بحث في أعداد المجلة
الجملة  
المؤلف   
 

المجلد 8 , العددان 1 و 2 , رمضان 1437 - تموز (يوليو) 2016
 
التعدد الشكلي لجين الانترفيرون غاما +874 A/T وارتباطه المحتمل مع درجة التليف والفعالية الالتهابية لدى مرضى التهاب الكبد ب المزمن في مستشفى دمشق
Interferon-gamma +874 A/T Polymorphism Gene and its Potential Association with Fibrosis Degree and Inflammatory Activity in Chronic Hepatitis B Patients in Damascus Hospital
د. محمد القاضي1 و أ. د. فوزة منعم1،2
AL Kadi M. 1 and Monem F.1,2
1 كلية الصيدلة، 2 مستشفى الأسد الجامعي، جامعة دمشق
1 Faculty of Pharmacy, 2 ALASSAD Hospital, Damascus University
الملخص Abstract
التهاب الكبد البائي المزمن مشكلة صحية عالمية، حيث يقدر عدد المصابين بالعدوى المزمنة بـ 350 مليون مصاب حول العالم. تعد الخزعة الكبدية المعيار الذهبي التقليدي لتقييم درجة الإصابة الكبدية والتي تشمل كلاً من الفعالية الالتهابية ودرجة التليف. لكنها تبقى باضعة ومزعجة للمرضى. وعليه فلقد هدفت دراستنا إلى البحث عن واصم جيني ينبئ بدرجة الإصابة الكبدية لدى مرضى التهاب الكبد ب، باستقصاء ارتباط كلٍ من الفعالية الالتهابية ودرجة التليف مع التعدد الشكلي +874 A/T، الذي يؤثر على مستوى التعبير عن جين الانترفيرون غاما. شملت هذه الدراسة الحشدية الاستعادية 26 مريضاً بالتهاب الكبد ب المزمن. أجري التنميط الجيني باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل-نظام تضخيم الطفرة المقاوم ARMS-PCR. توزعت الأنماط الجينية على الشكل التالي: النمط الجيني AA (7/26، (%27، النمط الجيني AT (11/26، %42)، النمط الجيني TT (8/26، 31%). ولم نجد أي ارتباطٍ يعتد به بين التعدد الشكلي A/T +874 للانترفيرون غاما وكلٍ من درجة التليف والفعالية الالتهابية. يمكن أن يعزى غياب الارتباط هذا إلى انخفاض عدد العينات المدروسة.  
Chronic hepatitis B is a global health problem with 350 million chronically infected individuals worldwide. The liver biopsy is the traditional gold standard for evaluating the liver injury degree including inflammatory activity and fibrosis degree. However, it remains invasive and uncomfortable to patients. Our study aimed to find a genetic marker that predicts liver injury degree in chronic hepatitis B patients, by investigating the correlation of both of inflammatory activity and fibrosis degree with the +874 A/T polymorphism, which affects the level expression of interferon gamma gene. This retrospective cohort study included 26 chronic hepatitis B patients. Genotyping is carried out using amplification-refractory mutation system- polymerase chain reaction (ARMS-PCR). The genotypes frequencies were: AA genotype (7/26, 27%), AT genotype (11/26, 42%), TT genotype (8/26, 31%). We did not find a significant association between the interferon-gamma +874 A/T polymorphism and both of inflammatory activity and fibrosis degree. This lack of correlation could be due to decreased number of the studied samples. 
المقدمة Introduction 
التهاب الكبد البائي المزمن مشكلة صحية عالمية، حيث يقدر عدد المصابين بالعدوى المزمنة بـ 350 مليون مصاب حول العالم (1). وعلى الرغم من أن أغلب المصابين لا يطورون مضاعفات كبدية، إلا أن ربع إلى ثلث المرضى يطورون مرضاً كبدياً متقدماً كالتشمع وسَرَطانَة الخلايا الكبدية Hepatocellular carcinoma (HCC). حيث يموت 15-25% من هؤلاء بسببها، وتبقى النتيجة السريرية المتغايرة مجهولة السبب (2). تلعب السيتوكينات دوراً هاماً في إمراضية الأمراض المتعلقة بالتهاب الكبد ب، لذا يمكن للتعددات الشكلية للجينات المرمزة للسيتوكينات أن تؤثر على نتيجة العدوى (3). أحد هذه التعددات الشكلية المهمة هو التعدد الشكلي +874T/A (rs2430561) لجين الانترفيرون غاما، والذي يؤثر على مستوى التعبير عن الانترفيرون غاما إثر الاستجابة المناعية. يوجد هذا التعدد الشكلي في منطقة ارتباط عامل الانتساخ NF-kB، حيث يؤثر على قوة ارتباطه بجين الانترفيرون غاما، مما يؤدي إلى عواقب وظيفية على انتساخه. يترافق النمط الجيني TT مع القدرة على إنتاج مستويات مرتفعة من الانترفيرون غاما، والنمط الجيني AT مع مستويات متوسطة، والنمط الجيني AA مع مستويات منخفضة (4). وتأكد تأثير هذا التعدد الشكلي على مستويات الانترفيرون غاما المصلية في العضوية (5). تعد الخزعة الكبدية المعيار الذهبي التقليدي لتقييم درجة الإصابة الكبدية والتي تشمل كلاً من الفعالية الالتهابية ودرجة التليف (6)، ولكنها تبقى باضعة ومزعجة للمرضى. وعليه فلقد هدفت دراستنا إلى البحث عن واصم جيني ينبئ بدرجة الإصابة الكبدية لدى مرضى التهاب الكبد ب المزمن. وذلك بتقصي ارتباط التعدد الشكلي +874T/A (rs2430561) لجين الانترفيرون غاما مع الأذية الكبدية متمثلةً في الفعالية الالتهابية ودرجة التليف في الخزعة الكبدية. أحد أهم النظم المستعملة بشكل واسع في تقييم الخزعة الكبدية الـ (7) METAVIR. وهو نظام شامل ومُبَسط للتقييم النسيجي للأمراض الكبدية الفيروسية المزمنة. يعتمد هذا النظام على خوارزمية ويعكس الحرز النهائي final score تقييماً مدمجاً للنخر الفصي البؤري focal lobular necrosis، والالتهاب البوابي portal inflammation، والنخر التدريجي piecemeal necrosis والنخر الجاسر bridging necrosis. حيث أن 0 (صفر) يعني عدم وجود التهاب، 1 التهاب خفيف، 2 التهاب متوسط، 3 التهاب شديد. كما يقدم الـ METAVIR 4 درجات للتليف، والتي تعكس تقدم المرض. حيث أن 0 تعني عدم وجود تندب، 1 تندب أدنى، 2 تندب حاصل وممتد خارج المناطق الكبدية التي تحتوي أوعية دموية، 3 انتشار تندب جاسر يَصِل المناطق الأخرى التي تحوي تليف، 4 تشمع أو تندب متقدم للكبد (8، 9).  
المواد والطرق 
تصميم الدراسة
صممت الدراسة كدراسة حشدية استعادية retrospective cohort study

