بحث في أعداد المجلة الجملة   المؤلف

المجلد 8 , العددان 1 و 2 , رمضان 1437 - تموز (يوليو) 2016   أنماط منتسخات BCR-ABL لدى مرضى الابيضاض النقوي المزمن CML: مقارنة طريقة PCR محضرة مخبرياً مع عتيدة Multiplex PCR جاهزة BCR-ABL Transcript Types in Chronic Myelogenous Leukemia Patients: Comparison of a Home-Made PCR Method with a Multiplex PCR Kit د. سلاف فرحات مغربي1، أ. د. فوزة منعم1،2 Farhat-Maghribi S.1 and F Monem F.1,2 1كلية الصيدلة،,2مستشفى الأسد الجامعي، جامعة دمشق 1Faculty of Pharmacy, 2 Al-Assad Hospital, Damascus University الملخص Abstract توصي الإرشادات الحالية لمراقبة مرضى الابيضاض النقوي المزمن بكشف نمط منتسخ BCR-ABL الموجود عند التشخيص. وعلى الرغم من توفر عتائد تجارية لكشف أنماط منتسخات BCR-ABL، إلا أنها تفتقد لإمكان كشفها لمنتسخات معينة. وهذا ما دفعنا إلى استقصاء طريقة تفاعل PCR تقليدية محضرة مخبرياً home-made بالمقارنة مع عتيدة جاهزة لكشف هذه المنتسخات. جرى تعيين الشروط المثلى لطريقة PCR التقليدية المحضرة يدوياً على جميعة إيجابية باستخدام مزائج وتراكيز مختلفة من مشارع مختارة، وظروف متباينة من MgCl2 وحرارة التلدين. ومن ثم استخدمت، بالإضافة إلى عتيدة جاهزة تستخدم طريقة Multiplex PCR، لكشف أنماط منتسخات BCR-ABL في عينات 22 مريض ابيضاض نقوي مزمن. كشفت العتيدة الجاهزة 24 منتسخ BCR-ABL متواجدة بشكل مفرد أو مزدوج، ذي مناطق كسر في منطقتي M-bcr وm bcr، بينما كشفت الطريقة المحضرة مخبريا بعد أمثلتها 10 منتسخات فقط من هذه المنتسخات في عينات 22 مريضاً. تمكنت العتيدة الجاهزة من كشف أنماط منتسخات BCR-ABL الأكثر شيوعاً، بينما كانت طريقة PCR المحضرة مخبرياً، على الرغم من أمثلتها قاصرة في تعيين هوية المنتسخات المتوفرة جميعها. وعليه يبقى البحث مستمراً عن طريقة نوعية شاملة.   Current guidelines for monitoring CML patients recommend the detection of BCR-ABL transcript type at diagnosis. Kits for BCR-ABL transcript types detection are commercially available, however, they may lack the ability to detect certain transcripts. This has led us to investigate a more comprehensive home-made conventional PCR method in comparison with a kit. The home-made PCR method was optimized on a positive sample pool using different mixes and concentrations of the chosen primers, MgCl2 and annealing temperatures. It was then used, in conjunction with a kit, to detect BCR-ABL transcript types in 22 samples of CML patients. The kit detected 24 BCR-ABL transcripts present as single or dual transcripts containing breakpoints in either M-bcr or m-bcr regions, whereas the optimized home-made PCR method detected only 10 transcripts in the 22 patient samples. The kit was able to detect the most common BCR-ABL transcript types, while the home-made method, despite optimization, was unable to identify all available transcripts. Hence, the search for a specific comprehensive method continues.   