بحث في أعداد المجلة الجملة   المؤلف

المجلد 8 , العدد 5 , ربيع الآخر 1439 - كانون الثاني (يناير) 2018   استقصاء التعبير عن بروتين الـ c-Flip نسيجّياً لدى مرضى مشخّصين بسرطان القولون والمستقيم وعلاقته بدرجة الورم Investigation of c-Flip Protein Histologically in Patients Diagnosed with Colorectal Cancer and Its Association with Tumour Grade د. يارا بدران1، أ. د. عمار مدنية2، أ. د. أيمن علي3، أ. د. المعتصم بالله زيتون1 Badran Y. 1, Madanea A. 2, Ali A. 3 and Zaitoun Alm1. 1كلية الصيدلة، جامعة دمشق؛ 2هيئة الطاقة الذرية، سورية؛ 3كلية الطب، جامعة دمشق 1Faculty of Pharmacy, Damascus University; 2Atomic Energy Commission, Syria. 3Faculty of Medicine, Damascus University. الملخص Abstract يعد سرطان القولون السرطان الأكثر شيوعاً في الأنبوب الهضمي، ولكنه يمكن أن يكون قابلاً للشفاء عندما بُشخص مبكراً. وجرى حديثاً تعيين هوية بروتين خلوي تثبيطي مشابه للـ FLICE (c-FLIP) كمثبط داخلي المنشأ للـ Fas، ولقد جرى توقع ارتباط تعبيره العالي المتبدل مع ترقي أو تطور الورم. فخلال ترقي الورم تستخدم خلايا السرطان آليات تحول للإفلات من منبهات تحريض الاستماتة. وكان قد لوحظ أن عدداً من خلايا سرطان القولون تُعبر عن لجائن Fas/Fas، لكنها تكون مقاومة للاستماتة المتواسطة بالـ Fas، مما يقترح أن أورام القولون قد تطور آليات نوعية للتغلب على الاستماتة المتواسطة بالـ Fas، من خلال التآثر مع الـ DISC. وضمن جهد مبذول لاستقصاء انتشار تبدلات c-FLIP في سرطانات القولون ومقتضياتها الممكنة لترقي سرطانات القولون والمستقيم، جرى تحليل التعبير عن c-FLIP، على مستوى البروتين، في 24 عينة سرطانة غدية لمرضى سوريين مشخص إصابتهم بسرطان القولون والمستقيم بالطريقة الكيميائية النسيجية المناعية، وكانت هنالك زيادة تعبير عن c-FLIP بنسبة 41.66% من العينات (p<0.05). وهذه النتيجة تقترح بقوة أن فرط التعبير عن cFLIP هو حدث متواتر في سرطانات القولون ويمكن أن يسهم في الاستحالة الورمية في الأحياء، إلا أننا لم نجد أية علاقة بين التعبير عنc-FLIP ودرجة الورم.   Colorectal cancer is considered to be the most common cancer among gastrointestinal tract, but it could be curable when diagnosed early. Recently, cellular FLICE-like inhibitory protein (c-FLIP) has been identified as an endogenous inhibitor of Fas, and its altered high expression has a suspected association with tumour development or progression. During tumour progression, cancer cells use diverse mechanisms to escape from apoptosis inducing stimuli. Substantial numbers of colon cancer cells have been observed to express Fas/Fas ligand, but are resistant to Fas-mediated apoptosis, suggesting that colonic tumours might develop specific mechanisms to overcome Fas-mediated apoptosis, through interaction with DISC. In an effort to investigate the prevalence of c-FLIP alterations in colon carcinomas and