العينات والاعتيان
جُمعت العينات (n=26) بين نيسان 2015 وكانون الثاني 2016 من عيادة الكبد الخارجية في مستشفى دمشق. تضمنت معايير اشتمال المشاركين في الدراسة على ما يلي: العمر أكثر من 20 عاماً، إيجابية المصل للمستضد HBsAg لفترة تتجاوز ستة أشهر، سلبية الأضداد anti-HCV وanti-HIV، وجود نتيجة خزعة كبدية بعد تشخيص التهاب الكبد ب المزمن، وقبل البدء بالمعالجة المضادة للفيروسات في سجلات المريض، على أن يكون الحمل الفيروسي عند إجراء هذه الخزعة أكبر من 103 نسخة/مل. استُبعد المشارك الذي لا يحقق المعايير السابقة أو الذي تلقى معالجة مضادة للفيروسات ضد فيروس التهاب الكبد ب قبل إجراء الخزعة الكبدية.
حصلنا على البيانات الهيستولوجية المعتمدة على مقياسMETAVIR (6) من سجلات المرضى والذي يعطي 5 نقاط للتليف موزعة من 0 في حال عدم وجود تليف إلى 4 في حال تشمع الكبد، ويعطي 4 نقاط لدرجة الفعالية موزعة من 0 في حال عدم وجود فعالية هيستولوجية إلى 3 في حال وجود فعالية شديدة.
أُخذت العينات بعد موافقـة اللجنـة الأخلاقية في جامعة دمشق على مخطط الدراسة، وبعد الحصول
على الموافقة المستنيرة للمرضى.
استخلاص الدنا الجينومي
أُخذت عينات دم محيطي من 26 مريضاً في أنابيب عقيمة تحوي EDTA. استُخلص الدنا الجينومي من الكريات البيضاء، باستخدام عتيدة تجارية (ViennaLab Diagnostics)، وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. جرى التحقق من تركيز ونقاوة عينات الدنا بوساطة جهازNano Drop Thermo Scientific، ثم حُفظت العينات في درجة الحرارة -20°C.

