178-184
8- Birg F; Rosnet O; Carbuccia N. and Birnbaum D.
The expression of FMS; KIT and FLT3 in hematopoietic malignancies.
Leuk Lymphoma. 1994;13 (3-4):223-227.
9- Piacibello W; Fubini L; Sanavio F; Brizzi MF; Severino A; Garetto L; Stacchini A; Pegoraro L. and Aglietta M.
Effects of human FLT3 ligand on myeloid leukemia cell growth: heterogeneity in response and synergy with other hematopoietic growth factors.
Blood. 1995; 86(11): 4105-4114.
10- Skorski T.
Oncogenic tyrosine kinases and the DNA-damage response.
Nat Rev Cancer. 2002; 2(5):351-360.
11- Zwaan CM; Kaspers GJ; Pieters R; Ramakers-Van Woerden NL; den Boer ML; Wünsche R; Rottier MM; Hählen K; van Wering ER; Janka-Schaub GE; Creutzig U. and Veerman AJ.
Cellular drug resistance profiles in childhood acute myeloid leukemia: differences between FAB types and comparison with acute lymphoblastic leukemia.
Blood. 2000; 96(8): 2879-2886.
12- Kiyoi H; Towatari M; Yokota S; Hamaguchi M; Ohno R; Saito H. and Naoe T.
Internal tandem duplication of the FLT3 gene is a novel modality of elongation mutation which causes constitutive activation of the product.
Leukemia. 1998; 12(9):1333-1337.
13- Elyamany G; Awad M; Fadalla K; Albalawi M; Al Shahrani M. and Al Abdulaaly A.
Frequency and Prognostic Relevance of FLT3 Mutations in Saudi Acute Myeloid Leukemia Patients.
Adv Hematol. 2014; 2014: p141360.
14- Bacher U; Haferlach C; Kern W; Haferlach T. and Schnittger S.
Prognostic relevance of FLT3-TKD mutations in AML: the combination matters--an analysis of 3082 patients.
Blood. 2008; 111(5): 2527- 2537.
15-Abu-Duhier FM; Goodeve AC; Wilson GA; Care RS; Peake IR; Reilly JT.
Identification of novel FLT-3 Asp835 mutations in adult acute myeloid leukaemia.
British Journal of Haematology. 2001;113 (4): 983-988.
16- Dhahir Ethar K; Al-Mudallel Subh S. and Dhahi Maysaa A. R.
The Frequency of FLT3 Mutation in Fifty Five Iraqi Adult Patients with Acute Myeloid Leukemia.
Iraqi Journal of Medical Sciences; 2012; 10(2); p140.
17- Hind Dehbi; Yaya Kassogue; Sanaa Nasserddine; Asma Quessar and Sellama Nadifi.
FLT3-ITD Incidence and FLT-D835 Mutations in Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotype in Morocco: A Preliminary Study
Middle East Journal of Cancer, 2013; 4(1): 1-5.
18- Yamamoto Y; Kiyoi H; Nakano Y; Suzuki R; Kodera Y; Miyawaki S; Asou N; Kuriyama K; Yagasaki F; Shimazaki C; Akiyama H; Saito K; Nishimura M; Motoji T; Shinagawa K; Takeshita A; Saito H; Ueda R; Ohno R. and Naoe T.
Activating mutation of D835 within the activation loop of FLT3 in human hematologic malignancies.
Blood. 2001; 97(8): 2434-2439.
19-Sheikhha MH; Awan A; Tobal K. and Liu Yin JA.
Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients.
Hematol J. 2003; 4(1): 41- 46.
|
| |
