بحث في أعداد المجلة الجملة   المؤلف

المجلد 8 , العددان 1 و 2 , رمضان 1437 - تموز (يوليو) 2016   الكشف عن خفيات الأبواغ لدى الأطفال في دمشق وتنميطها جينياً باستخدام تحليل PCR-RFLP Detection and Genotyping of Cryptosporidium spp in Children of Damascus by PCR-RFLP Analysis د. مرشد كاسوحة وأ. د. عبد الكريم الخالد Morshed Kassouha and Abdulkarim Alkhaled قسم الأحياء الدقيقة - كلية الطب البيطري - جامعة حماة - سورية Department of Microbiology - Faculty of Veterinary Medicine - Hama University, Syria الملخص Abstract جرى في هذا البحث جمع 199 عينة من براز أطفال دون الخامسة من العمر مصابين بالإسهال، وذلك من بعض مستشفيات مدينة دمشق ومختبراتها الخاصة. استخدمت صبغة تسيل نيلسون المعدلة للكشف عن وجود البيوض المتكيسة لخفيات الأبواغ في اللطاخات مباشرة أو بعد تطبيق طريقة الفورمول-إيتر التركيزية، فكانت النتائج متطابقة بين الطريقتين، حيث أثبت وجود البيوض المتكيسة في سبع عينات أي بنسبة 3.5%. ست عيناتٍ من العينات السبع الإيجابية طبق عليها اختبار تفاعل البوليميراز التسلسلي المعشش، الذي أتبع بتحليل تعدد أشكال الشدف المقيدة الطول RFLP، وكانت خفية الأبواغ الصغيرة النوع الوحيد الذي وجد. تعد هذه الدراسة الأولى في سورية التي اعتمدت تحليل PCR-RFLP في استعراف أنواع خفية الأبواغ، والذي أكد وجود خفية الأبواغ الصغيرة.   In this research, 199 stool samples were collected from under 5 years old children affected with diarrhea, from some hospitals and private laboratories of Damascus city. Modified Zeihl-Neelsen was used for detection of cryptosporidium oocytes in direct smear or after Formol-Ether concentration method, and the result was completely the same that the oocytes were confirmed in 7 samples with percentage 3.5%. Nested-PCR test was performed on 6 positive samples out of 7, and had been followed by RFLP analysis, and Cryptosporidium parvum was the only species which found. This study is the first in Syria which depended on RFLP analysis in identifying cryptosporidium species, and its result confirmed presence of Cryptosporidium parvum .   المقدمة Introduction  تعد خفية الأبواغ إحدى الطفيليات الأوالي protozoa الهامة ذات الانتشار العالمي والتي تتبع شعبة معقدات القمة Apicomplexa وصنف البوائغ sporozoa (Abu samra, 2013). وهي تصيب طيفاً واسعاً من الأثوياء hosts تشمل الثديات والطيور والزواحف والأسماك. وتشكل الخلايا الظهارية بشكل عام، والظهارية المعوية خاصة الهدف الأساسي لهذه الطفيليات (Smith et al., 2007). تبدو خفية الأبواغ أثناء تكاثرها وكأنها ملتصقة سطحياً على الخلايا الظهارية المصابة، إلا أنها فعلياً تتطور داخل فجوة تسمى بالفجوة الحاملة للطفيلي parasitophores vacuole داخل الخلية وتحت الغشاء الخلوي cell membrane ولكن في الوقت نفسه خارج هيولى الخلية المضيفة extracytoplasmic (Fayer et al. 1997). أيضاً تتراوح أعراض الإصابة لدى الأشخاص البالغين والأسوياء مناعياً immunocompetent بين الإصابة اللاعرضية والاضطرابات الهضمية والمعوية