المقدمة Introduction  صبغي فيلادلفيا (Ph) أول شذوذ صبغي نوعي ارتبط بخباثة، وتحديداً بالابيضاض النقوي المزمن. وهو ينجم عن حدوث إزفاء بين الصبغيين 9 و22، بحيث تتوضع مناطق الكسر breakpoints عليهما في جينَيّ ABL1 و BCR، على الترتيب، مؤديا إلى تشكل الجين المندمج BCR-ABL. ينتسخ هذا الجين الورمي إلى رنا مرسال messenger RNA (mRNA) يُترجم إلى بروتين تيروزين كيناز هيولي غير خاضع للتنظيم، والذي يعتقد بأنه المحرض لحدوث الابيضاض النقوي المزمن. بناء على ذلك صممت الأدوية المثبطة للتيروزين كينازtyrosine kinase inhibitors (TKIs) لتستهدف هذا البروتين بشكل انتقائي، مما أدى إلى ارتفاع معدل الهدأة وتحسن زمن البقيا لدى المرضى (1، 2). جرى تحديد مناطق الكسر الحادثة على الجين ABL1 ضمن الإكسون الثاني a2، وعلى الجين BCR ضمن ثلاث مناطق أساسية سميت: major BCR (M-bcr) تشمل الإكسونات e13 وe14 وminor BCR (m-bcr) تشمل الإكسونات e1 وe2 وmicro BCR (µ-bcr) تشمل الإكسون e19 [3]. يحدث الكسر لدى معظم مرضى الابيضاض النقوي المزمن في المنطقة M-bcr لتتشكل منتسخات BCR-ABL يرمز لها e13a2 وe14a2 (1)، مع العلم بأنه جرى الكشف عن منتسخات نادرة تتضمن نقاط كسر في إكسونات أخرى غير تلك المذكورة (3-5). إن اختلاف مناطق الكسر الحاصلة على جينات الجين المندمج سيؤدي إلى اختلاف بنية منتسخات BCR-ABL mRNA، وبالتالي إلى اختلاف بنية البروتين الناتج، وإلى احتمال اختلاف الاستجابة للمعالجة الموجهة (6، 7). لا زالت بروتوكولات المراقبة لمرضى الابيضاض النقوي المزمن تعتمد على طريقة الانتساخ العكسي الكمي لتفاعل البوليميراز التسلسلي المتعدد quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) للتحديد الكمي فقط لمنتسخات BCR-ABL، بغض النظر عن نمطها، على الرغم من أن الارشادات الحديثة (8) توصي بإجراء تفاعل PCR لكشف نمط المنتسخ الموجود لدى مريض الابيضاض النقوي المزمن عند التشخيص، بعد التأكد من إيجابية صبغي فيلادلفيا بوساطة اختبارات الوراثة الخلوية. تأتي هذه التوصية لتغطية احتمال وجود إحدى المنتسخات التي قد لا تشملها اختبارات المراقبة الروتينية qRT-PCR مما يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة أثناء مرحلة مراقبة العلاج. على الرغم من توفر عتائد جاهزة للكشف عن أنماط منتسخات BCR-ABL لكنها عتائد معدة للبحث العلمي، وذات كلفة عالية، ومن المحتمل أن تكون غير قادرة على الكشف الشامل لجميع أنماط المنتسخات النادرة أو غير المعروفة مسبقاً. هذا ما دفعنا إلى البحث عن طريقة تعتمد على استخدام تفاعل PCR (محضر مخبرياً home-made) واختبارها بمكونات غير متضمنة في عتيدة لكشف أنماط منتسخات BCR-ABL، ومقارنة نتائجها بنتائج عتيدة جاهزة.   المواد والطرق Materials and Methods  الاعتيان Sampling جرى انتقاء عينات الدراسة من مختبر مستشفى الأسد الجامعي بدمشق في الفترة من كانون الثاني 2012 وحتى تشرين الثاني 2014 والعائدة لمرضى الابيضاض النقوي المزمن المراجعين بهدف إجراء تحاليل مراقبة روتينية بطريقة qRT-PCR، بعد كشف صبغي فيلادلفيا لديهم عند التشخيص الأولي. استخدمت في دراستنا 48 عينة cDNA لمرضى أبدوا إيجابية لمنتسخات BCR-ABL باستخدام تفاعل qRT-PCR، جرى الحصول عليها من مختبر البيولوجيا الجزيئية في مستشفى الأسد الجامعي بدمشق بعد الحصول على موافقة المرضى المستنيرة. جرى اختيار 26/48 عينة عشوائياً لتشكيل جميعة sample pool، اختبرت باستخدام