their possible implications for the progression of colon and rectal cancers, c-FLIP expression at protein levels, was analyzed in 24 adenocarcinomas samples of Syrian patients diagnosed with colorectal carcinomas, by immunohistochemistry. The expression of c-FLIP were over expressed in 41.66% of the samples (p<0.05). This result strongly suggest, that abnormal over expression of cFLIP is a frequent event in colon carcinomas and might contribute to in vivo tumour transformation, but we did not find any association between c-FLIP expression and tumours grade.   المقدمة Introduction  حققت الأعمال المختبرية الحديثة ثورة حقيقية في فهم الأسس والقواعد الجزيئية في سياق إمراضية التنشؤات السرطانية القولونية المستقيمية، ولقد أدت هذه التطورات إلى تبدل ملحوظ في العديد من الآراء حول تطور سرطان الأمعاء الغليظة، وسبّبت هذه الدراسات المجراة على المستوى الجزيئي تبدلاً جذرياً في كشف وتشخيص ومعالجة السرطان القولوني المستقيمي. وعند دراسة وبائيات وانتشار هذا النوع من السرطان وجد أنه يشكل حوالي 10% من جميع الحالات السرطانية، كما أنه ثاني سبب للوفاة عند النساء بعد سرطان الثدي، وثالث سبب للوفاة عند الذكور بعد سرطاني البروستات والرئة، وقد سجلت حوالي 1.4 مليون حالة جديدة و694 ألف حالة وفاة بهذا المرض خلال عام 2016 (1). من جهةٍ أخرى، نعلم أن الاستماتة الخلوية هي آلية استتبابية طبيعية مع تطور الخلية ومضيها نحو الشيخوخة، بغية الحفاظ على تعداد ثابت لجميعة الخلايا ضمن نسيجٍ ما، قد تكون بمثابة آلية دفاعية كما هو الحال في بعض التفاعلات المناعية؛ وهي تحدث على هيئة حوادث خلوية متّسقة متتابعة تحتاج إلى الطاقة، تتضمن تفعيل مجموعة من البروتيازات (حالّات البروتين) الحاوية على مجموعة سيستيئين تعرف ببروتينات الـCaspase (2). توجهت الأنظار مؤخراً نحو بروتين الـ c-FLIP الذي يقوم بتنظيم فعالية الكاسباز 8 وهو يتواجد وفق أشكال أسوية مختلفة (الشكل القصير S والشكل الطويل L) مشابهة بنيوياً للكاسباز 8 على الرغم من أنه لا يمتلك فعاليتها الإنزيمية، حيث يندمج مع مستقبلات الاستماتة ضمن الـ DISC (death-inducing signaling complex) فيمنع بذلك تفعيله وإطلاق سراح الكاسباز 8 المفعّل (3، 4). قمنا في هذا البحث بدراسة المستويات الهيولية لبروتين الـ c-FLIP لدى 24 مريضاً شُخصت إصابتهم بسرطان القولون والمستقيم وفق معايير التشخيص المتعارف عليها.   المواد والطرق Materials and methods  الدراسة استباقية مقطعية متصالبة Prospective cross-sectional study، أجريت في مستشفيي الأسد والمواساة الجامعيين في دمشق، على مقاطع ورمية قولونية خبيثة مدمجة بالبارافين من الكارسينوما الغدية بدرجاتها المختلفة، امتدت الدراسة على مدى عام ونصف بدءً من شهر كانون الثاني عام 2016 حتى نهاية شهر أيار عام 2017، شمل البحث ذكوراً وإناثاً تراوحت أعمارهم بين 33 و85 عاماً، بعد الحصول على موافقتهم المستنيرة، كما جرى استبعاد المرضى الخاضعين للعلاج الكيميائي أو المناعي أو الإشعاعي. جرى تطبيق