مع إسهالٍ غالباً ما يكون مائياً، ويتميز هذا المرض بأنه مرضٌ محددٌ ذاتياً selflimited disease، إذ تزول الأعراض بعد 6-9 أيام من ظهورها. وتكون الأعراض أشد وأوضح عند الأطفال دون الخمسة أعوام، مما يعطيه أهمية كمسبب أساسي للإسهال لدى هذه الفئة العمرية. أما عند الاشخاص ناقصي المناعة immune-compromised أو مرضى الإيدز فإنه يعد مرضاً مهدداً للحياة، حيث يتسبب بحدوث إسهال مزمن صعب العلاج (Hunter et al. 2007). اتفقت المراجع الحديثة على أن هنالك خمسة أنواع من خفيات الأبواغ هي الأكثر أهمية لدى الإنسان والتي تسبب معظم الحالات المرضية وهي خفية الأبواغ البشرية Cryptosporidium hominis، وخفية الأبواغ الصغيرة Cryptosporidium parvum، وخفية الأبواغ الرومية C. meleagridis، وخفية الأبواغ القطية C. felis، وخفية الأبواغ الكلبية C. canis، (Xiao, 2010; Xiao and Fayer, 2008). كما تعد خفية الأبواغ الصغيرة وخفية الأبواغ البشرية مسؤولتين عن أكثر من 90% من الإصابات المسجلة لدى الإنسان عالمياً، وبنسب متقاربة بين النوعين السابقين وقد تختلف قليلاً في بعض الدراسات (Leoni et al. 2006; Helmy et al. 2013; Abu samra, 2013). تكتسب الإصابة بخفيات الأبواغ أهميةً بالغةً بسبب تنوع مصادر العدوى والتي من الممكن أن تكون بشرية أو حيوانية. ولأن هذا الداء هو مرضٌ مشتركٌ بين الإنسان والحيوان وخاصة خفية الأبواغ الصغيرة C. parvum التي تصيب الكثير من الثديات وأهمها العجول الرضيعة والأغنام والقوارض المختلفة، فإن انتشار الطور الخامج لهذا الطفيلي وهو البيوض المتكيسة oocytes يكون واسعاً في البيئة، إذ تسهم الحيوانات كما الإنسان في ذلك. وتكون الإصابة بالخمج عادة عن طريق تناول الطعام أو الماء الملوثين بالبيوض المتكيسة oocytes لهذا الطفيلي (Xiao, 2010). توجد العديد من الطرق المستخدمة بهدف تشخيص خفيات الأبواغ في براز الإنسان أو الحيوان المصاب، ومازالت معظم المخابر تعتمد على الصبغات الصامدة للحمض acid fast stains في هذا المجال، ولعل أهمها صبغة تسيل نيلسون المعدلة وتسمى أحياناً بصيغة كينيون Kinyoun's stain، والتي من الممكن أن تُطبق بعد إنجاز إحدى الطرق التركيزية بهدف زيادة الحساسية، كطريقة الفورمول- إيتر. كما وتستخدم العديد من الصبغات التألقية أو الاختبارات المناعية للغرض نفسه، وازداد التركيز، في السنوات الأخيرة، على الاختبارات السريعة المعتمدة على مبدأ الاستشراب المناعي Immuno-chromatographia والتي توفر الجهد والوقت (Current, 1990; Xiao, 2010; Helmy et al., 2013 )، إلا أن كل الطرق السابقة لا تستطيع تحديد نوع خفية الأبواغ بعد تشخيص الإصابة، ويعد إجراء تفاعل البوليميراز التسلسلي المعشش nested-PCR الذي يستهدف التسلسل المسؤول عن الـ RNA الريبوزومي في الوحدة الصغيرة SSU rRNA، المتبوع بتحليل RFLP، الأمر الأساس في تحديد أنواع خفية الأبواغ وذلك وفق العديد من المصادر العلمية الحديثة (Xiao et al. 1999; Feng et al., 2007; Helmy et al. 2013). أُنجزت في سورية العديد من الدراسات التي أكدت وجود طفيلي خفية الأبواغ لدى الإنسان (الأديب، 1999; الكسار، 1999) و (Ismail, 1995)، وكذلك لدى الحيوان (قطرنجي، 1997)، ولكن جميعها لم تحدد نوع خفية الأبواغ المشاهدة واقتصرت على تحديد وجود الطفيلي، الأمر الذي جعل البدء في عمل يستهدف تحديد أنواع الطفيلي لدى الإنسان والحيوان بالطرق الجزيئية ضرورة تمهد الطريق لأبحاث قادمة تسهم في تحديد وفهم طرق انتشار المرض وانتقاله للإنسان في سورية.   