تفاعل qRT-PCR، لتوظيفها كشاهد إيجابي لمنتسخات BCR-ABL عند أمثلة optimization تفاعل PCR موضوع دراستنا. أُخضعت بقية العينات (22/48) إلى تحري نمط منتسخات BCR-ABL بطريقتي العتيدة الجاهزة والتفاعل المحضر مخبرياً بعد أمثلته، بعد قياس تركيز ونقاوة الـ DNA فيها باستخدام جهاز مقياس الطيف الضوئي للأحماض النووية (NanoDrop ND 1000 Spectrophotometer صنع شركة NanoDrop Technologies Inc., USA) على الأطوال الموجية 260 و280 نانومتر. تحديد أنماط منتسخات BCR-ABL في عينات الدراسة باستخدام عتيدة جاهزة استخدمت عتيدة Seeplex® Leukemia BCR/ABL research kit صنع شركة Seegene الكورية Korea التي تعمل بمبدأ التضاعف الشائع conventional multiplex PCR حسب تعليمات الشركة الصانعة، باستخدام جهاز الدوار الحراري MasterCycler® Pro S صنع شركة Eppendorf الألمانية Germany. أمثلة optimization تفاعل PCR محضر مخبرياً لتحديد أنماط منتسخات BCR-ABL استخدمت أربعة مشارع (ثلاثة منها بالتقدم forward primer وواحد بالعكس reverse primer)، جرى الحصول على تسلسلاتها من الأدبيات الطبية (9-12) (الجدول 1). بعد التحقق من اصطفاف المشارع مع تسلسل جيني BCR وABL، باستخدام قاعدة بيانات NCBI nucleotide BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) جرى الحصول على المشارع من شركة TIB MOLBIOL الألمانية Germany. اختبرت المشارع في تفاعلات الأمثلة في مجموعات مختلفة (الجدول2)، حيث طُبق تفاعل multiplex PCR بإضافة المشارع الأربعة ABL-a2/M-BCR/m-BCR/µ-BCR في التجربة I. واستخدم المشرعانABL-a2/M-BCR في التجربة II، والمشرعان ABL-a2/m-BCR في التجربة III، والمشرعان ABL-a2/µ-BCR في التجربة IV في تفاعلات PCR منفصلة. التجربة I: لانتقاء التركيز الأمثل للمشارع استخدمت التراكيز 0.5 و1 مكرومول من كل من المشارع الأربعة (ABL-a2/M-BCR/m-BCR/µ-BCR) في مزيج التفاعل المؤلف من الشاهد الإيجابي (الجميعة) (5 مكل) وMgCl2 (4 ميلي مول) وdNTPs (200 مكرومول) وإنزيم البوليميراز DNA Polymerase (1.25 وحدة) AmpliTaq® Gold (Applied Biosystems, USA) ليكمل إلى حجم نهائي 50 مكل. استخدم الدوار الحراري MasterCycler® Pro S (Eppendorf, Germany) باعتماد HotStart لمدة 5 دقائق بدرجة حرارة 95°C، وتثبيت كل من درجة حرارة التمسخ والتمدد عند 95°C لمدة 15 ثانية و72°C لمدة دقيقتين و30 ثانية على الترتيب، مع تبديل درجة حرارة التلدين لكل تركيز من المشارع على حدة (50°C، 55°C،56°C، 58°C أو60°C) لمدة 15 ثانية لكل تفاعل تضخيم. وبعد انتهاء 45 دورة أُجريت عملية تمدد elognation نهائية بدرجة حرارة 72°م لمدة 7 دقائق. التجربة II: المرحلة الأولى: جرى استخدام المشرعين ABL-a2/M-BCR بتراكيز 0.1، 0.25، 0.5، و1 مكرومول من كل مشرع بالشروط المستخدمة في التجربة I واستخدام درجة حرارة 50°C للتلدين. المرحلة الثانية: استخدمت تراكيز 1، 2، 3 و4 ميلي مول من MgCl2، وذلك بعد اعتماد تركيز لكل من المشرعين بالشروط المستخدمة في المرحلة الأولى. المرحلة الثالثة: بعد اعتماد تراكيز كل من المشرعين وMgCl2 جرى اختبار خمس درجات حرارة تلدين هي 50°C، 55°C، 56°C، 58°C و60°C لمدة 15 ثانية، بالشروط المستخدمة في المرحلة الأولى. التجارب III وIV: جرى تبني الشروط المثلى للتجربة II والمبينة لاحقاً في قسم النتائج في إجراء هذين الاختبارين، ولكن باستخدام المشرعين ABL-a2/m-BCR في التجربة III والمشرعين ABL-a2/µ-BCR في التجربة IV. تحديد أنماط منتسخات BCR-ABL في عينات الدراسة أُجري تفاعل PCR بتطبيق الشروط المثلى المعتمدة وجرى ترحيل النواتج النهائية للتفاعل على هلامة أغاروز ذات تركيز 2.5% ملونة بـ ethidium bromide لتحديد أنماط منتسخاتBCR-ABL الموجودة في 22 عينة cDNA المتضمنة في الدراسة.   