بحث في أعداد المجلة الجملة   المؤلف

المجلد 7 , العددان 9-10 , ربيع الثاني 1437 - كانون الثاني (يناير) 2016   تعيين قيم Smac/DIABLO المصلية لدى مرضى سرطان بروستاتة سوريين Determination the Serum Values of "Smac/DIABLO" in Syrian Prostate Cancer Patients د. رشا عرموطلي وأ. د. جمانة الصالح Armoutly R. and Saleh J. كلية الصيدلة، جامعة دمشق Faculty of Pharmacy, Damascus University الملخص Abstract تلعب الاستماتة الخلوية وبروتيناتها دوراً هاماً في المحافظة على التعداد الخلوي الطبيعي في أنسجة الجسم ومنع تشكل السرطان في هذه الأنسجة. وكشف الباحثون مؤخراً بروتين الاستماتة Smac/DIABLO الذي هو عبارة عن بروتين متقدري يتحرر من المتقدرة إلى العصارة الخلوية خلال تفعيل الاستماتة ويتآثر مع مثبط بروتينات الاستماتة (IAPs) مؤدياً إلى تثبيط فاعلية IAPs المرتبطة بالـ caspase. إن العديد من الدراسات البحثية دعمت مؤخراً دور هذا البروتين الرئيسي في تشخيص السرطان إلى جانب الاختبارات الأخرى. لذلك كان هدف الدراسة تعيين أهمية قياس مستويات Smac/DIABLO المصلية في تشخيص السرطان. قيست المستويات المصلية لبروتين Smac/DIABLO لدى 20 مريضاً بسرطان البروستاتة ولدى 21 فرداً صحيحاً ظاهرياً (حالات شاهدة)، باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). أظهرت دراستنا أن المستويات المصلية لـ Smac/DIABLO كانت منخفضة بشكل يُعتد به (P<0.001) لدى مرضى سرطان البروستاتة بالمقارنة مع المجموعة الشاهدة، كما وجدنا علاقة عكسية بين مستويات Smac/DIABLO المصلية ومستويات PSA المصلية لدى المجموعة ذاتها. تقترح موجوداتنا أن قياس مستويات Smac/DIABLO في المصل يمكن أن يعد، إلى جانب الاختبارات الأخرى، كمتثابتة تشخيصية وإنذارية لدى مرضى سرطان البروستاتة.   Apoptosis and apoptotic proteins play a significant role in the maintenance of the normal cellular number in body's tissues and prevent cancer formation in these tissues. Recently, researchers discovered Smac/DIABLO which is a mitochondrial protein releases from mitochondria to the cytosol during the activation of apoptosis and interacts with Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAPs) leading to the inhibition of the capase-binding activity of IAPs. Recently, many research studies have supported a major role for this protein in cancer diagnosis in addition to the other tests. So, the aim of the study was to determine the importance of measuring serum levels of Smac/DIABLO in cancer diagnosis. Serum levels of Smac/DIABLO were measured in 20 patients with Prostate cancer and 21 apparently healthy subjects (control cases), using enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA). Our study showed that serum levels of Smac/DIABLO were significantly decreased (p<0.001) in patients with prostate cancer compared to the control group, and also we found a reverse correlation between the serum levels of Smac/DIABLO in patients group and the serum levels of PSA in the same group. Our findings suggest that measuring the levels of Smac/DIABLO in the serum may be considered, in addition to the other tests, as a prognostic and diagnostic parameter in patients with prostate cancer.   