المواد والطرق Material and Methods  جرى جمع 199 عينة براز لأطفال دون عمرالخامسة ومصابين بالإسهال. وذلك من مستشفيات مدينة دمشق وبعض المختبرات الخاصة، وأضيف إلى كل عينة كمية مماثلة من الفورمالين 10% وحفظت في الدرجة C4 إلى حين فحصها. غُسلت العينات من الفورمالين قبل فحصها وذلك بأخذ 1 ml من المعلق بعد المزج الجيد وإضافة 5 ml ماء مقطر ثم نُبذت بقوة 1000gX لمدة 10 دقائق، بعدها تم التخلص من السائل الطافي supernatant، وأعيدت العملية السابقة ثلاث مرات بهدف التخلص من آثار الفورمالين قدر الإمكان. أخذ بعدها حوالي 50 µl من الراسب وفُرش على شريحة زجاجية واستخدمت صبغة تسيل نيلسون المعدلة في الصباغة وصبغة أزرق الميتيلين كصبغة مباينة (مقابلة) counter stain، حيث تظهر البيوض المتكيسة تحت المجهر في الحالات الإيجابية دائرية إلى بيضية الشكل حمراء وردية وبأبعاد تقريبية 4-6 µm ضمن محيط أزرق اللون (Goldman and green, 2009). طبقت طريقة الفورمول-إيتر التركيزية Formol-Ether concentration method على 83 عينة، بهدف تأكيد النتيجة السلبية وتقييم طريقة اللطخة المباشرة، حيث يجري من خلال هذه الطريقة التخلص من الكثير من الشوائب والمواد الدهنية الموجودة في عينة البراز لتكثيف البيوض المتكيسة لخفية الأبواغ وحتى بيوض الديدان الممسودة والشريطيات والجراثيم في الراسب الذي يوضع بكامله على شريحة زجاجية ويصبغ بصبغة تسيل نيلسون المعدلة ويفحص تحت المجهر (Smith, 2008). أستُخلص DNA الطفيلي من عينات الإسهال ومن دون تنقية اعتماداً على عتيدة تجارية (NucleoSpin® Tissue kit(Macherey-Nagel, Germany)، وفي نهاية الاستخلاص جرى الحصول على كامل الـ DNA الذي يمكن أن يوجد في عينات البراز، وحفظ في الدرجة -20C إلى حين إجراء اختبار تفاعل البوليميراز التسلسلي. أجري تفاعل البوليميراز التسلسلي المعشش nested-PCR باستخدام زوجين من المرئسات النوعية (مَشارع) primers الخاصة بتسلسل الـ DNA المسؤول عن SSU rRNA (الرنا الريباسي الموجود في الوحيدة الصغيرة) وفق ما ورد في الكثير من أهم الأبحاث العلمية ذات الصلة (نذكر منها Xiao et al. 1999; Helmy et al. 2013)). وتسلسل المرئسات المستخدمة في التفاعل الأولي primary PCR هو: XF1 (-5-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3-) و XR1 (-5-CCCATTTCCTTCGAAACAGGA-3-) حيث تكون مزيج التفاعل الأولي (50 µl) والذي يستهدف تضخيم قطعة بطول 1325 bp من ما يلي: 5 µl من مستخلص الـ DNA، 1 µl pmol/µl 10)) لكل من تسلسلي المرئستين، 1 µl (10 mM) قواعد آزوتية dNTPs، 5 µl (10x) دارئة الاختبار PCR Buffer، 4 µl (25mM) كلوريد المغنيزيوم، 0.25 µl (5U/µl) إنزيم Taq DNA Polymerase (Thermo,(EU)] [Lithuania، وجرى إكمال المزيج بماء مقطر معقم خالٍ من إنزيم الدناز حتى 50 µl. وجرى التضخيم في جهاز المدور الحراري Thermal Cycler وفق البرنامج التالي: مرحلة التمسخ الأولي Initial Denaturation 94°م 2 دقيقة دورة واحدة // دورات التضخيم وعددها 35 على الشكل التالي: 