النتائج Results  تحديد أنماط منتسخات BCR-ABL في عينات الدراسة باستخدام عتيدة جاهزة أظهرت 17 من أصل 22 عينة عصابة فردية معبرة عن منتسخ BCR-ABL ذي نقطة كسر في منطقة M-bcr (الشكل 1)، وأظهرت 2\22 عينة عصابتين تمثلان منتسخي BCR-ABL، يملك كل منهما نقطة كسر في منطقة M-bcr. كما أظهرت واحدة من 22 عينة عصابة فردية معبرة عن منتسخ BCR-ABL ذي نقطة كسر في منطقة m-bcr. وأظهرت عينة واحدة عصابتين تمثلان منتسخي BCR-ABL، يملك أحدهما نقطة كسر في منطقة M-bcr والآخر في منطقة m-bcr. وبهذا بلغ عدد منتسخات BCR-ABL 24 منتسخاً لدى 21 مريضاً، حيث ظهر منتسخ مفرد لدى 18 مريضاً ومنتسخان اثنين لدى كل من المرضى الثلاثة المتبقين، بينما فشل تفاعل PCR في تضخيم عينة مريض واحد فقط، حيث لم تظهر أي عصابة بعد إجراء عملية الرحلان (الجدول 3). أمثلة optimization تفاعل PCR المحضر مخبرياً التجربة I: بينت نتائج تفاعلات الـ PCR العشرة (باستخدام تركيزين من المشارع وخمس درجات تلدين مختلفة لكل تركيز) المجراة خلال التجربة I (multiplex PCR) غياب العصابات الدالة على تضخيم منتسخات BCR-ABL، وظهور عصابات تشير إلى مثنويات المشارع primer-dimers. التجربة II: أظهرت نتائج 13 من تفاعلات الـ PCR (باستخدام أربعة تراكيز للمشارع، متبوعة بأربعة تراكيز لـ MgCl2، ومن ثم خمس درجات حرارة تلدين مختلفة) المجراة خلال التجربة II أن تركيز 0.25 مكرومول من كل من المشرعين ABL-a2/M-BCR وتركيز 4 ميلي مول من MgCl2، ودرجة حرارة 55°C لعملية تلدين المشارع، كانت ظروف مثلى لهذه التجربة، على الرغم من أن العصابات الناتجة كانت باهتة، مع وجود عصابات تمثل مثنويات المشارع (الشكل 2). التجارب III وIV: بينت نتائج التفاعلين المجريين خلال التجربتين III وIV عند استخدام ثنائيات المشارع وABL-a2/m-BCR و ABL-a2/µ-BCR، على الترتيب، غياب العصابات الدالة على تضخيم منتسخات BCR-ABL، وظهور عصابات تشير إلى مثنويات المشارع primer-dimers. تحديد أنماط منتسخات BCR-ABL في عينات الدراسة باستخدام تفاعل PCR الأمثل أظهرت كل من 10/22 عينة من العينات المدروسة عصابة فردية باهتة معبرة عن منتسخ BCR-ABL ذي نقطة كسر في منطقة M-bcr. أوضحت النتائج أن تفاعل PCR الأمثل وطريقة العتيدة الجاهزة قد كشفا 10 و24 منتسخاً على الترتيب في 22 عينة مدروسة، وبهذا بلغت نسبة المنتسخات غير المكشوفة بتفاعل PCR الأمثل 58% من تلك التي كشفتها العتيدة الجاهزة.   