| الملخص Abstract |
أشارت دراسات سابقة إلى وجود ارتباط بين طفرات جين BRCA2 وسرطانات الثدي الفصيصية الغزوية، لذلك هدفنا من خلال هذه الدراسة إلى استقصاء ذلك الارتباط المحتمل لدى مجموعة من مريضات سوريات مصابات بسرطان ثدي غزوي مبكر الحدوث
شملت دراستنا 25 مريضة سرطان ثدي غزوي مبكر الحدوث من عائلاتٍ سوريةٍ مختلفة و10 نساءٍ صحيحاتٍ ظاهرياً كمجموعةٍ شاهدة. ولقد جرى عزل الدنا من عينات الدم ثم أجري التفاعل البوليميراز السلسِلي Polymerase chain
reaction لتضخيم مناطق نوعية (بقع حارّة)؛ الإكسون 9 والإكسون 11 في جين BRCA2. ثم جرت بعد ذلك سلسلة نواتج PCR لاستقصاء وجود تبدلات جينية.
كشفت سلسلة نواتج تفاعل البوليميراز السلسلي 5 طفراتٍ جديدةٍ في المنطقتين المدروستين، متضمنةً 3 طفرات حذف وطفرتي استبدال. وحسب معرفتنا فإن الطفرات المكتشفة لم يرِد ذكرها في أية دراسةٍ سابقة.
وكاستنتاج، يمكن أن تكون مريضات النمط الفصيصي لسرطان الثدي الغزوي مرشحاتٍ قوياتٍ للفحص الجيني المطبق لاستقصاء طفرات جين BRCA2. ولقد ارتبط النمط الفصيصي مع عوامل الاختطار الهرمونية لسرطان الثدي بشكلٍ أقوى مقارنةً مع النمط القنوي. ومن المتوقع أيضاً أن تكون الاستجابة السريرية للأورام الفصيصية تجاه المعالجات الهرمونية لسرطان الثدي أفضل منها للأورام القنوية.
|
Previous studies pointed out that there is an association between BRCA2 gene mutations and invasive lobular breast cancers, so we aimed through this study to investigate that possible correlation in a group of Syrian patients with early onset invasive breast cancer.
25 early onset invasive breast cancer patients from different Syrian families and 10 healthy women as a control group were included in the study. DNA was isolated from blood samples and then polymerase chain reaction (PCR) was performed to amplify specific regions (hotspots); exon 9 and exon 11 of BRCA2 gene. PCR products were then sequenced to investigate the presence of genetic variations. Sequencing of PCR products revealed five novel mutations in the studied regions, including three deletions and two substitutions. To our knowledge, the detected mutations were not mentioned in any previous study.
As conclusion, patients with lobular type of invasive breast cancer may be potent
candidates for the genetic testing applied to investigate BRCA2 gene mutations. Lobular type had a stronger association with breast cancer hormonal risk factors as compared to ductal type. It is also expected that the clinical response of lobular tumors to hormonal therapies is better than that of ductal tumors.
|
| المقدمة Introduction |
يعد سرطان الثدي مشكلةً صحيةً هامة وتهديداً رئيساً للصحة العامة. وهو السرطان الأكثر شيوعاً لدى النساء في كلٍ من البلدان النامية والمتقدمة. حيث أنه واحدٌ من عشرة أورام جديدة مشخصة في العالم. وهو أيضاً السبب الأكثر شيوعاً للوفاة بسبب السرطان لدى النساء في بلدان العالم (1).