94°C 30 ثانية، 55°C 30 ثانية، 72°C 1 دقيقة// مرحلة الاستطالة النهائية Final extension 72°C 7 دقائق دورة واحدة. واستخدمت مرئسات أخرى للتفاعل الثاني المعشش secondary PCR بهدف تضخيم قطعة بطول  835 bp: XF2 (-5-GGAAGGGTTGTATTTATTAG ATAAAG-3-) و XR2 (-5-AAGGAGTAAGGAACAACCT CCA-3-) وبمزيج وبرنامج تضخيم مماثل لما ورد آنفاً. وجرى الكشف عن نواتج التفاعل بالرحلان الكهربائي في هلامة الأغاروز (تركيز 1.5%) وفحصها على جهاز توثيق الهلامة، لتحري وجود عصابات الـ DNA المطلوبة. بعد التأكد من وجود عصابة الـ DNA المطلوب بطول  835 bp أنجز تحليل تعدد أشكال الشدف المقيدة الطول (RFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism على نواتج تفاعل البوليميراز التسلسلي الثاني المعشش باستخدام إنزيمي تقييد هما (Ssp I, Vsp I,) ]من شركة [Thermo,(EU) Lithuania، حيث وضع في أنبوب ايبندورف معقم 10 µl من نواتج تفاعل البوليميراز التسلسلي الثانوي (كل إنزيم في أنبوب مستقل) مع 18 µl ماء معقم خال من إنزيم الدناز وكذلك 2 µl من الدرائة الخاصة بكل إنزيم وأُنجز اختبار nested-PCR على 6 عينات من وأُضيف 0.5 µl من الإنزيم وجرى تحضين المزيج لمدة ساعة ونصف في محم مائي بدرجة 37°C، جرى بعدها الكشف عن نواتج التقطيع بالرحلان الكهربائي في هلامة الأغاروز (تركيز 2%)، وفحصها على جهاز توثيق الهلامة بالأشعة فوق البنفسجية، وجرى تحديد نوع خفية الأبواغ المشخصة وفق عدد وأطوال القطع الناتجة (الجدول 1).   النتائج Results  بينت نتيجة صباغة العينات بصبغة تسيل نيلسون المعدلة وجود طفيلي خفية الأبواغ في براز 7 أطفال مصابين بالإسهال من أصل 199 من العينات التي جرى فحصها (الشكل 1) أي بنسبة 3.5%. ولقد تطابقت نتائج طريقة الفورمورل-إيتر التركيزية مع نتائج اللطخة المباشرة المصبوغة بتسيل نيلسون المعدلة وذلك ضمن العينات الـ 83 الذي طبقت عليها كلتا الطريقتين، وجميع العينات التي كانت سلبية نتيجة الفحص بطريقة اللطخة المباشرة المصبوغة كانت سلبية بعد إنجاز طريقة الفورمول- إيتر، لكن لوحظ ازدياد أعداد البيوض المتكيسة الملاحظة في الشرائح المحضرة من العينات الإيجابية بعد القيام بالطريقة التركيزية. الـ 7 عينات الإيجابية، وأعطت جميعها نتائج مطابقة للنتائج السابقة، إذ ظهرت عصابات الـ DNA بطول 1325 bp بعد التفاعل الأولي وبطول  835 bp بعد التفاعل الثانوي (الشكل 2). وكان نوع خفية الأبواغ الصغيرة C. parvum هو النوع الوحيد المشخص في العينات الستة وفق تحليل RFLP، بعد استخدام اثنين من إنزيمات التقييد هما (Ssp I, Vsp I) (الشكل 2) وذلك بالمطابقة مع ما ورد في الجدول السابق، حيث يُعد التقطيع بإنزيم ((Vsp I النقطة الفارقة في هذا المجال.     المناقشة Discussion  جرى في هذا العمل ولأول مرة في سورية تأكيد الإصابة بخفية الأبواغ لدى الإنسان باستخدام الطرق الجزيئية، ويعد تحليل RFLP النقطة الفارقة في هذه الدراسة، حيث اعتمد عليها في تحديد الأنواع بعد تشخيص الإصابة اعتماداً على الصباغة بملون تسيل نيلسون المعدل. وتعد نسبة الإصابة المسجلة نتيجة صبغة تسيل نيلسون المعدلة والتي كانت 3.5% قريبة من تلك المسجلة في كثير من الدراسات والتي تراوحت بين 0 و5%، واختلفت أيضاً عما سجلته دراسات أخرى كانت النسب لديها