التنميط الجيني
أنجز التنميط الجيني بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل- نظام تضخيم الطفرة المقاوم Amplification-Refractory Mutation System-PCRA (RMS-PCR)، حيث أجري تفاعلي PCR لكل عينة دنا، واحتوى كل تفاعل على ثلاثة مشارع: مشرع شاهد داخلي (10)، مشرع نوعي، مشرع عكسي (4) (الجدول 1). أجري التفاعل في مزيج 20 µL يحتوي على: µL GoTaq® Master mix 2X10، 50-100 نانو غرام من عينة الدنا، مشرع نوعي 2 mM، مشرع عكسي 2mM ، مشرع شاهد داخلي 1 mM ثم مُدد إلى 20 µL بالماء منزوع النُوكْلِياز. أجريت التفاعلات في جهاز GeneAmp® PCR System 9700 وفق البرنامج الحراري التالي: دورة واحدة من التمسيخ البدئي لمدة 5 دقائق بالدرجة 95°C، تلتها 35 دورة (95°C لمدة 30 ثانية، 57.5°C لمدة 30 ثانية، 72°م لمدة 30 ثانية).
وأخيراً دورة واحدة من الإطالة النهائية بالدرجة 72°C لمدة 5 دقائق. فُصلت منتجات التضخيم على هلامة آغاروز 1.5% تحتوي على بروميد الإيثيديوم، وجرى تصوير الهلامة وتوثيقها في جهاز توثيق الهلام (Zentich Engineers).  
 
التحاليل الإحصائية
حللت النتائج بواسطة برنامج (IBM)SPSS 17.0 . حللت البيانات الكمية بوساطة اختبار Student t-test. استخدم اختبار كاي مربع good-of-fit لفحص توازن Hardy-Weinberg للتواترات الأليلية، واستخدم اختبار Fisher's exact لمقارنة درجة التليف والفعالية الالتهابية بين الأنماط الجينية المختلفة مع تقسيم المرضى من حيث الفعالية إلى: مرضى ذوي فعالية خفيفة أو عدم وجود فعالية (A0 و A1) مقابل مرضى ذوي فعالية معتبرة أو شديدة (A2 أو A3). ومن حيث التليف قسموا إلى مرضى لديهم تليف خفيف أو ليس لديهم تليف (F0 أو F1) مقابل مرضى لديهم تليف معتبر أو شديد (F2 أو F3 أو F4). اعتبرت قيم P الأقل من 0.05 معتداً بها إحصائياً.  
النتائج Results 
بعد انتهاء ترحيل منتجات ARMS-PCR على الهلامة، يُعد النمط الجيني متغاير الزيجوت عند وجود عُصابتي 264 bp في بئري المريض. ومتماثل الزيجوت في حال وجود عُصابة واحدة (264 bp) في أحد البئرين دون الآخر (الشكل 1).
توزعت الأنماط الجينية على الشكل التالي:
النمط الجيني AA (7/26, %27)، النمط الجيني AT (11/26, %42)، النمط الجيني TT (%31 8/26,). وعند اختبار توازن Hardy-Weinberg كانت هذه التواترات الأليلية متوازنة طبقاً لمعادلة Hardy-Weinberg (P > 0.05).
اختبرنا علاقة النمط الجيني للتعدد الشكلي +874 A/T لجين الانترفيرون غاما مع الفعالية الالتهابية ودرجة التليف وفق مختلف النماذج الوراثية: السيادة المشتركة codominance، والسيادة dominance، والتنحي recessivity والسيادة المفرطة overdominance، ولم نجد علاقة بين النمط الجيني لهذا التعدد الشكلي مع درجة الالتهاب والتليف (الجدول 2).
وجدنا فرقاً مُعتداً به إحصائياً في الحمل الفيروسي بين المرضى ذوي الأنماط الجينية المختلفة للتعدد الشكلي +874 A/T في جين الانترفيرون غاما وفق النموذج الوراثي AT&TT vs. AAK حيث كان متوسط لوغاريتم الحمل الفيروسي (مقدراً بنسخة/مل) 6.49 لدى مرضى النمط الجيني TT مقابل 7.65 لدى مرضى النمطين AA&AT (الفرق = 1.16، فواصل الثقة 95% = 2.16 – 0.16، P <0.05).  
 
