بحث في أعداد المجلة الجملة   المؤلف

المجلد 8 , العددان 1 و 2 , رمضان 1437 - تموز (يوليو) 2016   استقصاء التعدد الشكلي BsmI) وApaI) لجين مستقبل الفيتامين D لدى مرضى الربو Investigation of Vitamin D Receptor Gene (VDR) Polymorphisms (ApaI, BsmI) in Asthmatic Patients د. هيثم الدرة وأ. د. شادن حداد Aldurra H. and Haddad Sh. *كلية الصيدلة، جامعة دمشق Faculty of Pharmacy, Damascus University الملخص Abstract يعد الربو أحد الأمراض المزمنة الشائعة للطرق التنفسية، وهو مرض معقد بكل من عوامل اختطاره الجينية والبيئية. يحدث الربو نتيجة التآثر بين العديد من الجينات، فبعضها يملك أثراً واقياً وبعضها الآخر يساهم في إمراضية الداء. كان تفرس الجينوم قد عين هوية ارتباطات مقترحة أو يُعتد بها على صبغيات مختلفة، من ضمنها المنطقة q13–23 في الصبغي 12، الحاوية على جين مستقبل الفيتامين D (VDR) Vitamin D receptor (VDR) gene. هدفت هذه الدراسة إلى استقصاء الارتباط بين التعددين الشكليين BsmI وApaI والاستعداد الجيني للإصابة بمرض الربو لدى مجموعة من المرضى السوريين. بلغ عدد المسجلين في هذه الدراسة 50 مريض ربو و50 شاهداً، أُجري لهم تحليل تعدد أشكال الشدف مقيدة الطول باستخدام تفاعل البوليميراز التسلسلي PCR-RFLP لجين مستقبل الفيتامين D. أظهرت نتائجنا ارتباطاً يعتد به للتعدد الشكلي BsmI لجين مستقبل الفيتامين D ومرض الربو عند المقارنة بين المجموعة الشاهدة ومجموعة المرضى (P value = 0.01, OR: 2.44, 95% CI: 1.38 - 4.32). يقترح هذا أنه يمكن للتعدد الشكلي BsmI لجين VDR أن يسهم بشكل يُعتد به في تطور الربو في مجموعة سكانية سورية.   Asthma is one of the common chronic diseases of airways; it is a complex disease with both genetic and environmental risk factors. Asthma is caused by multiple interacting genes, some having a protective effect and others contributing to the disease pathogenesis. Genome scans for asthma have identified suggestive or significant linkages on different chromosomes, including chromosome 12, region q13–23, housing the vitamin D receptor (VDR) gene. This study aimed to investigate an association between BsmI and ApaI polymorphisms and the genetic susceptibility to asthma in Syrian population. 50 asthmatic patients and 50 controls were enrolled in this study; PCR-RFLP was performed to examine polymorphisms in the VDR gene. Our results showed a statistically significant association of the BsmI polymorphism of the VDR and the asthma when comparing healthy controls to asthmatic patients (P value = 0.01, OR: 2.44, 95% CI: 1.38, 4.32).   المقدمة Introduction  يعد الربو مرضا التهابياً مزمنا للطرق التنفسية، يتميز بتضيق متقطع للمسلك الهوائي وانسداد المجرى التنفسي مؤدياً إلى أعراض ضيق التنفس، الأزيز، السعال، انقطاع النَّفَس (6). وكغيره من الأمراض الأرجية يعد الربو اضطرابا معقداً، يحدث نتيجة التفاعل بين العديد من الجينات التي يملك بعضها تأثيراً واقياً وبعضها الآخر يساهم في الإمراضية (20). خلال العقود الماضية، أجريت العديد من الدراسات حول تأثير التعددات الشكلية للجينات على الربو، تشير هذه الدراسات إلى وجود العديد من المواضع الجينية المؤهبة للمرض مثل:2q ، 5q، 6p، 11q، 12q و 13q جرى تحديدها من خلال التحري الواسع للجينوم البشري (20). يلعب الفيتامين D دوراً أساسياً في المحافظة على استتباب الكالسيوم (7،8 ). إن مستقبل الفيتامين D Vitamin D receptor (VDR) هو المستقبل