بحث في أعداد المجلة الجملة   المؤلف

المجلد 7 , العددان 9-10 , ربيع الثاني 1437 - كانون الثاني (يناير) 2016   مقايسة البروتين المندمج BCR-ABL بالجريان الخلوي: هل هي طريقة واعدة لاستعراف الابيضاض النّقوي المزمن لدى مرضى سوريين؟ BCR-ABL Fusion Protein Flow Cytometric Assay: How Promising to Identify Chronic Myeloid Leukemia in Syrian Patients? ريم كيلاني1، فوزة منعم1، 2 Kelani R.1 and Monem F.1,2 1كلية الصيدلة، 1،2مستشفى الأسد الجامعي، جامعة دمشق. 1Faculty of Pharmacy, 1,2AL-Assad Hospital,Damascus University الملخص Abstract يوجد صبغي فيلادلفيا لدى 95% من مرضى الابيضاض النّقويّ المزمن، وهو ينتج البروتين المندمج الورميّ BCR-ABL oncoprotein الّذي يزيد فاعلية التّيروزين كيناز. هدفت دراستنا إلى تقييم مقايسة هذا البروتين مناعياً بالجريان الخلوي، وقدرتها على استعراف المرضى الحاملين لهذا الزّيغ. ضمت الدّراسة 12 مريضاً إيجابيي صبغي فيلادلفيا (Ph+)، وعشرين فرداً سليماً سلبيي صبغي فيلادلفيا(Ph-). فُصلت خلايا الدّم المحيطيّ وحيدة النّوى PBMCs باستخدام الفيكول، ثم استخدمت عتيدة BCR-ABL Protein Kit على مقياس الجريان الخلوي لقياس شدة التألق. استخدمت الاختبارات الإحصائية المناسبة واعتبرت قيمة p<0.05 معتداً بها إحصائياً. بلغ متوسط قيم متوسط شدة التّألق MFI 525.49 و16.40 لدى المرضى إيجابيي صبغي فيلادلفيا ولدى الأفراد الأصحاء، على الترتيب، مع إظهار فارق يعتدُّ به إحصائياً بينهما (p<0.05). بالإضافة إلى أن وجود صبغي فيلادلفيا ارتبط بقوة مع قيم متوسط شدة التألق (p<0.05). إن مقايسة البروتين المندمج BCR-ABL Proteinقادرة على استعراف الزّيغ BCR-ABL.   Philadelphia chromosome exists in 95% of chronic myeloid leukemia (CML) patients, producing BCR-ABL fusion oncoprotein with upregulated tyrosine kinase activity. Our study aimed to evaluate the BCR-ABL protein flow cytometric assay and estimate its efficacy to identify patients with such aberration. Twelve Philadelphia-positive (Ph+) patients and twenty Philadelphia-negative (Ph-) healthy individuals were recruited. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were separated using ficoll, Fluorescence intensity values were measured using BCR-ABL protein kit and flow cytometry instrument. Appropriate statistical tests were used, and a p-value<0.05 was considered statistically significant. The MFI mean values of Ph+ patients and Ph- healthy individuals were 525.49 and 16.4, respectively, showing a significant difference between the two groups (p<0.05). In addition, the presence of Philadelphia chromosome correlated strongly with MFI mean values (p<0.05). The BCR-ABL fusion protein assay seems efficacious to identify BCR-ABL aberration.   المواد والطّرقMaterials and Methods   تضمنت الدّراسة 32 فرداً قاموا بمراجعة وحدة الوراثة الخلويّة في مختبر مستشفى الأسد الجامعيّ بدمشق لإجراء اختبار التّنميط النّوويّ (الصيغة الصبغية) karyotyping، في الفترة الواقعة بين شهري شباط وتشرين الثّاني من عام 2013. جرى انتقاء 12/32 مريض CML ذوي إيجابيةٍ لصبغي فيلادلفيا، و20/32 فرداً لا يحملون صبغي فيلادلفيا. بعد توقيعهم على استمارة الموافقة المستنيرة، بُزل 8 مل من الدّم المحيطي من كلٍّ منهم، وجُمع على سترات الصّوديوم، وفصلت خلايا الدّم المحيطي وحيدة النّوى (PBMCs) peripheral blood mono nuclear cells باستخدام الفيكول (BD Biosciences, USA). استخدمت عتيدة BCR-ABL Protein Kit (BD Biosciences, USA) لتحري البروتين المندمج BCR-ABL protein حسب تعليمات الشّركة الصّانعة، وجهاز الجريان الخلوي BD FACSCaliburTM flow cytometry (BD Biosciences, USA). كما جرى اختبار طريقة تحري البروتين في الكريات البيضاء المقترحة في العتيدة المستخدمة، وذلك ببزل 3 مل من الدم المحيطي في أنبوب يحوي EDTA، واتّبعت تعليمات الشرّكة الصّانعة لتحري البروتين المندمجBCR-ABL oncoprotein في الكريات البيضاء (طريقة الكريات البيضاء WBC). قيست شدة التّألق (MFI) median fluorescence intensity للعينات جميعها. ولقد توزّعت القيم توزعاً غير طبيعيٍ، لذا استخدم اختبار مان ويتني Mann-Whitney U لمقارنة متوسط قيم MFI بين مجموعتي الدّراسة، كما استخدم اختبار Spearman’s Rho لدراسة الارتباط بين قيم شدّة التّألق والتّنميط النّوويّ، واعتبرت قيمة p<0,05 معتدّاً بها إحصائيّاً.   النّتائجResults   تراوحت قيم شدة التّألق MFI لدى المرضى إيجابيي صبغي فيلادلفيا بين 24.47 و1498.93 (mean ± SD = 561.14 ± 525.49)، بينما تراوحت قيم شدة التّألق MFI لدى الأفراد الأصحاء بين 14.59 و19.63 (mean ± SD = 16.40 ± 1.21) (الشكل 1)، حيث وُجد فارقٌ يعتدُّ به إحصائيّاً بين متوسطي قيم شدّة التّألق لهاتين المجموعتين [U(30)=0, Z=4.673, p<0.05] (الشكل 2). كما وجدت علاقة ارتباط إيجابية قوية عند مقارنة قيم شدة التألق الّتي حصلنا عليها، مع وجود صبغي فيلادلفيا باستخدام التنميط النوويّ الّتي تمّ تبنيها من نتائج وحدة الوراثة الخلويّة لأفراد الدراسة جميعهم [Spearman’s rho=0.842, n=32, p=0]. عند تحري البروتين المندمج في الكريات البيضاء (WBC) حصلنا على قيم لشدة التّألق ¬MFI لأفراد إيجابيي صبغي فيلادلفيا تتراوح في مجال مماثل (16.11-18.77) لذاك الملاحظ لدى الأفراد الأصحاء (Ph-).   المناقشة Discussion  قيّمنا في هذه الدّراسة طريقة كشف البروتين المندمج BCR-ABL protein باستخدام تقنية الجريان الخلويّ، وقد تماشت مع نتائج التّنميط النّوويّ (الصيغة الصبغبة) Karyotyping الّتي حصل عليها المريض، حيث امتلكت كلتاهما إمكان استعراف الأفراد إيجابيي الزّيغ BCR-ABL عن السّلبيين منهم، بغض النّظر عن أنّ طريقتنا تعمل على مستوى البروتين المترجم والأخرى تعتمد على المستوى الجيني الخلوي، وهذا ما توافق مع دراسة Heiba عام 2012 (7). لوحظ أن قيم MFI للبروتين المندمج BCR-ABL protein لدى مجموعة مرضى CML قد توزعت على مجال واسعٍ، على عكس توزع هذه القيم في مجموعة الأفراد سلبيي صبغي فيلادلفيا، وحيث أن مستويات البروتين المندمج المتباينة تمثّل تبايناً في التّعبير عن الجين BCR-ABL فإنها قد تعد مؤشّراً للحمل السّرطانيّ وشدّة المرض، وهذا ما أشارت إليه الدراسات الأخرى (7-11). عند تحري هذا البروتين في الكريات البيضاء WBC حصلنا على نتائج غير قادرة على استعراف الأفراد إيجابيي صبغي فيلادلفيا من السلبيين منهم، بخلاف ما توصلنا إليه عند تحريه في الخلايا وحيدة النوى للدم المحيطي PBMCs، وهذا قد يعزى إلى وجود المحببات عند اتباع طريقة WBC، والّتي تحوي كمية كبيرة من البروتياز الذي يسبب تدركاً للبروتين المندمج عند تحرره منها (اتصال شخصي)، وهذا ما يفسر قيم MFI المنخفضة الّتي حصلنا عليها في العينات إيجابية صبغي فيلادلفيا. على الرّغم من الموثوقيّة العالية لاختبار التّنميط النّوويّ كطريقةٍ معياريّةٍ لتشخيص مرضى CML، إلا أنّه اختبار باضع يُجرى على عينة نقي عظم تسبّب إزعاجاً