يمكن أن تكون أورام الثدي فرّاديةً Sporadic أو عائليةً Familial أو وراثية Hereditary. إن معظم سرطانات الثدي فرّاديةً لدى المرضى الذين لا يمتلكون قصة عائلية للإصابة بالسرطان، ويزداد حدوث هذه الإصابات لدى النساء فوق عمر 50 عاماً (2). إن وراثة طفرةٍ في جين BRCA1 أو BRCA2، التي تصنف كجينات كابتة للورم Tumor suppressor genes، تعني وجود أهبة وراثية (استعداد وراثي) لدى هذا الفرد للإصابة بسرطان الثدي، حيث تعد هذه الجينات أهم الجينات المؤهبة لسرطان الثدي عالية الانتفاذ High-Penetrance Breast Cancer Predisposition Genes (3). تفسر الطفرات الممرضة في جيني BRCA1 و BRCA2 10-20% من سرطانات الثدي التي تحدث لدى المرضى ذوي القصة العائلية الملحوظة للإصابة أو الذين تظهر لديهم الإصابة في عمر مبكر (3). وتعدّ طفرات جين BRCA2 مسؤولةً عن 30-40% تقريباً من حالات سرطان الثدي الوراثي كلها. تظهر النساء الحاملات لطفرات ناشئة في الخلايا الجنسية Germline mutations لهذا الجين، اختطاراً تراكمياً عُمُرياًLifetime (LCR) cumulative risk ، يتراوح بين 44-68%، لتطور سرطان الثدي حتى عمر 70 عاماً (4). يمكن أن تحدث سرطانات الثدي الغزوية في أحد نمطين نسيجيين رئيسين هما السرطانة القنوية الغزوية invasive ductal carcinoma والسرطانة الفصيصية الغزوية invasive lobular carcinoma. ويعد النمط القنوي الأكثر شيوعاً، حيث يشكل 90% من كل حالات أورام الثدي الغزوية، بينما يعد النمط الفصيصي مسؤولاً عن 10% تقريباً من سرطانات الثدي الغزوية (5).
تبدأ السرطانة القنوية الغزوية في قناة لبنية في الثدي، ثم تخترق جدار القناة وتنمو في النسيج الدهني للثدي. وعند هذه النقطة، يمكن أن تكون قادرةً على الانتشار (الانتقال) إلى أجزاء أخرى من الجسم عن طريق الجهاز اللمفي ومجرى الدم. بينما تنشأ السرطانة الفصيصية الغزوية في الغدد المنتجة للبن (الفصيصات Lobules)، وتستطيع الانتشار كالسرطانة القنوية الغزوية إلى أجزاء أخرى من الجسم (6). ويتباين النمطان القنوي والفصيصي لسرطان الثدي فيما يتعلق بعوامل الاختطار، على الرغم من أن هذه الاختلافات لا تؤخذ بعين الاعتبار كما يجب، حيث يميل الأطباء لعلاج كلا النمطين بالطريقة نفسها. وبالمقارنة مع الأورام القنوية، فإن الأورام الفصيصية تميل لأن تشخص في أعمارٍ أكبر مع حجمٍ ورميٍ أكبر ومرحلةٍ ورميةٍ أكثر ترقياً. أيضاً تكون الأورام الفصيصية غالباً أكثر إيجابيةً للمستقبلات الهرمونية، حيث يجري التعبير في 95% من الحالات عن مستقبل الإستروجين ER وفي 60 إلى 70% من الحالات عن مستقبل البروجستيرون PR (7، 8، 9)، بينما تميل أورام هذا النمط لأن تكون سلبية التعبير عن النمط الثاني من مستقبلات عامل النمو البشروي البشري HER2 (9)، مما يقترح وجود ارتباطٍ أكبر للأورام الفصيصية مع عوامل الاختطار الهرمونية لسرطان الثدي، من ضمنها العوامل التكاثرية المرتبطة بزيادة التعرض للإستروجين داخلي المنشأ المنتج من المبيضين مثل بدء الإحاضة الأبكر وتأخر انقطاع الطمث وقلة الولادات والعمر المتقدم عند أول ولادة حية، وكذلك التعرض للهرمونات خارجية المنشأ من خلال استخدام مانعات الحمل الفموية والمعالجات الهرمونية الإياسيةMenopausal hormone therapy (5). وتُظهر السمات السريرية للأورام الفصيصية الغزوية إنذاراً جيداً، حيث أنها غالباً منخفضة الدرجة، علماً أنها يمكن أن تكون نقيلية بقوة (10). وتؤكد العديد من التقارير وجود تراكمٍ عائليٍ للإصابة بالأورام الفصيصية الغزوية (11). لقد أظهرت بعض جينات الأهبة لسرطان الثدي ذات الانتفاذ المرتفع high-penetrance breast cancer susceptibility genes لدى اختبارها ارتباطاً معتداً به مع النمط الجزيئي لسرطان الثدي، حيث ارتبطت الطفرات الناشئة في الأعراس في جيني BRCA1 وTP53 غالباً مع سرطانة قنوية غزوية، في حين ارتبطت طفرات جين BRCA2 مع كلٍ من النمطين الفصيصي والقنوي لسرطانة الثدي الغزوية (12، 13).