المقدمة Introduction  تعد الاستماتة أو الموت الخلوي المبرمج آلية هامة في المحافظة على العدد الضروري الكافي من الخلايا في الأنسجة، لاسيما الأنسجة التي تملك معدلاً عالياً من التكاثر، حيث تقوم بتقليل الخلايا غير المرغوبة ودفعها إلى الموت (1). وهي تحدث بصورة طبيعية ضمن النسيج خلال عملية التطور، لذلك سوف يؤدي الخلل في هذه العملية إلى مقاومة الخلايا للاستماتة وللمعالجة وبالتالي حدوث السرطان (2). ونظراً لأهمية هذا البرنامج الخلوي المنظم، توجهت الدراسات الحديثة إلى إظهار دور البروتينات التي تتدخل في تفعيل الاستماتة وشلال الـ caspases في تحريض الموت الخلوي المبرمج وبالتالي تقليل تشكل السرطان وزيادة حساسية الخلايا لأنواع المعالجات المطبقة (3، 4). ولقد جرى التعرف على بروتين Smac/DIABLO، الذي هو اختصار لـ Second mitochondria-derived activator of caspases. Direct IAP-binding protein with low pI، وهو عبارة عن بروتين مؤلف من 239 حمضاً أمينياً، وزنه الجزيئي 27 كيلو دالتون يتوضع في الغشاء الداخلي للمتقدرة كطليعة بروتين متقدري ثم يتفعل بشطر المتوالية المتقدرية المستهدفة MTS (mitochondrial targeting sequence) معطية الشكل الناضج الذي يتحرر إلى العصارة الخلوية وتعد الصيغة المثنوية dimeric هي الشكل الفعال من البروتين (5). ويتلخص عمله بارتباطه مع مثبطات بروتينات الاستماتة IAPs (inhibitor of apoptosis protein) عبر منطقة IBM (IAP binding motif) المؤلفة من أربعة أحماض أمينية هي الألانين والفالين والبرولين والإيزولوسين، حيث ترتبط هذه المنطقة مع مجالات BIR (Baculovirus IAP repeat) الموجودة في مثبطات بروتينات الاستماتة، وهذا الارتباط سيؤدي إلى تحرير كل من caspase-3 وcaspase-9 من ارتباطها مع مثبطات بروتينات الاستماتة وبالتالي تفعيل شلال الاستماتة (6). يجري التعبير عن هذا البروتين في معظم السرطانات، من ضمنها الثدي والرئة والرحم والمثانة والبروستاتة على مستوى الأنسجة، حيث يزداد التعبير عنه في الأنسجة السليمة مقارنة مع الأنسجة المتسرطنة (7-9)، وهذا يتطلب دائماً اجراءات باضعة لإتمام الكشف، لذلك توجهت الأبحاث مؤخراً إلى كشف وجود Smac/DIABLO في المصل وتبين أن مستوياته المصلية تكون أعلى بحوالي ضعفين لدى الأشخاص الأسوياء من مستوياته لدى مرضى السرطان (المبيض والمثانة) (10، 11). وماتزال الأبحاث حول هذا البروتين مستمرة في مختلف أنماط السرطانات، لذلك جرى في هذه الدراسة تعيين مستوياته المصلية لدى مرضى سرطان البروستاتة، الذي يعد من أكثر أنماط السرطانات شيوعاً لدى الرجال وثاني مسبب للوفيات بعد سرطان الرئة، ويتظاهر بارتفاع المستضد البروستاتي النوعي (PSA) الذي هو عبارة عن بروتين سكري تفرزه خلايا غدة البروستاتة ويعد مؤشراً التهابياً يشير إلى إمكان تطور سرطان البروستاتة في بعض الحالات (12). ولكن تبقى الأداة الأهم لتحديد وجود سرطان في غدة البروستاتة هي الخزعة وفحصها لدى المشرح المرضي والتي تحدد التشخيص بالإضافة إلى درجة السرطان وامتداد الورم (13). تشير العديد من الدراسات إلى أن الفحوص المصلية تعد وسيلة فعالة لتخفيض نسبة الوفيات (14). وعلى الرغم من أن اختبار الـPSA يبقى الأفضل حالياً لكشف سرطان البروستاتة، إلا أن سلبياته جعلت من الضروري إضافة اختبارات أخرى مساعدة لتأكيد وجود السرطان ويفضل أن تكون مصلية لتجنب تعريض المريض لخزعة غير ضرورية (15)، فمثلاً عمليات رضّ البروستاتة بالمس الشرجي DRE، وأخذ خزعة للتشريح المرضي وغيرها من العمليات أو التصوير للبروستاتة تزيد قيمة الـPSA زيادة كاذبة (16)، كما أظهرت عدة دراسات أن 15-33% من السرطانات المكتشفة بالخزعة تكون لدى مرضى لديهم قيمة الـPSA أقل من 4 نغ/مل، وهذا ما يسبب مشكلة عدم وجود قيمة موثوقة لنفي التسرطن (17).  