المناقشة Discussion  توافقت نتائج العتيدة الجاهزة مع النتائج المتبناة لاختبارات qRT-PCR من حيث إيجابية العينات لمنتسخات BCR ABL، في ما عدا عينة واحدة فقط من أصل 22 عينة إيجابية، أبدت سلبية كاذبة. لقد أعاق تقصي أسباب هذه السلبية الكاذبة بتكرار اختبار هذه العينة عدم وجود كمية كافية منها. كما أظهرت العتيدة قدرة على التمييز بين أنماط المنتسخات في العينات المختلفة intra-samples وضمن العينة نفسها inter-sample variations مما يرجح إمكان ترشيحها للاستخدام الروتيني. ومما يجدر ذكره، بأن دراستنا هي الأولى، على حسب علمنا، التي استخدمت هذه العتيدة لتحديد أنماط منتسخات BCR-ABL لدى مجموعة من المرضى. في حين أنها استخدمت سابقاً لمرة واحدة في "تقرير حالة case report" (13). مع العلم بأن هذه العتيدة يمكنها الكشف عن ثمانية أنماط فقط من المنتسخات الشائعة والنادرة (b2a2, b3a2, b3a2, b2a3, b1a1, e1a1, e1a3, c3a2)، تبعاً للتعليمات المرفقة من قبل الشركة الصانعة، وفي حال وجود نمط آخر فإنها قد لا تتمكن من كشفه. وتبين أن أنماط المنتسخات تبعا لنقطة الكسر في جين BCR المكتشفة لدى مرضى دراستنا متوافقة مع الأنماط الأكثر شيوعاً من منتسخات BCR-ABL لدى مرضى الابيضاض النقوي المزمن المذكورة في الدراسات والإحصائيات العالمية (10-12، 14-17). إن تموضع الكسر في منطقة M-bcr لدى أغلب مرضى الابيضاض النقوي المزمن المدروسين في أنحاء مختلفة من العالم لم يوحِ بأي ارتباط بين موقع الكسر وأية عوامل جينية أو إثنية أو جغرافية. بينت النتائج، بعد أمثلة طريقة PCR المحضرة مخبرياً، بأن استخدام كل من المشرعين ABL-a2/M-BCR (التجربة II) بتركيز 0.25 مكرو مول بوجود 4 ميلي مول MgCl2 وباستخدام حرارة تلدين 55°C مكّن من تضخيم منتسخات BCR-ABL، ولكنها أعطت عصابات باهتة بعد إجراء الرحلان عليها، بينما أظهرت النتائج فشل جميع التجارب الأخرى (التجارب I، III وIV). يمكن أن يعزى ذلك إلى حدوث استنفاد للمشارع من وسط التفاعل، نتيجة تشكل مثنويات المشارع، وظهور العصابات الدالة عليها عند ترحيل نواتج هذه التفاعلات على هلامة الأغاروز (الشكل 2)، مع استبعاد حصول عدم توافق mismatch باستخدام مشارع وعينات مختلفة. على الرغم من توافق نتائج طريقة PCR المثلى مع نتائج العتيدة الجاهزة من حيث أنماط المنتسخات المكتشفة لدى المرضى العشرة الذين استطاعت الطريقة المحضرة مخبرياً كشفها لديهم، لكنها فشلت في كشف 14/24 منتسخا (58%) من تلك التي كشفتها العتيدة الجاهزة. جرى اختيار المشارع من دراسات سابقة (10-12) تعرضت لتحديد أنماط منتسخات BCR-ABL في عينات مرضية، دون التنويه عن أمثلة الطرق المتبعة أو عن أي فشل عند إجرائها أو في نتائجها. وعلى الرغم من التحقق من اصطفافها التام افتراضياً، وكون عدد النوكليوتيدات فيها مناسباً للتسلسلات المستهدفة، والمجال الواسع من التراكيز المجربة من هذه المشارع، فإن هذه الطريقة لم تبدِ تجريبياً empirically قدرة معتبرة على كشف منتسخات BCR-ABL تكفي لتؤهلها للاستخدام الروتيني. ونقترح استخدام مشارع مختلفة، أو تصميم مشارع جديدة مناسبة للتسلسل المستهدف، لمحاولة أمثلة طريقة PCR محضرة مخبرياً أكثر كفاءة وأفضل تكرارية. الاستنتاجات تمكنت العتيدة الجاهزة من كشف منتسخات BCR-ABL الأكثر تواتراً عالمياً، بينما كانت طريقة PCR المحضرة مخبرياً رغم أمثلتها قاصرة في كشف وتحديد أنماط هذه المنتسخات، وعليه يبقى البحث عن طريقة نوعية شاملة قائماً.   المراجع References  1. Bhatia R. Chronic myeloid leukemia. In: Hoffman R, Benz EJJ, Silberstein LE, Heslop H, Weitz J, Anastasi J, editors. Hematology: basic principles and practice. Philadelphia: Saunders; 2013. p. 981-997. 