وتبعاً لاقتراح العديد من الدراسات (14، 15) فإن الاختطار النسبي لسرطان الثدي لدى النساء بعد سن الإياس واللاتي يتلقين معالجة استعاضة هرمونية مشتركة hormonal replacement therapy combined كان أعلى لصالح السرطانات الفصيصية الغزوية منه للسرطانات القنوية الغزوية.
|
| المواد والطرق Materials and Methods |
| جرى انتقاء 25 مريضة سرطان ثدي غزوي مبكر الحدوث early onset invasive breast carcinoma من عائلاتٍ سورية مختلفة لإنجاز دراسةٍ مقطعية استباقية prospective cross-sectional study. ولقد شملت الدراسة أيضاً مجموعةً شاهدةً مطابقةً عُمرياً لمجموعة المرضى ضمت 10 نساءٍ صحيحاتٍ ظاهرياً، لم يكن لديهن أية إصابة أو قصة عائلية لأي نمط من الأورام السرطانية. ولقد تراوحت أعمار النساء المشاركات في دراستنا في المجموعتين المرضية والشاهدة بين 28 و49 عاماً. ولقد جرى الحصول على موافقةٍ مستنيرة من كل المتطوعات المشاركات في الدراسة. وجرى الحصول على البيانات السريرية لمجموعة مرضى سرطان الثدي بالعودة إلى سجلاتهم الطبية في شعب الأورام في مستشفيات المواساة وابن النفيس والهلال الأحمر العربي السوري (الجدول 1).
لقد جرى بزل 5 مل من الدم الوريدي ضمن أنابيب تحوي EDTA كمانع لتخثر الدم. وحُفظت العينات في المجمدة في درجة حرارة C°80- إلى حين عزل الدنا.
|
 |
استخلاص وتضخيم الدنا
جرى عزل الدنا الجينومي Genome من كريات الدم البيضاء المحيطية باستخدام عتيدة عزل دنا من الدم لشركة Fermentas /Thermo Fisher Scientific، Massachusetts،USA . وجرى تعيين مردود ونقاوة الدنا المستخلص باستخدام قياس الامتصاص الضوئي في أمواج أطوالها 260 nm و280 nm، باستخدام مقياس الطيف الضوئي Spectrophotometer. أجري تفاعل البوليميراز السلسلي Polymerase chain reaction PCR بعد التحقق من شروط التفاعلات على الدنا المعزول باستخدام مشارع Primers نوعية من Eurofins، UK. واستخدمنا كذلك مزيجاً رئيساً للتفاعل Fast ready mix KAPA2G مصنعاً من قبل شركة KAPA Biosystems، Massachusetts، USA. ولقد جرى تبني تسلسلات المشارع 9F و9R المنشورة من قبل Bensam وزملائه لتضخيم الإكسون 9 في جين BRCA2 (1)، بينما جرى تصميم المشارع 11F و11R باستخدام أداةOligo Analyzer 3.1 (http://eu.idtdna.com /calc/ analyzer) لتضخيم المنطقة الممتدة من 32,340,082 إلى 32,340,423 في الإكسون 11 في جين BRCA2. وجرى تفاعل البوليميراز السلسلي في حجم نهائي 25 µL يحتوي 100 ng من الدنا المرصافي ودارئة TBE (×10) ونوكليوتيدات ريبية منقوصة الأكسجين ثلاثية الفسفات وإنزيم Taq polymerase والمشارع، في درجة حرارة C°95 لمدة 5 دقائق، يتبعها 35 دورة تتضمن كل منها 30 ثانية في درجة حرارة 5C°9 و20 ثانية.