وألماً للمريض، ويستغرق وقتاً طويلاً (أسبوع إلى أسبوعين وسطياً)، ويحتاج إنجازه لأختصاصيين ذوي خبرةٍ عاليةٍ تمكّنهم من تصنيف الصّبغيات ومعرفة شذوذاتها (2، 3، 6، 8)، بالإضافة إلى احتمال فشل الزرع الخلوي، أحد مراحل هذا الاختبار، وعندها لابد من الحصول على عينة نقي عظم جديدة. بينما أُنجزت طريقتنا خلال مدّةٍ لم تتجاوز الأربع ساعاتٍ، وكانت سهلةً غير معقدةٍ، استخدمت عينة دمٍ محيطي، وأعطت معلوماتٍ مختلفةٍ عن تلك الّتي يقدّمها التّنميط النّوويّ كونها تكشف البروتين المندمج الّذي يعد مسؤولاً عن النّمط الظّاهريّ للمرض ومعياراً لنشاطه.   الاستنتاج Conclusions  على الرغم من أن نتائجنا تحتاج إلى المزيد من الدّراسات لتأكيد قدرتها على مراقبة تقدّم سير المرض واستجابته للمعالجة، لكنها أوضحت أنه يمكن عدّ مقايسة البروتين المندمج BCR-ABL protein نصف الكميّة طريقةً واعدةً سريعةً وسهلةً وموثوقةً وغير باضعة تفيد في استعراف وجود البروتين BCR-ABL protein، يمكن استخدامها كاختبار تحرٍ لدى المرضى الذين يُشتبه إصابتهم بالابيضاض النّقوي المزمن، كما ننصح باستخدام الفيكول لإجراء هذه المقايسة في خلايا الدم المحيطي وحيدة النوى لتحاشي تأثير البروتياز المدرِّك للبروتين.  المراجع References  1-Cilloni D. and Saglio G. Molecular pathways: BCR-ABL. Clin Cancer Res,18(4):930-937, 2012. 2-Dasgupta S; Mukhopadhyay A. and Mukhopadhyay S. An accurate and rapid flowcytomertic diagnosis of BCR ABL fusion protein an alternative way to detect the different phases of chronic myeloid leukemia. International Journal of Advanced Scientific and Technical Research, 3(3):195-207, 2013. 3-Dekking E. et al. EuroFlow Consortium (EU-FP6, LSHB-CT-2006-018708). Detection of fusion genes at the protein level in leukemia patients via the flow cytometric immunobead assay. Best Pract Res Clin Haematol, 23(3):333-345, 2010. 4-Druker BJ. et al. Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia. N Engl J Med, 355(23):2408-2417, 2006. 5-Eiring AM. et al. Advances in the treatment of chronic myeloid leukemia. BMC Med, 9:99, 2011. 6-Grigoriou EE. et al. BCR-ABL fusion protein detection in peripheral blood and bone marrow samples of adult precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia patients using the flow cytometric immunobead assay. Clin Chem Lab Med, 50(9):1657-1663, 2012. 7-Heiba NM. Rapid detection of Bcr-Abl fusion protein by immunobead assay flow cytometry in leukemia patients. Life Science Journal, 9(4):197-203, 2012. 8-Hevessy Z. et al. Laboratory evaluation of a flow cytometric BCR-ABL immunobead assay. Clin Chem Lab Med, 50(4):689-692, 2011. 9- Lucas CM. et al. Rapid diagnosis of chronic myeloid leukemia by flow cytometric detection of BCR-ABL1 protein. Haematologica, 96(7):1077-1078, 2011. 10-Raponi S. et al. An accurate and rapid flow cytometric diagnosis of BCR-ABL positive acute lymphoblastic leukemia. Haematologica, 94(12):1767-1770, 2009. 11-Weerkamp F. et al. EuroFlow Consortium. Flow cytometric immunobead assay for the detection of BCR-ABL fusion proteins in leukemia patients. Leukemia, 23(6):1106-1117, 2009.         المجلد 7 , العددان 9-10 , ربيع الثاني 1437 - كانون الثاني (يناير) 2016 SCLA