المواد والطرق Materials and methods  شملت الدراسة 41 ذكراً تراوحت أعمارهم بين 40-75 عاماً. من المراجعين لمستشفى الهلال الأحمر السوري وجرى تقسيمهم إلى مجموعتين: - مجموعة المرضى تضم 20 مريض سرطان بروستاتة تراوحت أعمارهم بين 40-75 عاماً، متوسط حسابي قدره 61 عاماً، مشخصين وفقاً لنتيجة التشريح المرضي حسب نموذج TNM وأيضاً وفقاً لقيم PSA لديهم وغير معالجين مسبقاً بأي نمط علاجي. - المجموعة الشاهدة تضم 21 رجلاً سليماً تراوحت أعمارهم بين 40-60 عاماً، بمتوسط حسابي قدره 52 عاماً، لا يعانون من أية أعراض بولية وكانت لديهم قيم PSA سوية. جُمعت عينات الدم ببزل الوريد لكل من المرضى والأسوياء ضمن أنبوب جاف، ثم فُصِل المصل ووزع على أنابيب ايبندورف، حفظت بدرجة الحرارة –80˚C إلى حين إجراء المقايسة. حُددت مستويات Smac/DIABLO المصلية بطريقة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ELISA، باستخدام عتيدة من شركة SunRed الصينية والتي تحمل اسم Human (DIABLO) ELISA Kit ذات الرقم 201-12-5299. جرى تمديد المحلول المعياري وتحضير سلسلة معيارية. وقيست شدة اللون بموجة طولها 450 نانومتر لكل من السلسلة المعيارية والعينات، ورُسم منحنى معياري وحُسبت قيم التراكيز للمجموعتين المرضى والشاهدة باستخدام برنامج Excel 2007.   التحليل الإحصائي Statistical analysis  - جرى التعبير عن القيم المختلفة بحساب المتوسط الحسابي والانحراف المعياري لكل المجموعات. - جرى استخدام اختبار T student لتحديد كون الفارق بين المتوسطات ناجماً عن الصدفة أم أنه فارق جوهري يُعتد به إحصائياً. - استخدم اختبار Pearson لدراسة علاقة الارتباط بين المتثابتات. - اعتمدت قيمة P<0.05 كقيمة يعتد بها إحصائياً.   النتائج Results  تراكيز الـ Smac/DIABLO المصلية لدى مجموعات الدراسة قيست تراكيز Smac/DIABLO المصلية لدى المجموعة الشاهدة وقورنت مع تراكيزه لدى مجموعة مرضى سرطان البروستاتة، حيث بلغت قيمة المتوسط الحسابي لتراكيز Smac/DIABLO المصلية 219.414 بيكوغرام/ مل لدى المجموعة الشاهدة، بينما كانت قيمة المتوسط الحسابي لتراكيزه 106.79 بيكوغرام/ مل لدى مجموعة مرضى سرطان البروستاتة Prostate cancer. ولقد تراوحت قيم تراكيز Smac/DIABLO لدى المجموعة الشاهدة بين 116.2 بيكوغرام/ مل و348.7 بيكوغرام/ مل، بينما تراوحت القيم بين 68.6 بيكوغرام/ مل و145.3 بيكوغرام/ مل لدى مجموعة مرضى سرطان البروستاتة. بتطبيق اختبار T-Student لتراكيز الـSmac/DIABLO وجد فارق يعتد به إحصائياً (P<0.001) بين مجموعة مرضى سرطان البروستاتة والمجموعة الشاهدة (الشكل1). ولدراسة العلاقة بين تركيز Smac/DIABLO المصلي لدى مجموعة مرضى سرطان البروستاتة وبين تركيز PSA للمجموعة نفسها والتي استُحصلت من سجلات المرضى في المستشفى، جرى تطبيق اختبار بيرسون Pearson correlation فكانت قيمة معامل الارتباط r = -513، أي توجد علاقة ارتباط عكسية متوسطة لكن معتد بها احصائياً (P=0.012) بين التركيزين (الشكل 2).   