في درجة حرارة تلدين المشرع المستخدم و30 ثانية في درجة حرارة C°72، ثم دورة واحدة للإطالة النهائية لمدة 7 دقائق في درجة حرارة C°72. ويظهر الجدول 2 تسلسلات المشارع للمناطق الهدف في هذه الدراسة.
سلسلة نواتج تفاعل الـ PCR وتحليل البيانات
أجري تفاعل السلسلة لنواتج تفاعل البوليميراز السلسلي PCR باستخدام المشارع 9F، 9R، 11F، 11R وعتيدة Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. وجرى تعيين التسلسل النوكليوتيدي للنواتج باستخدام جهاز ABI PRISM®310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)، وقرئت نتائج السلسلة باستخدام برنامجي Chromas وGeneious، كما جرى تحليل التسلسلات الناتجة ومقارنتها مع التسلسلات المرجعية في قاعدة البيانات العالمية GenBank باستخدام Standard Nucleotide BLAST في (NCBI) الموجودة على الرابط:
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
وكذلك باستخدام برنامج Geneious. وجرى توثيق الاختلافات الحقيقية بين نواتج السلسلة والتسلسلات المرجعية والرجوع إلى قاعدة البيانات الخاصة بطفرات جين BRCA2 على الرابط التالي:
arup.utah.edu/database/BRCA/Variants/BRCA2. واستخدم برنامج IBM SPSS Statistics 18 لإجراء الدراسة الإحصائية واعتمدت قيمة P?0.05 كقيمة يُعتد بها إحصائياً.
|
| النتائج والمناقشةResults and Discussion |
| يظهر الشكل 1 نواتج التضخيم للمناطق الهدف، بعد اعتماد درجات التلدين المثلى للمشارع المستخدمة في دراستنا (المشرعان 9، 11( في الآبار 1، 5)، على الترتيب، مع سلم الدنا المعياري DNA ladder في البئر 6 (أُجري الرحلان على هلامة أغاروز 2%).
|
 |
كان لدى 84% (21/25) من مرضى سرطان الثدي المدروسين النمط الجزيئي القنوي لسرطان الثدي، في حين أن 16% (4/25) من المرضى كان لديهم النمط الفصيصي للمرض. ولقد اكتشفت طفرتان في الإكسون 11 في جين BRCA2 لدى 8% (25/2) من مرضى سرطان الثدي. كذلك اكتشفت ثلاث طفرات في الإكسون 9 في جين BRCA2 لدى 12% (25/3) من مرضى سرطان الثدي في دراستنا.
ولقد تضمنت الطفرات المكتشفة طفرتي حذفٍ في الإكسون 11 في جين BRCA2 وطفرة حذفٍ بالإضافةً إلى طفرتي استبدال في الإكسون 9 في الجين نفسه. وتظهر الأشكال 2 و3 طفرات 6205 delA و 6284 delA المكتشفة في الإكسون 11، وطفرات 1148 (A>T) و1013 (A>G) و1202delA المكتشفة في الإكسون 9، على الترتيب.