أعلى من النسبة المسجلة في هذا العمل والتي كان معظمها في دول أفريقية أو آسوية نامية يتميز مناخها بارتفاع درجات الحرارة عموماً (Caccio and Putignani, 2014; Abu samra, 2013)، كما اختلفت مع النسبة المسجلة في سورية (الكسار، 1999) منذ 16 عاماً والتي بلغت 24.9%، الأمر الذي قد يعزى إلى تحسن نظام الصرف الصحي عموماً، وإلى أمور أخرى قد ترجع إلى تضاؤل تربية الحيوانات في سورية بسبب الظروف الحالية، إذ تعد الحيوانات وخاصة الأبقار من أهم مصادر نشر هذا الطفيلي، حيث يمكن أن يطرح العجل المصاب أعداداً هائلة من البيوض المتكيسة قد تصل إلى107 /غرام براز (Fayer et al., 1998). ويمكن تفسير تطابق نتائج اللطخة المباشرة المصبوغة مع نتائج طريقة الفورمول-إيتر التركيزية بأن كمية البراز التي يطرحها الطفل (بعمر أقل من 5 أعوام) يومياً تعد صغيرة، ويكون تركيز الطفيليات فيها أكبر مما هو الحال لدى البالغين أو الأطفال الأكبر سناً، وبالتالي فإن الكمية الصغيرة المستخدمة في اللطخة المباشرة تعد كافية غالباً لكشف الإصابة. أظهرت نتائج الدراسة أن نوع خفية الأبواغ الصغيرة هو الوحيد المسجل، ولكن هذا لا يعني عدم وجود أنواع أخرى لدى الإنسان في سورية. والحصول على صورة أوضح يتطلب دراسة أوسع تشمل كافة المحافظات السورية، وتشخيص عدد أكبر من الحالات الإيجابية عند الأطفال، بالإضافة إلى المرضى ناقصي المناعة، ليطبق عليها تحليل RFLP. ويجب التأكيد على أن النوع المشخص في هذا العمل يعد مشتركاً بين الإنسان والحيوان، ولكن أكدت الدراسات الحديثة التي اعتمدت سلسلة DNA الطفيلي المسؤول عن البروتين السكري GP60 على وجود تحت أنماط subtypes لخفية الأبواغ الصغيرة C. parvum، يصيب بعضها الإنسان والأبقار، في حين يصيب بعضها الآخر الإنسان فقط الأمر الذي قد يسهم في معرفة وفهم مصدر العدوى.   الاستنتاجات Conclusions   - وجدت البيوض المتكيسة لخفية الأبواغ بنسبة 3.5% في براز الأطفال دون 5 أعوام من العمر والمصابين بالإسهال اعتماداً على صبغة تسيل نيلسون المعدلة. - كان نوع خفية الأبواغ الصغيرة C. parvum هو الوحيد الذي جرى كشفه باستخدام تحليل PCR-RFLP. - ضرورة إجراء دراسات أوسع وأشمل حول هذا المسبب، وتشمل أيضاً المرضى ناقصي المناعة. - ضرورة تحديد تحت الأنماط subtypes اعتماداً على سلسلة DNA الطفيلي المسؤول عن البروتين السكري GP60 للمساعدة في تحديد مصدر العدوى.   المراجع References  1- الأديب، غسان عبد الرحمن: التحري عن البوغيات الخفية عند البالغين المصابين بإسهالات مزمنة وعند البالغين اللاعرضيين، بحث علمي لنيل شهادة الماجستير في علم الأحياء الدقيقة، كلية الطب البشري، جامعة دمشق، 1999. 2- الكسار، بسام ديب: تحري البوغيات الخفية عند الأطفال دون السنة العاشرة للمصابين بإسهالات وعند الأطفال اللاعرضيين في السن نفسه، بحث علمي لنيل شهادة الماجستير في علم الأحياء الدقيقة، كلية الطب البشري، جامعة دمشق، 1999. 3- قطرنجي، محمد محسن: دراسة عن مدى تواجد البوغيات الخفية في إسهالات العجول الرضيعة، مجلة جامعة البعث، المجلد 19(3)، 89-109، 1997. 4- Abu samra N. AN Epidemiological study of cryptosporidiosis at the wildlife/livestock/human interface in Mpumalanga province, south Africa, Ph.D. thesis, Fac. Vet. Sci; university of Pretoria, 2013. 