المناقشة Discussion  أظهرت دراستنا وجود فارق جوهري بين تركيزSmac/DIABLO المصلي لدى مجموعة مرضى سرطان البروستاتة وتركيزه لدى المجموعة الشاهدة، حيث كانت قيمة P<0.001. وتوافقت نتائج دراستنا مع دراسة Mizutani وزملائه في اليابان عام 2012 والتي كانت من أوائل الأبحاث التي أشارت إلى إمكانية الكشف عن Smac/DIABLO في المصل ومن ثم تقييم ما إذا كانت مستوياته المصلية ذات أهمية إنذارية لدى مرضى السرطان، حيث سُجلت العديد من الأبحاث سابقاً في مجال التعبير عن Smac/DIABLO على مستوى الأنسجة لكنها كانت الأولى في تحديد مستوياته المصلية لدى مرضى سرطان المثانة، حيث أظهرت دراسته أن متوسط التراكيز المصلية لبروتين Smac/DIABLO لدى مرضى سرطان المثانة كان أقل بضعفين تقريباً من متوسط التراكيز لدى الأسوياء، وأن متوسط التركيز يرتبط ارتباطاً عكسياً مع درجة ومرحلة تطور الورم. ولقد أظهرت الدراسة اليابانية للمرة الأولى أن المستوى المصلي المرتفع من Smac/DIABLO يُعد عامل إنذار جيد لدى مرضى السرطان. وتبقى الآلية غير واضحة بشكل كافٍ، لكن على اعتبار أن الـ Smac/DIABLO بروتين تنظيمي استماتي، فمن الممكن أن تكون مستوياته المصلية المرتفعة ناتجة عن تحرره من الخلايا الخاضعة للاستماتة. وعلى النقيض، فإن مستوياته المنخفضة يمكن أن تعكس هروب الخلايا الورمية من الاستماتة وبالتالي عامل إنذار سيء للمرض (11). توافقت نتائج دراستنا أيضاً مع نتائج دراسة Bozena وزملائه في بولندا عام 2015 والتي كانت ثاني دراسة مصلية داعمة لسابقتها عن وجود بروتين Smac/DIABLO في المصل، وأن مستواه المصلي يمكن أن يتنبأ بنتيجة سريرية تشخيصية وأن المستويات المنخفضة تكون مترافقة مع إنذار سيء لسرطان المبيض، حيث تتحرر كميات منخفضة كلما كان الورم أكبر حجماً (10). كانت دراستنا هي الدراسة المصلية الأولى التي أجريت على مرضى سرطان بروستاتة سوريين، وأظهرت انخفاض مستويات هذا البروتين المصلية لدى المرضى مقارنة مع الأسوياء. وأيضاً يمكن القول بأن وجوده في الدوران قد يعود للموت الخلوي الطبيعي الذي تخضع له الخلايا الطبيعية أو الورمية، لذلك تتناسب مستوياته المصلية عكساً مع درجة تطور الورم ومرحلته. وعلى اعتبار أن قياس تراكيز PSA لدى مرضى سرطان البروستاتة يُعد أداة تشخيصية هامة، فقد قمنا بدراسة علاقة الارتباط بين التركيز المصلي لـ Smac/DIABLO وتركيز PSA لدى مجموعة المرضى ووجدنا علاقة ارتباط عكسية بينهما، فكلما ارتفع تركيز PSA لدى المرضى انخفض تركيز Smac/DIABLO المصلي، ويتوافق هذا أيضاً مع أن متوسط التركيز يرتبط ارتباطاً عكسياً مع درجة ومرحلة تطور الورم والتي توصل إليها Mizutani وزملائه (11). يدعم هذا الاستنتاج أن مستويات Smac/DIABLO المصلية تنخفض في سرطان البروستاتة مقارنة مع مستوياته لدى الأسوياء، لذلك فإن قياس هذه المستويات قد يدعم التشخيص المبكر لسرطان البروستاتة، إلى جانب قياس PSA، وتقليل عدد المرضى الخاضعين لخزعة بروستاتة غير ضرورية. ولا يمكن أن نقول أن قياس مستوياته تعد أفضل من قياس تراكيز PSA وإنما داعمة ومساعدة لتراكيز PSA، لذلك من الممكن اعتباره متثابتة تشخيصية مساعدة في تشخيص السرطان.   المراجع References:  1- Perl M; Chung CS. and Ayala A. Apoptosis. Crit Care Med; 33(12): 526-529, 2005. 