المناقشة Discussion 
الانترفيرون غاما ذو دور مضاد للتليف الكبدي وقد ثبت دوره في إبطاء تقدم التليف (11) وعليه فإنه من المفترض أن يترافق النمط الجيني TT للتعدد الشكلي +874 ذو الإنتاج المرتفع من الانترفيرون غاما مع انخفاض في درجة التليف، وأن يترافق النمط الجيني AA ذو الإنتاج المنخفض من الانترفيرون غاما مع ارتفاع درجة التليف. لم تظهر نتائج دراستنا علاقة بين درجة التليف والنمط الجيني للتعدد الشكلي +874 A/T في جين الانترفيرون غاما.
ولقد خالفت نتائجنا الدراسة الوحيدة الموجودة في الأدبيات الطبية والتي ربطت درجة التليف بهذا التعدد الشكلي، إذ وجد Gao وزملاؤه (12) أن النمط الجيني TT ترافق مع انخفاض في درجة التليف لدى 203 مريضاً بالتهاب الكبد المزمن. قد يعزى غياب العلاقة بين التعدد الشكلي +874 ودرجة التليف في دراستنا إلى صغر حجم العينة المدروسة (n=26). ومن الجدير بالذكر أن هنالك العديد من الدراسات التي لم تجد علاقة بين التعدد الشكلي +874 A/T لجين الانترفيرون غاما مع التشمع الكبدي الذي ينجم عن تقدم التليف إلى الدرجة النهائية F4 (5، 13-15) لكنها لم تتقصَّ العلاقة مع درجات التليف الأخرى (F3-F2).
أوضحت دراستنا عدم وجود ارتباط بين الفعالية الالتهابية والتعدد الشكلي +874 A/T لجين الانترفيرون غاما، على االرغم مما أظهرته بعض الدراسات من ارتباطٍ إيجابي بين الانترفيرون غاما والفعالية الالتهابية (11). وقد يفسر غياب الارتفاع المتوقع للفعالية الالتهابية لدى ذوي النمط الجيني TT بالعدد المنخفض للمرضى المدروسين.
أوضحت نتائجنا وجود ارتباط (P < 0.05) بين التعدد الشكلي +874 A/T لجين الانترفيرون غاما مع الحمل الفيروسي (نسخ الدنا الفيروسي) المجرى قبل الشروع بمعالجة مرضى التهاب الكبد ب المزمن المدروسين. توافقت هذه النتائج مع نتائج دراسة قرشي وزملاؤه (16)، حيث أن دور الانترفيرون غاما معروف في تثبيط فيروس التهاب الكبد ب (17) وقد يفسر هذا انخفاض الحمل الفيروسي لدى ذوي النمط الجيني TT في دراستنا. ويتوافق ذلك مع دراسة Ozkan وزملائه التي وجدت ارتباطاً سلبياً بين مستويات الانترفيرون غاما المصلية والحمل الفيروسي قبل المعالجة (18). تدعم هذه النتيجة العلاقة التي افترضناها بين التعدد الشكلي +874 A/T لجين الانترفيرون غاما مع الفعالية الالتهابية ودرجة التليف. لكن على الرغم من أن دراسات أخرى (19) وجدت ارتباطاً إيجابياً بين الحمل الفيروسي والفعالية الالتهابية ودرجة التليف، لم تؤكد نتائجنا الارتباط المحتمل بين التعدد الشكلي +874 A/T لجين الانترفيرون غاما والفعالية الالتهابية ودرجة التليف، وهذا يمكن أن يكون مرده كما ذكرنا سابقاً إلى صغر حجم العينة المدروسة.

الاستنتاجات
إن العدد الضئيل للمرضى المدروسين في بحثنا، لم يمكننا من إيجاد الارتباط المتوقع بين التعدد الشكلي +874 A/T لجين الانترفيرون غاما ودرجة التليف والفعالية الالتهابية اللذين يعكسان الإصابة الكبدية لدى مرضى التهاب الكبد ب المزمن.  
المراجع References 
1. Liaw YF, Chu CM.
Hepatitis B virus infection, Lancet (London, England), 2009; 373 (9663): 582-592.

2. Chia-Ming C, Yun-Fan L.
Natural Course of Chronic Hepatitis B Virus Infection. Chronic Hepatitis B and C, WORLD SCIENTIFIC; 2011. p. 3-33.

3. Tunçbilek S.
Relationship between cytokine gene polymorphisms and chronic hepatitis B virus infection, World journal of gastroenterology, 2014; 20 (20): 6226-6235.