الرئيسي الذي يربط [1, 25-(OH)2D3]. تتوزع مستقبلات الفيتامين D ليس فقط في الأمعاء والعظم وإنما في العديد من الأنسجة مثل الدماغ، القلب، المعدة، البنكرياس، الخلايا اللمفاوية T و(7) B. ينتمي مستقبل الفيتامين D Vitamin D receptor (VDR) إلى طائفة المستقبلات النوويةNuclear receptor superfamily (9). كعامل منظم للانتساخ، يتواسط مستقبل الفيتامين D تأثيرات الشكل الفعال بيولوجياً للفيتامين D [1,25(OH)2D3] (5). عند التفعيل، ينظم المعقد مستقبل/ لجين الانتساخ للجينات الهدف (5،11 ). تشير الدراسات إلى أن للفيتامين D ومستقبله تأثيرات مناعية مهمة. ومن بين هذه التأثيرات المناعية دور الفيتامين D في تطور الخلايا اللمفاوية المساعدة T helper (Th) وتعديل بروفيل (شاكلة) السيتوكينات cytokine profile (8). على سبيل المثال لدى الفأر، يثبط الفيتامين D تطور Th1 وإنتاج الانترفيرون ويعزز تطور Th2 (9)، في حين أنه لدى البشر على الرغم من أن الفيتامين D يثبط استجابات Th1 إلا أن دوره غير مؤكد في تعزيز فعالية (1) Th2. يتوضع مستقبل الفيتامين D على الذراع الطويل للصبغي 12 في المنطقة 12q. وفي دراسات تحليل الارتباط linkage analysis جرى ربط هذه المنطقة مع الربو والعديد من الأمراض الأرجية (15). وبما أن الربو يتميز بفعالية مفرطة للخلايا التائية Th2، لذلك نفترض أن VDR يمكن أن يلعب دوراً مهماً في الاستعداد الجيني للإصابة بمرض الربو. تهدف الدراسة إلى التحري عن الترافق بين التعددين الشكليين BsmIوApaI ومرض الربو في مجموعة سكانية سورية.   المواد والطرق Materials and Methods  أفراد الدراسة Study Subjects جرت الدراسة على50 متطوعاً مصاباً بالربو، في الفترة الممتدة من شهر تشرين الأول 2011 حتى حزيران 2012، في الهيئة العامة للتقانة الحيوية. إن كافة الأفراد المشاركين في الدراسة هم سوريون يقطنون في دمشق أو ضواحيها، حيث جرى الحصول على المرضى المصابين بالربو من مستشفى الأسد الجامعي ومستشفى المواساة. وجرى تشخيص الربو لديهم من خلال قياس وظائف الرئة باستخدام قِياس النّفس‎ spirometry. كما جرى الحصول على معلومات أخرى تتعلق بالعمر، الجنس، الخصائص السريرية للمشاركين في البحث (الجدول 1). ضمت المجموعة الشاهدة 50 شخصاً، جرى انتقاؤهم من المناطق نفسها، بحيث تكون معايير العمر والجنس والحالة الاقتصادية الاجتماعية متقاربة مع المرضى. لم يسبق للأصحاء أن شُخص لديهم مرض ربو أو أي قصة ربو أو أية أمراض رئوية. وجرى استبعاد النساء الحوامل، المدخنين، المصابين بالسكري، مرضى الضغط. استخلاص الدنا DNA isolation جُمعت عينات الدم ضمن أنبوب EDTA. استُخلص الدنا من كريات الدم البيض في الدم المحيطي باستخدام عتيدة للعزل (QIA amp DNA Kits mini catalog No 51306) من شركة QIAGEN,Inc الألمانية. وحُفظت عينات الدنا المستخلصة في الدرجة -20 C°من أجل معاملة لاحقة. اكتشاف التعددات الشكلية Detection of the polymorphisms جرى تعيين النمط الجيني لتعددين شكليين في جين VDR من خلال استخدام تفاعل البوليميراز التسلسلي من أجل التضخيم واستخدام الهضم الإنزيمي لناتج التضخيم بواسطة إنزيمي اقتطاع ApaI ، BsmI. تتوضع المنطقة المضخمة من الجين والتي تحتوي موقعي التعددين الشكلين بين الانترون 8 والإكسون 9 على النهاية5` وهي حوالي 2000 bp (الجدول 2). تفاعل البوليميراز التسلسلي PCR Reaction استُخدمت مُشرعات نوعية لجين VDR بحيث يتوضع المشرع (For) في الإكسون 8: (5`-CAACCAAGACTACAAGTACCG CGTCAGTGA-3`). ويتوضع المشرع (Rev) في الإكسون 9: (5`-CACTTCGAGCACAAGGGGC GTTAGC-3`). من شركة VBC النمساوية. أُنجز تفاعل البوليميراز في حجم50 μL بإضافة: 50 ng من الدنا DNA،20 