بحث في أعداد المجلة الجملة   المؤلف

المجلد 7 , العددان 9-10 , ربيع الثاني 1437 - كانون الثاني (يناير) 2016   الكشف عن الفيروس التنفسي المخلوي لدى مجموعة من الأطفال المصابين بعداوى الطريق التنفسي السفلي الحادة في مدينة دمشق باستخدام تفاعل البوليميراز التسلسلي Detection of Respiratory Syncytial Virus in a group of Children with Acute Lower Respiratory Tract Infections, Using RT-PCR in Damascus د. مروان محمد البحتري Marwan M. AL Buhtori كلية الصيدلة، جامعة دمشق Faculty of Pharmacy, Damascus University الملخص Abstract يعد الفيروس التنفسي المخلوي (RSV) Respiratory Syncytial Virusمن أهم أسباب عدوى الطريق التنفسي السفلي الحادة وخاصة لدى الأطفال الصغار وحديثي الولادة. هدفت هذه الدراسة إلى تقييم نسبة وقوع الإصابة بفيروس RSV لدى الأطفال بعمر  5 أعوام والذين جرى قبولهم، لتشخيص عداوى الطريق التنفسي السفلي الحادة لديهم، في مستشفى الأطفال الجامعي بمدينة دمشق، سورية. شملت الدراسة 172 طفلاً بعمر  5 أعوام مشخصين بإصابتهم بالتهاب رئوي حاد أو الْتِهابُ القُصَيبات الحاد. جُمعت عينات الغسول الأنفي من الأطفال في الفترة الواقعة ما بين تشرين الأول 2014 وآذار 2015. تم بعد ذلك الكشف عن الحمض النووي للفيروس التنفسي المخلوي باستخدام تفاعل البوليميراز التسلسلي بإنزيم المُنْتَسِخَةُ العَكْسِيَّة(RT-PCT) . كُشف الفيروس التنفسي المخلوي (RSV) لدى 84 طفلاً (48.8%). وكانت أعمار الأطفال إيجابيي الفيروس أصغر بكثير من أعمار الأطفال سلبيي RSV (متوسط العمر7 أشهر و13 شهر، على الترتيب). يُعد فيروس التنفسي المخلوي عاملاً عدوائياً شائعاً لدى الأطفال في سورية، وهو سبب هام لعداوى الطريق التنفسي السفلي الحادة لدى الأطفال دون 5 أعوام من العمر، خاصة الرضع الصغار الذين تقل أعمارهم عن 6 أشهر.   Respiratory syncytial virus (RSV) is one of the most important causes of acute lower respiratory tract infections in infants and young children. This study aimed to evaluate the percentage of RSV incidence among children ≤ 5 years old, who are hospitalized with Acute Lower Respiratory Tract Infections in Children Universal hospital in Damascus city, Syria. The study included 172 children ≤ 5 years old diagnosed with acute pneumonic or acute bronchiolitis. Nasal washes specimens were collected from children between October 2014 and March 2015. The nucleic acid of RSV was detected using Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR). RSV was detected in 84 cases (48.8%). The RSV positive cases were significantly younger than other non-RSV cases (mean age 7 months and 13 months, respectively). RSV is a common infectious agent in children in Syria, and it is an important cause of acute lower respiratory tract infections in children below 5 years of age, especially in young infants below 6 months of age.   المقدمة Introduction  تُعد عداوى الطريق التنفسي السفلي الحادة من أحد أهم أسباب الوفاة والإقامة في المستشفى لدى الأطفال تحت سن الخامسة من العمر وخاصة في البلدان النامية (1). وُتعد الفيروسات، وبشكل خاص الفيروس التنفسي المخلوي (RSV) Respiratory syncytial virus، فيروس الإنفلونزا A، B، الفيروسات نظيرة الإنفلونزا والفيروسات الغدية Adenoviruses- من العوامل الإنتانية الشائعة المسببة لعدواى الطريق السفلي الحادة (2، 3). يلعب الفيروس التنفسي المخلوي(RSV) دوراً هاماً في عداوى الطريق التنفسي السفلي الحادة لدى الأطفال. الفيروس التنفسي المخلوي هو فيروس رنا RNA أحادي الطاق سلبي ومغلف وينتمي الى جنس (الفيروسات الرئوية) Pneumovirus (4). تحدث