2- Brown M; He K. and Yu J. Cell death signaling in cancer biology and treatment.Smac IAP addiction in cancer. Ed: Daniel E. Johnson. Pub: Humana Press, Totowa, NJ; 255-279, 2013. 3- Endo K; Kohnoe S; Watanabe A; Tashiro H; Sakata H. and Maehari Y. Clinical significance of Smac/DIABLO expression in colorectal cancer. Oncol (21), 351-355, 2009. 4- Mizutani Y. et al. Downregulation of Smac/DIABLO Expression in Renal Cell Carcinoma and Its Prognostic Significance. J Clin Oncol, 23 (3): 448-454, 2005. 5- Qin S; Yang C; Li S; Xu C; Zhoe Y. and Ren H. Smac: Its role in apoptosis induction and use in lung cancer diagnosis and treatment. Cancer Lett. May (1):9-13, 2012. 6- Mizutani Y; katsuoka Y. and Bonavida B. Prognostic significance of second mitochondria-derived activator ofcaspase (Smac/DIABLO) expression in bladder cancer and target for therapy. Int j oncol; 37: 503-508, 2010. 7- Pluta P. et al. Correlation of Smac/DIABLO protein expression with the clinico-pathological features of breast cancerpatients. Neoplasma,58(5): 430-435, 2011. 8- Sekimura A. et al. Expression of Smac/DIABLO is a novel prognostic marker in lung cancer. JClin Oncol, (11):797-802, 2004. 9- Arellano-Llamas A; Garcia FJ; Perez D; Cantu D; Espinosa M; De la Garza JG; Maldonado V. and Melendez-Zajgla J. High Smac/DIABLO expression is associated with early local recurrence of cervical cancer. BMC Cancer. Oct 26;6:256. 2006. 10- Dobrzycka B; Mackowiak B; Terlikowska M; Kinalski M. and Terlikowski S. Prognostic significance of pretreatment VEGF, survivin, and Smac/DIABLO serum levels in patients with serous ovarian carcinoma. Tumor Biol, 2015. 11- Mizutani Y; katsuoka Y. and Bonavida B. Low circulating serum levels of second mitochondria-derived activator of caspase (Smac/Diablo) in patients with bladder cancer. Int JOncol, (40):1246-1250, 2012. 12- Cornett P. and Dea T. Current medical diagnosis & treatment. Cancer, Ed: McPhee S J, Papadakis M and Rabow M. Pub: Mc Graw Hill Medical, (51): 1663-1727, 2011. 13- Burford DC; Kirby M. and Austoker A. Prostate Cancer Risk Management Programme Information for primary care; PSA testing in asymptomatic men.Evidence document. NHS Cancer Screening Programmes, 143-213, 2010. 14- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2013. Atlanta, Ga: American Cancer Society; 2013. 15- Nam RK. et al. Serum Human Glandular Kallikrein-2 Protease levels Predict the presense of Preostate Cancer among men with Elevated Prostate-specific Antigen. J clin oncol,18, 5, 1036-1042, 2000. 16-American Urological Association (AUA), Prostate-Specific Antigen (PSA), Best Practice Policy. Oncology. Vol 14, No 2 (February 2000). 17- Jamaspishvili T. Biomarkers and Models for Differentiating Prostate Cancer from Non-Cancerous Diseases. Palacky University Olomouc, Czech Republic, 6-52, 2011.     المجلد 7 , العددان 9-10 , ربيع الثاني 1437 - كانون الثاني (يناير) 2016 SCLA