5- Caccio M.S. and Putignani L. Epidemiology of Human Cryptosporidiosis, in Cryptosporidium: parasite and disease, Caccio. M. S. and Widmer, G; Springer-Verlag Wien, p 43-80, 2014. 6-Current W.L. Techniques and laboratory maintenance of Cryptosporidium, in Cryptosporidiosis of Man and Animals, Dubey J.P; Speer C.A. and Fayer R; Eds. CRC Press, Boca Raton, FL, p 31- 49, 1990. - Fayer R; Gasbarre L; Pasquali P; Canals A; Almeria S. and Zarlenga D. Cryptosporidium parvum infection in bovine neonates: dynamic clinical, parasitic and immunologic patterns. Int. J. Parasitol. 28(1):49-56, 1998. 7-Fayer R; Speer C.A; Dubey J.P; General biology of Cryptosporidium. In: Fayer,R. (Ed.), Cryptosporidium and Cryptosporidiosis. CRC Press, Boca Raton, FL, 1-29, 1997. 8-Feng Y; Ortega Y; He G; Das P; Xu, M. Zhang, X; Fayer R; Gatei W; Cama V. and Xiao L. Wide geographic distribution of Cryptosporidium bovis and the deer-like genotype in bovines. Vet. Parasitol. 144, 1-9, 2007. 9-Goldman E. and Green L.H. Practical Handbook of Microbiology. Eds. CRC Press, Boca Raton, 2nd ed, London New York, p 853, 2009. 10- Helmy Y.A; Krücken J; Nöckler K; von Samson-Himmelstjerna G. and Zessin K.H. Molecular epidemiology of Cryptosporidium in livestock animals and humans in the Ismailia province of Egypt. Vet Parasitol. 193(1-3): 15-24, 2013. 11-Hunter P.R. and Hadfield S.J. Subtypes of Cryptosporidium parvum in humans and disease risk. Emerg Infect Dis (13): 82-88, 2007. 12-Ismail M.T. La Cryptosoridiose en Syrie. Nouvelle Scientifique de France et du Proche Orient. Juillet. 72-76, 1995. 13-Leoni F; Amar C; Nichols G; Pedraza-Dı´az S; and McLauchlin J. Genetic analysis of Cryptosporidium from 2414 humans with diarrhoea in England between 1985 and 2000, Journal of Medical Microbiology (55): 703-707, 2006. 14- Smith H. Diagnostics, Fayer, R. Xiao, L; (Eds). Cryptosporidium and Cryptosporidiosis. CRC Press, Boca Raton, 2nd ed, London New York, 173-208, 2008. 15-Smith H.V; Caccio S.M; Cook N; Nichols R.A; Tait A. Cryptosporidium and Giardia as foodborne zoonoses. Vet. Parasitol. (149): 29-40, 2007. 16-Xiao L. Molecular epidemiology of cryptosporidiosis: an update. Exp. Parasitol. (124): 80-89, 2010. 17- Xiao L; Escalante L; Yang C; Sulaiman I; Escalante A.A; Montali R.J; Fayer R. and Lal A.A. Phylogenetic analysis of Cryptosporidium parasites based on the small-subunit rRNA gene locus, Appl. Environ. Microbiol. (65):1578-1583, 1999. 18- Xiao L; Fayer R. Molecular characterisation of species and genotypes of Cryptosporidium and Giardia and assessment of zoonotic transmission. Int. J. Parasitol. (38): 1239-1255, 2008.     المجلد 8 , العددان 1 و 2 , رمضان 1437 - تموز (يوليو) 2016 SCLA