pmol لكل مشرع وباستخدام عتيدة PCR Master Mix (2X) لشركة Fermentas. أُنجز التفاعل بواسطة جهاز Thermal Cycler، واستُخدام البرنامج الحراري التالي: 95 C°لمدة 3 دقائق، 35 دورة من النظام التالي: تمسخ الدنا بدرجة حرارة 94.5 C° لمدة دقيقة، ثم الالتحام مع المشرع بدرجة حرارة1 6 C°لمدة دقيقة، ثم إطالة بدرجة حرارة 72 C°لمدة دقيقة والإطالة النهائية بدرجة حرارة 72 C°لمدة 7 دقائق، وذلك بناء على دراسة Gürsoy S. et al; 2008. جرى تظهير ناتج تفاعل PCR بالرحلان الكهربائي على هلامة الأغاروز 1.5% وذلك للتأكد من نجاح تفاعل التضخيم، ثم هُضمت العينات باستخدام ApaI و BsmIومن ثم جرى تظهير نواتج الهضم بالرحلان الكهربائي على هلامة الأغاروز %1.5. استُخدم سلم جزيئي: (100 bp marker 100 bp plus DNA Ladder, MBI Fermentas)). استُخدم بروميد الايثيديومEthidium bromide من أجل تحري الدنا. عُرضت الهلامة إلى ضوء UV باستخدام جملة الرحلان الكهربائي الهلامي Gel electrophoresis visualizing system لتحري العُصابات الناتجة. كانت شروط الهضم على الشكل التالي؛ApaI : 5 ساعات بالدرجة C°65،BsmI : 5ساعات بالدرجة C°37. الدراسة الإحصائية Statistical Study استًخدم اختبار كاي مربع χ2 لتحليل المعطيات بين المجموعات. تمت مقارنة النمط الجيني والتواترات الأليلية لكل من ApaI، BsmI في جين VDR بين المجموعات. استُخدمت حزمة البرنامج الإحصائي SPSS 20 Chicago, IL, U.S.A. من أجل التحليل الإحصائي.   النتائج Results   جرى في هذه الدراسة التحري عن تعددين شكليين لجين VDRبالهضم الإنزيمي بواسطة ApaI، BsmI من خلال تقنيـة PCR-RFLP لدى مرضى الربو ومقارنة ذلك مع نتائج أفراد أصحاء. حيث حُدد النمط الجيني للإنزيمات ApaI، BsmI على الشكل التالي: A، Bإشارة إلى غياب موقع القطع بينما a، bإشارة إلى وجود موقع القطع، في حين كانت أطوال القطع المنمطة جينياً بعد الهضم (الشكل1؛a –b ) على الشكل التالي: AA: 2000 bp؛Aa : 2000 bp، 1700 bp، 300 bp؛aa : 1700 bp، 300 bp. BB: 2000 bp؛Bb : 2000 bp، 1350 bp، 650 bp؛bb : 1350 bp، 650 bp. بالنسبة للتعدد الشكلي BsmI في جين VDR كان تواتر الأليل B مساوياً 60 وتواتر الأليل b مساوياً 40 لدى مجموعة المرضى المصابين بالربو، مقابل 38 للأليل B و62 للأليل b لدى المجموعة الشاهدة، يبدي هذا فارقاً إحصائياً يعتد به (P=0.002) ونسبة أرجحية OR: 2.44, %95 CI: 1.38 - 4.32)) في توزع الألائل بين مجموعة المرضى والمجموعة الشاهدة. أما بالنسبة للتعدد الشكلي ApaI في جين VDR فكان تواتر الأليل A مساوياً 72 وتواتر الأليل a مساوياً 28 لدى مجموعة المرضى المصابين بالربو، مقابل 67 للأليل A و33 للأليل a لدى المجموعة الشاهدة، يبدي هذا فارقاً إحصائياً لا يعتد به (P=0.443) ونسبة أرجحية OR: 1.26, %95 CI: 0.69 - 2.31)) في توزع الألائل بين مجموعة المرضى والمجموعة الشاهدة. إن الاختلافات في توزع الأنماط الجينية وفي توزع الألائل بين مجموعة المرضى والمجموعة الشاهدة مذكورة في الجدولين 3 و4. إذاً يترافق التعدد الشكلي (rs1544410 (BsmI وبشكل يُعتد به مع الربو في مجموعة سكانية سورية، بحيث يكون للأليل b دوراً وقائياَ من مرض الربو.     