4. Pravica V, Perrey C, Stevens A, Lee JH, Hutchinson IV.
A single nucleotide polymorphism in the first intron of the human IFN-gamma gene: absolute correlation with a polymorphic CA microsatellite marker of high IFN-gamma production, Human immunology, 2000; 61 (9): 863-866.

5. Saxena R, Chawla YK, Verma I, Kaur J.
IFN-gamma (+874) and not TNF-alpha (-308) is associated with HBV-HCC risk in India, Molecular and cellular biochemistry, 2014; 385 (1-2): 297-307.

6. Mani H, Kleiner DE.
Liver biopsy findings in chronic hepatitis B. Hepatology, 2009; 49 (5 Suppl):S61-71.

7. Mohamadnejad M, Tavangar SM, Sotoudeh M, Kosari F, Khosravi M, Geramizadeh B, et al. Histopathological Study of Chronic Hepatitis B: A Comparative Study of Ishak and METAVIR Scoring Systems, International journal of organ transplantation medicine, 2010; 1 (4): 171-176.

8. Mannan R, Misra V, Misra SP, Singh PA, Dwivedi M.
A comparative evaluation of scoring systems for assessing necro-inflammatory activity and fibrosis in liver biopsies of patients with chronic viral hepatitis. Journal of clinical and diagnostic research: JCDR, 2014; 8 (8): FC08-12.

9. Theise ND. Liver biopsy assessment in chronic viral hepatitis: a personal, practical approach. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 2007;20 Suppl 1:S3-14.

10. Silva GA, Santos MP, Mota-Passos I, Boechat AL, Malheiro A, Naveca FG, et al. IFN-gamma +875 microsatellite polymorphism as a potential protection marker for leprosy patients from Amazonas state, Brazil. Cytokine. 2012; 60 (2): 493-497.

11. Tang J-T, Fang J-Y, Gu W-Q, Li E-L.
T cell immune response is correlated with fibrosis and inflammatory activity in hepatitis B cirrhotics, World Journal of Gastroenterology: WJG. 2006; 12 (19): 3015-3019.

12. Gao QJ, Liu DW, Zhang SY, Jia M, Wu LH. Association between IFN-gamma+874 polymorphisms and the clinical outcomes of hepatitis B and/or hepatitis C virus infection. Zhonghua liu xing bing xue za zhi = Zhonghua liuxingbingxue zazhi. 2010; 31.

13. Sun Y, Lu Y, Xie L, Deng Y, Li S, Qin X.
Interferon gamma polymorphisms and hepatitis B virus-related liver cirrhosis risk in a Chinese population, Cancer Cell International, 2015; 15 (1): 1-7.

14. Ben-Ari Z, Mor E, Papo O, Kfir B, Sulkes J, Tambur AR.
Cytokine gene polymorphisms in patients infected with hepatitis B virus, The American journal of gastroenterology, 2003;98.

15. Srivastava M, Ranjan A, Choudhary JK, Tripathi MK, Verma S, Dixit VK, et al.
Role of proinflammatory cytokines (interferon gamma) and anti-inflammatory cytokine (interleukin-10) gene polymorphisms in chronic hepatitis B infection: an Indian scenario, Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 2014;34(7):547-551.

16. Korachi M, Ceran N, Adaleti R, Nigdelioglu A, Sokmen M.
An association study of functional polymorphic genes IRF-1, IFNGR-1, and IFN-gamma with disease progression, aspartate amino-transferase, alanine aminotransferase, and viral load in chronic hepatitis B and C, International journal of infectious diseases : IJID : official publication of the International Society for Infectious Diseases. 2013; 17 (1): e44-9.

17. Phillips S, Chokshi S, Riva A, Evans A, Williams R, Naoumov NV. CD8(+) T cell control of hepatitis B virus replication: direct comparison between cytolytic and noncytolytic functions, Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 2010; 184 (1): 287-295.

18. Ozkan TB, Budak F, Erdemir G, Ozgur T, Aker S.
Do liver IL-12 levels predict sustained response to IFN-alpha therapy in children with chronic hepatitis B? Journal of interferon & cytokine research: the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research, 2010; 30(6): 433-438.

19. Madan K, Batra Y, Jha JK, Kumar S, Kalra N, Paul SB, et al.
Clinical relevance of HBV DNA load in patients with chronic hepatitis B infection, Tropical gastroenterology: official journal of the Digestive Diseases Foundation, 2008; 29 (2): 84-90.  
 
المجلد 8 , العددان 1 و 2 , رمضان 1437 - تموز (يوليو) 2016

 
 
SCLA