ولقد تبين لنا بعد البحث في قواعد البيانات الخاصة بطفرات جين BRCA2 بأن أياً من الطفرات المكتشفة لم يجرِ استعرافها سابقاً وبالتالي فهي جديدة. ولقد وجدت طفرات BRCA2 لدى المريضات ذوات النمط الفصيصي Lobular subtype لسرطان الثدي بتواترٍ أكبر منه لدى المريضات ذوات النمط القنوي Ductal subtype للإصابة (3 من أصل 4 مريضات حاملات لطفرة في BRCA2 كنّ مصابات بسرطانة فصيصية غزوية Invasive lobular carcinoma)، علماً أن النمط القنوي هو الأكثر انتشاراً بين مرضى
سرطان الثدي في دراستنا. ولقد ارتبطت طفرات جين BRCA2 بشكلٍ يعتد به إحصائياً مع النمط الفصيصي subtype lobular لسرطان الثدي الغزوي (Pearson Chi Square, P=0.003) (الجدولان 3 و4). ولقد اتفقنا في ذلك مع دراسة Mavaddat وزملائه (16) عام 2012. حيث أظهرت نتائجهم انتشاراً أكبر للأورام الفصيصية بين حملة طفرات BRCA2 مقارنةً مع حملة طفرات BRCA1، وقد خلصوا للقول بأن الأورام الفصيصية تميل بشكلٍ أكبر للارتباط مع طفرات جين BRCA2.
لقد تبين كذلك وجود علاقة ارتباطٍ يعتد بها إحصائياً (Pearson Chi Square, P=0.04) بين النمط الفصيصي لسرطانة الثدي الغزوية وإيجابية المستقبلات الهرمونية وبين النمط القنوي وسلبية المستقبلات الهرمونية ]مستقبل الإستروجين estrogen receptor (ER) ومستقبل البروجستيرون progesterone receptor (PR) [، ويظهر ذلك في الجداول 5 و6 و7. ولقد اتفقنا في ذلك مع دراسة Cristofanili وزملائه (17) عام 2005 الذين وجدوا أن انتشار الأورام إيجابية المستقبل الهرموني كان أعلى لدى مرضى السرطانة الفصيصية الغزوية بالمقارنة مع مرضى السرطانة القنوية الغزوية. كذلك توافقت نتائجنا مع Arpino وزملائه (9) عام 2004 والذين وجدوا أن سرطانات الثدي الفصيصية كانت الأكثر احتمالاً بشكلٍ ملحوظ لامتلاك مستقبلات إستروجين وبروجستيرون إيجابية مقارنةً مع السرطانات القنوية.
|
 |
| الاستنتاج Conclusion |
| ارتبطت طفرات جين BRCA2 مع أورام الثدي الفصيصية بشكلٍ أكبر مقارنةً مع الأورام القنوية. ولذلك يمكن أن تكون مريضات النمط الفصيصي مرشحاتٍ قوياتٍ للفحص الجيني المطبق لاستقصاء طفرات جين BRCA2. ولقد ارتبطت السرطانة الفصيصية الغزوية أيضاً وبشكلٍ يعتد به مع إيجابية المستقبلين الهرمونيين (مستقبل الإستروجين ومستقبل البروجستيرون)، في حين كانت الأورام القنوية الغزوية غالباً سلبية المستقبلين الهرمونيين. ولذلك يمكن توقع ارتباط النمط الفصيصي مع عوامل الاختطار الهرمونية لسرطان الثدي بشكلٍ أقوى مقارنةً مع النمط القنوي. كما يتوقع أن تكون الاستجابة السريرية للأورام الفصيصية تجاه المعالجات الهرمونية لسرطان الثدي أفضل منها للأورام القنوية.
|
| المراجع References |
1. Bensam M; Hafez E; Awad D; El-Saadani M. and Balbaa M.
Detection of New Point Mutations of BRCA1 and BRCA2 in Breast Cancer Patients.
Biochem Genet. 2013. 52(1-2):15-28.
2. Brankovic-Magic M; Dobricic J. and Krivokuca A.
Genetics of breast cancer: contribution of BRCA1/2 genes alterations to hereditary predisposition.