العداوى بالفيروس التنفسي المخلوي البشري بشكل شائع لدى الأطفال وتبلغ ذروة الإصابة بهذا الفيروس في الفترة ما بين الشهر الثاني إلى السادس من عمر الطفل. تتراوح شدة الإصابة بهذا الفيروس لدى الأطفال من عدوى حادة في الطريق التنفسي العلوي والتهاب قصبات حاد إلى ذات رئة والتهاب القُصَيْيبات وقد تصل إلى انقطاع في التنفس. يعاني 70% من الأطفال تحت عمر العامين من الإصابة بـ RSV خلال العام الأول من العمر وقد تصل النسبة إلى 100% لدى الأطفال الذين أتموا العامين (4، 5). تحدث عداوى الطريق التنفسي السفلي بـ RSV لدى الأطفال المقيمين في المستشفيات بتواتر أكبر من حدوث العداوى بالفيروسات التنفسية الأخرى، حيث تشير الدراسات إلى أن فيروس RSV يعد العامل العدوائي المسبب الوحيد للإصابة بالتهاب القصيبات لدى 60-90% من المرضى، بينما تعزى الإصابة بذات الرئة إلى هذا الفيروس لدى 25-50% من المرضى (6). على الرغم من أن تشخيص الإصابة بـ RSV يعتمد على الموجودات السريرية والوبائية (وجود جائحة،فصل الشتاء)، إلا أن تأكيد الإصابة بالفيروس يجري مخبرياً وذلك إما بعزل الفيروس من العينات السريرية في المزارع الخلوية أو مصلياً بالكشف عن أضداد الفيروس أو بالكشف عن مستضدات الفيروس في العينات المرضية التنفسية (7). يعـد تفاعـل البوليميراز التسلسلي بإنزيم المنتسخة العكسية RT-PCR للكشف عن الحمض النووي الفيروسي من أكثر الاختبارات حساسية وسرعة (8). على الرغم من وجود العديد من الدراسات التي حددت نسبة انتشار فيروس RSV لدى الأطفال المصابين بعداوى الطريق التنفسي السفلي الحادة في البلدان المتقدمة، إلا أن المعلومات عن نسبة وقوع هذا الفيروس في عدواى الطريق التنفسي السفلي الحادة (ذات رئة، التهاب قصيبات) في البلدان النامية محدودة. وإلى الآن لاتوجد أية دراسة عن نسبة وقوع فيروس RSV لدى الأطفال المصابين بعداوى الطريق التنفسي السفلي الحادة في دمشق. لذلك فلقد هدفت دراستنا إلى تحديد نسبة وقوع الإصابة بفيروس RSV لدى مجموعة من الأطفال، في دمشق، تحت عمر خمس أعوام والذين جرى تشخيصهم بعداوى الطريق التنفسي السفلي الحادة. وذلك باستخدام الطرق الجزيئية ومقارنة النتائج مع الدراسات المشابهة.   المواد والطرقMaterials and Methods   تصميم الدراسة: دراسة مقطعية استباقية. مجموعة الدراسة: شملت الدراسة 172 طفلاً تحت سن الخامسة من العمر والذين جرى قبولهم في مستشفى الأطفال في مدينة دمشق، بسبب إصابتهم بعداوى الطريق التنفسي السفلي الحادة وذلك خلال الفترة مابين تشرين الأول 2014 وآذار 2015. وجرى استبعاد الأطفال بعمر أقل من شهر واحد، كما اقتصرت الحالات المرضية على التهاب القصيبات وذات الرئة الحادة. الاعتيان: جرى الاعتيان في الفترة الواقعة بين تشرين الأول 2014- آذار 2015، حيث جُمعت عينات الغسول الأنفي nasal washes حسب الطريقة المعيارية (9) وحُفظت في الدرجة +4 ْC، ثم وزعت العينة ضمن 3 أنابيب إيبندورف وحُفظت في الدرجة -70 ْC إلى حين إجراء المقايسة. الطرق: أُجري العمل في مختبر البحث العلمي في كلية الصيدلة، جامعة دمشق. حيث استخلص الحمض النووي الفيروسي من العينات المحفوظة (200µl من العينة) باستخدام عتيدةGF-1 viral nucleic acid extraction وذلك بناءً على تعليمات الشركة المصنعة. وجرى بعد ذلك تحويل RNA إلى cDNA باستخدام إنزيم المنتسخة العكسيةreverse transcriptase ، ثم أُجري تفاعل البوليميراز التسلسلي (PCR) باستخدام جهاز Thermal Cycler Biocycler TC-S وعتيدة PCR Taq 2x mastermix من شركة Biolabs وهي عبارة عن محلول جاهز للاستخدام يتألف من مزيج يحتوي مكونات تفاعل البوليميراز التسلسلي جميعها، باستثناء المشارع ومرصاف الدنا DNA. واستخدمت المشارع الموضحة في الجدول 1 من شـركة VBC Biotech حسب دراسة (10) Nikfar et al.