المناقشة Discussion  يعد هذا البحث أول بحث يستقصي الترافق بين التعدد الشكلي لإنزيمي ApaI، BsmI ومرض الربو في مجموعة سكانية سورية. فالتعبير الواسع الانتشار لجين VDR يجري في العديد من الخلايا المناعية مثل الخلايا المتغصنة(17) ، الخلايا البدينة (3) والخلايا T و B المفعلة (4، 17) وهذا يجعله مُعدّلاً مناعياً أساسياً Central immunomodulator، وبالتالي يمكن له أن يعدل كلتا الاستجابتين المناعية الفطرية والمكتسبة. لذا فإن VDR هو جين مرشح لدراسة ترافقه مع مرض الربو والذي يتميز بفعالية مفرطة للخلاياTh2 . ولوحظ أن التنوعات المختلفة variants لجين VDR تترافق مع الأمراض المتواسطة بالمناعة والتي تتصف بخلل في تطور Th (12). وتشير الدراسات السابقة إلى أن التعددات الشكلية في منطقة الانترون 8 والإكسون9 في جين VDR تملك تأثيراً على التعبير عنه (10). أثبت ذلك من خلال استخدام recombinant VDR luciferase reporter gene، حيث لوحظ ترافق بين هذه التعددات الشكلية وثباتية VDR mRNA (18). وبالتالي فإن هذه التعددات الشكلية تؤثر على الجملة المناعية من خلال تنظيم التعبير عن مستويات VDR (2). أظهرت نتائجنا وجود ترافق بين التعدد الشكلي BsmI ومرض الربو ومن المحتمل أن هذا التعدد الشكلي يسبب التبدلات المذكورة في ثباتية VDR mRNA وبالتالي قد يكون مسؤولاً عن خلل التنظيم المناعي المشاهد لدى مرضى الربو. أظهر Raby وزملاؤه عام 2004 أن هذه التعددات الشكلية تترافق وبشكل معقد مع الربو (14) . أثبتPoon وزملاؤه عام 2004 أن الأليل T في TaqI والأليل a في ApaI يترافقان مع الربو في مجموعة سكانية أمريكية (12). أظهر محمد كاظمي عرباباديي عام 2010 وجود ترافق بين التعدد الشكلي TaqI وليس ApaIمع مرض الربو في مجموعة سكانية إيرانية (2). أظهر Saadi وزملاؤه عام 2009 أن أليلاتApaI فقط تترافق مع الربو في مجموعة سكانية صينية (16). وبالتالي من الممكن للتعددات الشكلية ApaI، BsmI أن تكون مهمة في مرض الربو من خلال تأثيرها على التعبير عن VDR. من جهة ثانية أظهر Vollmert وزملاؤه عام 2004 أنه لا يوجد ترافق بين التعدد الشكلي FokI ومرض الربو في مجموعة سكانية ألمانية (19) وأخيراً أظهر Papadopoulou وزملاؤه عام 2015 أن التعدد الشكلي TaqI فقط يترافق مع مرض الربو في مجموعة سكانية قبرصية (13). يعود الاختلاف بين نتائجنا ونتائج الدراسات الأخرى إلى الاختلافات الجينية بين المجموعات السكانية المدروسة والعوامل البيئية. الاستنتاج تبين في هذا البحث وجود علاقة بين التعدد الشكلي BsmI لجين مستقبل الفيتامين D وبين الإصابة بمرض الربو لدى مجموعة من المرضى السوريين (P value = 0.01, OR: 2.44, 95% CI: 1.38 - 4.32)، بحيث يترافق الأليل B مع حدوث مرض الربو بينما يكون للأليل b دوراً وقائياً للمرض؛ في حين لم يترافق التعدد الشكلي ApaI مع مرض الربو (P value = 0.443, OR: 1.26, 95% CI: 0.69 - 2.31).   المراجع References  1-Alroy I; Towers T.L. and Freedman L.P. Transcriptional repression of the interleukin-2 gene by vitamin D3: direct inhibition of NFATp/AP-1 complex formation by a nuclear hormone receptor. Mol Cell Biol,15:5789–5799, 1995. 2-Arababadi M.K; Abousaidi Hv. and Hassanshahi G. Polymorphisms within Exon 9, But Not Intron 8, of the Vitamin D Receptor Gene Are Associated with Asthma. Iran J Basic Med Sci, 225-230, 2011. 3-Babina M; Krautheim M; Grützkau A. Human Leukemic (HMC-1) Mast Cells Are Responsive to 1[alpha],25-Dihydroxyvitamin D3: Selective Promotion of ICAM-3 Expression and Constitutive Presence of Vitamin D3 Receptor. Biochem Biophys Res Commun, 273(3): 1104-1110, 2000. 4-Baeke F; Korf H; Overbergh L. et al. Human T lymphocytes are direct targets of 1,25- dihydroxyvitamin D3 in the immune system. J Steroid Biochem Mol Biol,121(1-2): 221-227, 2010. 5-Boonstra A; Barrat F.J; Crain C; Heath V.L; Savelkoul H.F. and O'Garra A. 1alpha, 25-Dihydroxyvitamin d3 has a direct effect on naive CD4(+) T cells to enhance the development of Th2 cells. J Immunol, 167(9):4974-80, 2001. 