2. Najfeld V. Conventional and molecular cytogenetic basis of hematologic malignancies. In: Hoffman R, Benz EJJ, Silberstein LE, Heslop H, Weitz J, Anastasi J, editors. Hematology: basic principles and practice. Philadelphia: Saunders; 2013. p. 728-780. 3. Melo JV. The diversity of BCR-ABL fusion proteins and their relationship to leukemia phenotype. Blood. 1996; 88(7): 2375-2384. 4. Oshikawa G. et al. Clonal evolution with double Ph followed by tetraploidy in imatinib-treated chronic myeloid leukemia with e19a2 transcript in transformation. Cancer Genetics and Cytogenetics. 2010; 199(1): 56-61. 5. Park IJ. et al. A case of chronic myelogenous leukemia with e8a2 fusion transcript. Cancer Genetics and Cytogenetics. 2008; 185(2): 106-108. 6. Advani AS. and Pendergast AM. Bcr–Abl variants: biological and clinical aspects. Leuk Res. 2002; 26(8): 713–720. 7. Liesveld JL. and Lichtman MA. Chronic myelogenous leukemia and related disorders. In: Kaushansky K, Lichtman MA, Beutler E, Kipps TJ, Seligsohn U, Prchal JT, editors. Williams Hematology. New York City: McGraw-Hill; 2010. p. 1331-1380. 8. Baccarani M. et al. European Leukemia Net recommendations for the management of chronic myeloid leukemia. Blood. 2013; 122(6): 872-884. 9. Cross NP. Detection of BCR-ABL in hematological malignancies by RT-PCR. In: Cotter F, editor. Molecular Diagnosis of Cancer. Methods in Molecular Medicine™: Humana Press; 1996. p. 25-36. 10. Anand MS. et al. Cytogenetic & molecular analyses in adult chronic myelogenous leukaemia patients in north India. Indian J Med Res. 2012; 135: 42-48. 11. Yaghmaie M. et al. Frequency of BCR-ABL fusion transcripts in Iranian patients with chronic myeloid leukemia. Arch Iran Med. 2008; 11(3): 247-251. 12. Irshad S, Butt MA and Joyia A. Frequency of different Bcr-abl Fusion Transcripts in CML Patients in Pakistan. International Journal for Agro Veterinary and Medical Sciences. 2012; 6(6): 418-423. 13. Kim J. et al.. BCR/ABL rearrangement with b3a3 fusion transcript in a case of childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer Genet Cytogenet. 2009; 189(2): 132-137. 14. Iqbal Z. et al. Frequency of Bcr-Abl fusion oncogene splice variants associated with chronic myeloid leukemia (CML). Journal of Cancer Therapy. 2011; 2: 176-180. 15. Goh HG. et al. Comprehensive analysis of BCR-ABL transcript types in Korean CML patients using a newly developed multiplex RT-PCR. Transl Res. 2006; 148(5): 249-256. 16. Mondal BC. et al. Molecular profiling of chronic myeloid leukemia in eastern India. Am J Hematol. 2006; 81(11): 845-849. 17. Paz-y-Miño C. et al. BCR-ABL rearrangement frequencies in chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia in Ecuador, South America. Cancer Genet Cytogenet. 2002; 132(1): 65-67.         المجلد 8 , العددان 1 و 2 , رمضان 1437 - تموز (يوليو) 2016 SCLA