لإجراء تفاعل البوليميراز التسلسلي. وجرى تضخيم cDNA باستخدام البرنامج الحراري التالي: التمسخ الأولي للدنا DNA بدرجة حرارة 95 ْC لمدة 5 دقائق (دورة واحدة)، ثم 40 دورة من البرنامج التالي: تمسخ الدنا بالدرجة 95 ْC لمدة دقيقة واحدة، الالتحام مع المشرع بالدرجة 55 ْC لمدة دقيقة واحدة، الاستطالة بالدرجة 72 ْC لمدة دقيقة واحدة، وأخيراً دورة واحدة من الاستطالة النهائية بالدرجة 72 ْC لمدة 5 دقائق. جرى بعد ذلك ترحيل الناتج على هلامة الأغاروز 2% ضمن جهاز الرحلان الكهربائي الأفقي ومن ثم جرى إظهار العصابات باستخدام UV بعد تلوينها ببروميد الايثيديوم.     النتائجResults   بلغ عدد الأطفال الذين حققوا شروط الدراسة 172 طفلاً (108 ذكراً و64 أنثى) تراوحت أعمارهم بين شهرإلى 5 سنوات، حيث بلغ متوسط أعمار الأطفال: 10 أشهر، ثلثا الأطفال (%64) كان بعمر أقل من سنتين. وبلغ عدد الأطفال المصابين بذات رئة 34 طفلاً، بينما عانى 138 طفلاً من التهاب قصيبات حاد. كُشّف الحمض النووي للفيروس التنفسي المخلوي (RSV) لدى 84 طفلاً (48.8%) من مجموع الأطفال الذين قلت أعمارهم عن خمسة أعوام. ولقد بلغ متوسط أعمار الأطفال إيجابيي RSV سبعة أشهر والذي كان أصغر بكثير من متوسط أعمار الأطفال الذين لم يُكشّف عن الفيروس لديهم (13 شهراً). ويظهر الجدول 2 والشكل 1 توزع العينات الإيجابية بناء على الفئة العمرية. وكُشف عن الحمض النووي لفيروس RSV لدى 46 من الذكور ولم يكن هناك فارق إحصائي بين الجنسين (P >0.05). عانى 85% من الأطفال إيجابيي RSV من التهاب قصيبات، بينما كانت ذات الرئة التشخيص الرئيسي لدى 15% من الأطفال إيجابييRSV. عند دراسة النتائج اعتماداً على التوزع الفصلي للإصابة بالفيروس تبين أن غالبية العداوى (91%) حدثت في الفترة الواقعة ما بين شهر كانون الأول وشباط.   المناقشةDiscussion   تعد الفيروسات التنفسية من أهم أسباب الإصابة بعداوى الطريق التنفسي السفلي الحادة شيوعاً وخاصة لدى الأطفال تحت عمر 5 أعوام (11، 12). مع أن جوائح فيروسRSV تحدث سنوياً وتكون الذروة في فصل الشتاء إلا أن هذا يختلف باختلاف مكان الدراسة والفصول (13). كُشف الحمض النووي لفيروسRSV لدى 84 طفلاً (%48.8) من الأطفال الذين شملتهم الدراسة الحالية. ولقد توافقت هذه النتائج مع نتائج الدراسات التي أجريت في دول مجاورة: السعودية%45.4، لبنان %26.7، تركيا %29.5، الإمارات %28، الكويت %36.8، عمان %43 (14-19، على الترتيب). وكانت نتائج الدراسة التي أجريت في الأرجنتين %23.3 وتلك التي أجريت في إيران %45.8 (20-21، على الترتيب)، بينما كانت نسبة وقوع العداوى بفيروس RSV لدى الأطفال في الدراسة الحالية أكبر بكثير من النسب في دراسات أخرى: %5.7، %1.7 (22-23). ويمكن أن يعزى هذا الاختلاف في نسبة إنتشار RSV في العالم إلى عدة عوامل أهمها: الاختلاف في المناخ، وجودعوامل بيئية وشدة الجائحة من عام إلى آخر(8). ويبين الجدول 3 أهم الدراسات التي أجريت للكشف عن الإصابة بفيروس RSV لدى الأطفال المصابين بعداوى الطريق التنفسي الحادة. بلغ متوسط أعمار الاطفال المصابين بفيروس RSV في الدراسة الحالية سبعة أشهر والذي كان متوافقاً مع الدراسات المماثلة التي أجريت في كل من عمان، البرازيل ومصر: 7 اشهر، 4 أشهر، 8.2 شهر،على الترتيب (19، 24، 25). وبالمقابل فلقد كان متوسط أعمار الأطفال إيجابيي الـ RSV في دراسة مشابهة 54 شهراً. ويمكن تفسير ذلك بأن مجموعة الدراسة شملت الأطفال ذوي أعمار أكبر وصلت إلى 14 عاماً (26). يعد المناخ من العوامل المهمة في تطورالعداوى التنفسية بفيروس RSV، حيث يزداد تواتر الإصابة بهذا الفيروس في المناخ البارد وذلك مع انخفاض درجات الحرارة في فصل الشتاء، بينما تحدث عداوى الفيروس على مدار السنة في الدول ذات المناخ الاستوائي. وفي الدراسة الحالية حدثت غالبية حالات عداوى فيروس(%91) RSV في الفترة ما بين شهري كانون الأول وشباط والتي تعد الأشهر الأكثر برودة في سورية. ولقد توافقت هذه النتائج مع نتائج دراسة أجريت في مصر (25). أثبتت الدراسة الحالية أن الأطفال إيجابيي فيروس RSV هم أكثر عرضة لتطور التهاب القصيبات الحاد، حيث بلغت نسبة الإصابة بفيروس RSV المترافقة مع التهاب قصيبات حاد 85%. وهذا ما أكدته دراسات مشابهة، حيث كانت نسبة عدواى فيروس RSV المترافق مع التهاب قصيبات حاد هي%76.5، %54، %57 (19، 24، 25، على الترتيب).     