Vojnosanitetski Pregled. 2012; 69(8): 700-706.
3. Lin PH; Kuo WH; Huang AC et al.
Multiple gene sequencing for risk assessment in patients with early-onset or familial breast cancer.
Oncotarget. 2016. 7(7): 8310-8320.
4. Fernandes GC; Michelli R; po-Neto CS. and Palmero EL.
Association of polymorphisms with a family history of cancer and the presence of germline mutations in the BRCA1/BRCA2 genes.
Cancer in Clinical Practice. 2016. 14(2): 1-9.
5. Dossus L. and Benusiglio P.
Lobular breast cancer: incidence and genetic andnon-genetic risk factors. Breast Cancer Res. 2015. 17(37): 1-8.
6.Girish CH; Vijayalakshmi P; Mentham R; Babu Rao C. and Nama S.
A Review On Breast Cancer.
Int J Pharm Bio Sci. 2014. 4(2): 47-54.
7.Li CI; Uribe DJ. and Daling JR.
Clinical characteristics of different histologic typesof breast cancer.
British J Cancer. 2005. 93:1046-1052.
8.Reed A; Kutasovic J; Lakhani S. and Simpson P.
Invasive lobular carcinoma of the breast:morphology, biomarkers and omics.
Breast Cancer Res. 2015. 17(12): 1-11.
9.Arpino G; Bardou VJ; Clark GM. and Elledge RM.
Infiltrating lobular carcinoma ofthe breast: tumor characteristics and clinical outcome.
Breast Cancer Res. 2004. 6: 149-156.
10.Shin SJ; Lal A; De Vries S; Suzuki J; Roy R; Hwang ES. et al.
Florid lobularcarcinoma in situ: molecular profiling and comparison to classic lobularcarcinoma in situ and pleomorphic lobular carcinoma in situ.
Human Pathol. 2013. 44: 1998-2009.
11.Xin LG. and Eng LG.
A review of invasive lobular
carcinoma of the breast: Should it be treated like invasive ductal carcinoma?
Integr Cancer Sci Ther. 2016. 3(5): 1-4.
12.Tan MH; Mester JL; Ngeow J; Rybicki LA; Orloff MS. and Eng C.
Lifetime cancer risksin individuals with germline PTEN mutations.
Clin Cancer Res. 2012. 18: 400-407.
13.van Lier MG; Wagner A; Mathus-Vliegen EM; Kuipers EJ; Steyerberg EW. and vanLeerdam ME.
High cancer risk in Peutz-Jeghers syndrome: a systematic review and surveillance recommendations.
Am J Gastroenterol. 2010. 105: 1258-1264.
14.Flesch-Janys D; Slanger T; Mutschelknauss E; Kropp S; Obi N. et al.
Risk ofdifferent histological types of postmenopausal breast cancer by type and regimen of menopausal hormone therapy.
Int J Cancer. 2008. 123: 933-941.
15.Fournier A; Fabre A; Mesrine S; Boutron-Ruault MC; Berrino F. et al. Use of different postmenopausal hormone therapies and risk of histology- and hormone receptor-defined invasive breast
cancer.
J Clin Oncol. 2008. 26: 1260-1268.
16.Mavaddat N; Barrowdale D; Andrulis I; Domchek S; Eccles D; Nevanlinna H. et al.
Pathology of breast and ovarian cancers among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers: results from the Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2 (CIMBA).
Cancer Epidem Biomar. Jan 2012. 21(1): 134-147.
17.Cristofanili M; Gonzalez-Angulo A; Sneige N; Kau SW; Broglio K; Theriault RL. et al.
Invasive Lobular Carcinoma Classic Type: Response to Primary Chemotherapy and Survival Outcomes.
J Clin Oncol. 2005. 23(1): 41-48 .
|
| |
| |
| |
| |
| |