6-Cookson W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature, 402: B5-11, 1999. 7-Holick M.F. Vitamin D. A millennium perspective. J Cell Biochem, 88:296-307, 2003. 8-Lemire J.M. Immunomodulatory actions of 1,25-dihydroxyvitamin D3. J Steroid Biochem Mol Biol, 53: 599-602, 1995. 9-Minghetti P.P; Gibbs P.E. and Norman A.W. Computer analysis of 1, 25-dihydroxyvitamin D3-receptor regulated promoters: identification of a candidate D3-response element. Biochem Biophys Res Commun,162(2):869-875, 1989. 10-Ogunkolade B.W; Boucher B.J; Prahl J.M, Bustin S.A; Burrin J.M; Noonan K. Vitamin D receptor (VDR) mRNA and VDR protein levels in relation to vitamin D status, insulin secretory capacity, and VDR genotype in Bangladeshi Asians. Diabetes, 51:2294-2300, 2002. 11-Overbergh L; Decallonne B; Waer M; Rutgeerts O; Valckx D. and Casteels K.M. 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 induces an autoantigen-specific T-helper 1/T-helper 2 immune shift in NOD mice immunized with GAD65 (p524-543). Diabetes, 49(8):1301-1307, 2000. 12-Poon A.H; Laprise C; Lemire M; Montpetit A; Sinnett D. and Schurr E. Association of vitamin D receptor genetic variants with susceptibility to asthma and atopy. Am J Respir Crit Care Med,170: 967-973, 2004. 13- Papadopoulou A; Kouis P; Middleton N; Kolokotroni O; Karpathios T. Association of vitamin D receptor gene polymorphisms and vitamin D levels with asthma and atopy in Cypriot adolescents. Multidisciplinary Respiratory Medicine, 0.1186/s40248-015-0025-0, 2015. 14-Raby B.A; Lazarus R; Silverman E.K; Lake S. and Lange C. Association of vitamin D receptor gene polymorphisms with childhood and adult asthma. Am J Respir Crit Care Med, 170:1057-1065, 2004. 15- Raby B.A; Silverman E.K; Lazarus R; Lange C; Kwiatkowski D.J. and Weiss S.T. Chromosome 12q harbors multiple genetic loci related to asthma and asthma-related phenotypes. Hum Mol Genet,12(16): 1973-1979, 2003. 16- Saadi A; Gao G; Li H; Wei C; Gong Y. and Liu Q. Association study between vitamin D receptor gene polymorphisms and asthma in the Chinese Han population: a case-control study. BMC Med Genet,10:71, 2009. 17- Sigmundsdottir H; Pan J; Debes G.F. DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to 'program' T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27. Nat Immunol, 8(3): 285-293, 2005. 18- Suneetha P.V; Sarin S.K; Goyal A; Kumar G.T; Shukla D.K; Hissar S. Association between vitamin D receptor, CCR5, TNF-alpha and TNF-beta gene polymorphisms and HBV infection and severity of liver disease. J Hepatol, 44:856-863, 2006. 19- Vollmert C; Illig T; Altmuller J; Klugbauer S; Loesgen S; Dumitrescu L. et al. Single nucleotide polymorphism screening and association analysis--exclusion of integrin beta 7 and vitamin D receptor (chromosome 12q) as candidate genes for asthma. Clin Exp Allergy,34:1841-1850, 2004 20- Zhang J; Pare P.D. and Sandford A.J. Recent advances in asthma genetics. Respir Res, 9(1):4, 2008.         المجلد 8 , العددان 1 و 2 , رمضان 1437 - تموز (يوليو) 2016 SCLA