الاستنتاجConclusion   حددت الدراسة الحالية لأول مرة نسبة وقوع العداوى بفيروس RSV لدى مجموعة من الأطفال السوريين وذلك باستخدام الطرق الجزيئية، وأثبتت أن الإصابة بهذا الفيروس شائعة لدى الأطفال المصابين بعداوى الطريق التنفسي السفلي الحادة وخاصة بأعمار تقل عن العامين. أوضحت الدراسة أهمية التقصي عن فيروس RSV لدى الأطفال الصغار المصابين بعداوى الطريق التنفسي السفلي الحادة وخاصة التهاب القصيبات وذلك من أجل اتخاذ التدابير اللازمة للوقاية من العدوى والحد من الاستخدام غير المناسب للمضادات الحيوية. ننصح بإجراء دراسات مستقبلية على مجموعة أكبر من المرضى ولفترة أطول، من أجل تعيين أدق لنسبة الانتشار وتحديد عوامل الاختطار للإصابة بفيروس RSV.   المراجع References  1-Pavlova S; Hadzhiolova T; Abadjieva P. and Kotseva R. Application of RT-PCR for diagnosis of respiratory syncytial virus and human metapneumovirus infections in Bulgaria, 2006-7 and 2007-8. Euro Surveill.2009; 14 (23):19233. 2- Monto AS. Occurrence of respiratory virus: time, place and person. Pediatr Infect Dis J. 2004; 23:S58-64. 3- Fabbiani M; Terrosi C; Martorelli B;Valentini M; Bernini L; Cellesi C. et al. Epidemiological and clinical study of viral respiratory tract infections in children from Italy. J Med Virol. 2009; 81(4):750-756. 4- Cane PA. Molecular epidemiology of respiratory syncytial virus. Rev Med Virol.2001;11(2):103-116. 5- Meert K; Heidemann S; Abella B. and Sarnaik A. Does prematurity alter the course of respiratory syncytial virus infection? Crit CareMed. 1990;18(12):1357-1359. 6- Boeck KD. Respiratory syncytial virus bronchiolitis: clinical aspectsand epidemiology. Monaldi Arch Chest Dis. 1996;51(3):210-213. 7- Hall CB. and McCarthy CA. Respiratory syncytial virus. In:Mandle GL, Bennett, Dolin R. Principle and practice of infectious diseases. 6th ed. USA: Elsevier Churchill Livingston: 2005:2008-2026 8- Falsey AR; Formica MA; Walsh EE. Diagnosis of respiratory syncytialvirus infection: comparison of reverse transcription-PCR to viral culture and serology in adults with respiratory illness. J ClinMicrobiol.2002;40(3):817-820 9- Hall CB. and Douglas RG. Clinically Useful Method for the Isolation of Respiratory Syncytial Virus. The Journal Of Infectious Diseases. 1975, 131(1):1-5. 10- Roya Nikfar, Ahmad Shamsizadeh, Manoochehr Makvandi and Arash khoshghalb. Detection of Respiratory Syncytial Virus in Hospitalized Children with Acute Lower Respiratory Tract Infections, Using RT PCR in Ahvaz, Iran. Arch Pediatr Infect Dis. 2013;1(3):118-121. 11- Pecchini R. et al. Incidence and clinical characteristics of the infection by the respiratory syncytial virus in children admitted in Santa Casa de Sao Paulo Hospital. Braz J Infect Dis. 2008;12(6):476-479. 12- Cabello C; Manjarrez ME; Olvera R; Villalba J; Valle L. and Paramo I. Frequencyof viruses associated with acute respiratory infections in children younger than five years of age at a locality of MexicoCity. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2006;101:21-24. 13- Terletskaia-Ladwig E; Enders G; Schalasta G. and Enders M. Defining the timing of respiratory syncytial virus (RSV) outbreaks: an epidemiological study. BMC Infect Dis. 2005;5:20 14- Meqdam MM. and Subaih SH. Rapid detection and clinical features of infants and young children with acute lower respiratory tract infection due to respiratory syncytial virus. FEMS Immunol Med Microbiol. 2006. 47(1):129-133. 15- Hamze M; Hais S; Rachkidi J; Lichaa Z. and Zahab N. Infections with respiratory syncytial virus in North Lebanon-prevalence during winter 2008. East Mediter Health J; 2010. 16(5):539-545. 16- Kanra G; Tezcan S. and Yilmaz G. Turkish National Respiratory Syncytial Virus (RSV)Team.Respiratory syncytial virus epidemiology in Turkey. Turk J Pediatr. 2005: 47(4):303-308. 17- Uduman SA; Ijaz MK; Kochiyil J; Mathew T. and Hossam MK. Respiratory syncytial virus infection among hospitalized young children with acute lower respiratory illnesses in Al Ain, UAE. J Commun Dis.1996: 28(4):246-252. 18- Khadadah M; Essa S; Higazi Z; Behbehani N. and Al-Nakib W. Respiratory syncytial virus and human rhinoviruses are the major causes of severe lower respiratory tractinfections in Kuwait. J Med Virol. 2010, 82(8):1462-1467. 19- Khamis FA; Al-Kobaisi MF; Al-Areimi WS; Al-Kindi H. and Al-Zakwani I. Epidemiology of respiratory virus infections among infants and young children admitted to hospital in Oman. J Med Virol.2012, 84:1323-1329. 20- Carballal G; Videla CM; Espinosa MA; Savy V; Uez O.et al. Multicentered study of viral acute lower respiratory infections in children from four cities of Argentina, 1993-1994. J Med Virol.2001;64:167-174. 21- Chavoshzadeh Z; Abdinia B; Fahimzad A; Samakosh H; Khanbabaei G. and Tabatabaei A. Molecular Study of Respiratory Syncytial Virus, Human Rhinovirus and Human Metapneumovirus, Detected in Children With Acute Wheezing. Arch Pediatr Infect Dis.2013;1(1):14-17. 22- Tsai HP; Kuo PH; Liu CC. and Wang JR. Respiratory viral infections among pediatric inpatients and outpatients in Taiwan from 1997 to 1999. J Clin Microbiol.2001;39(1):111-118. 23- Peng D; Zhao D; Liu J; Wang X; Yang K. and Xicheng H. Multipathogen infections in hospitalized children with acute respiratory infections. Virol J;2009;6:155. 24- Ferone EA;Berezin EN;Durigon GS;Finelli C;Felício MC;Storni JG;Durigon EL. andOliveira DB. Clinical and epidemiological aspects related to the detection of adenovirus or respiratory syncytial virus in infants hospitalized for acute lower respiratory tract infection. J Pediatr (Rio J); 2014: 90:42-49 25- Fattouh A; Mansi1 Y; El-anany M; El-kholy A. and El-karaksy H. Acute lower respiratory tract infection due to respiratory syncytial virus in a group of Egyptian children under 5 years of age. Italian Journal of Pediatrics, 2011, 37:14. 26- Mitra Barati, Mahshid Talebi-Taher, Samileh Noorbakhsh, Farideh Ebrahimi Taj, Azardokht TabatabaeiIranian: Diagnosis of the Adenovirus, RSV, and Influenza Virus by Rapid Detection Test (Immunochromato-graphy) in Children with Acute Respiratory Infection. Journal of Pediatric Society. 2010: 2: 79-83.         المجلد 7 , العددان 9-10 , ربيع الثاني 1437 - كانون الثاني (يناير) 2016 SCLA