طريقة الكيمياء النسيجية المناعية وهي تعتمد على كشف بروتين الـ c-FLIP والتأكد من زيادة تعبيره over expression، وتُجرى على عينات البارافين المحضرة من خزعات قولون أو مستقيم مستأصلة محضرة بطريقة الإدماج، وفق المراحل التالية:   المواد والأجهزة المستخدمة في البحث أوعية خاصة لأخذ الخزعة ووضعها في الفورمول، شاش معقم، فورمول 10%، كحوليات متدرجة التركيز، كزيلول لإزالة البارافين، ملونا الهيماتوكسيلين والإيوزين، بلسم كندا، ماء مقطر، ورق نشاف، شبة الكروم، وقاء تريس، العتيدة المناعية العامة الخاصة بشركة Shanghai Beiyi bioequip الصينية، سواتر زجاجية، جهاز قياس الحموضة pH، المبشرة النسيجية microtome، محم لفرش وتسخين المحضرات، محم بدرجة حرارة 50°C لإدماج البارافين، جهاز تسخين حراري جاف بالأمواج القصيرة، براد خاص للقوالب الشمعية، مجهر ضوئي للدراسة والتصوير مزود بكاميرا دقيقة يابانية. طرق الدراسة - الدراسة الروتينية النسيجية (هيماتوكسيلين- إيوزين) 1- مرحلة التثبيت: بواسطة الفورمول الممدد 10% مدة لا تقل عن 24 ساعة. 2- مرحلة الإدماج: نقوم بإدماج العينة إلى شمع البارافين. 3- مرحلة القطع: بوساطة الـ microtome يعطينا شرائح رقيقة 5-7 مِكْرون (مِكْرومتر). 4- وضع الشرائح على الصفائح الزجاجية. 5- نزع البارافين: بواسطة محم بدرجة حرارة 64°C، ثم الكزيلول والكحول يليها تلوين المحضرات بالملون الروتيني (هيماتوكسيلين- إيوزين). - التلوين بالملونات الكيميائية النسيجية اعتمدنا في تلوين المحضرات بالملونات المناعية النسيجية على بروتوكول الشركة المصنعة للأضداد المناعية وكانت وفق التسلسل التالي: 1- غسل السلايدات المنزوعة الشمع والمجهزة مسبقاً بالماء المقطر بشكل جيد. 2- تجفيف حول العينات بالاستعانة بورق نشاف، ثم غمر العينات بالضد بنسبة تمديد 1/200، مدة 30 دقيقة، تغسل المحضرات بسائل تريس، ثم تغمر فيه بشكل كامل مدة 5 دقائق. 3- تغمر العينات بالرابط " Link" مدة 10 دقائق، تغسل المحضرات بسائل تريس، ثم تغمر فيه بشكل كامل مدة 5 دقائق. 4- تُغمر العينات بالستربتافيدين streptavidin مدة عشر دقائق، تغسل المحضرات بسائل تريس، ثم تغمر فيه بشكل كامل مدة 5 دقائق. 5- يمزج 2 مل من الـ buffer substrate مع نقطة واحدة من الـ AEC-Chromogen وهذه الكمية تكفي لـ 8- 10 مقاطع نسيجية، يلي ذلك غمر العينات بالمزيج السابق Chromogen + streptavidin مدة 10 دقائق. 6- تغسل المحضرات بالماء المقطر مدة دقيقة واحدة وتجفف بورق النشاف. 7- يجري ستر المقاطع النسيجية باستخدم البلسم أو مزيج الجيلاتين والغليسيرين. رست المقاطع باستخدام المجهر الضوئي بتكبير 400، قمنا بتقدير شدة تلون الخلايا في العينات، وكذلك عدد ونسبة الخلايا الآخذة للون في المقطع وذلك وفقاً للمقياس التالي: من 0 إلى 4 كتقدير نصف كمي للبروتين المدروس (5- 7) وجرى الحكم على النتيجة وفق ما هو مبين في الجدول 1. ملاحظة: اتبعنا في دراستنا المعايير المقترحة من قبل ASCO/CAP (الجمعية الأمريكية للمشرحين المرضيين) في تقييم العينات وقبول أو استبعاد النتائج (الشكل 1). الدراسة الإحصائية جرى تقييم الأهمية الإحصائية للاختلاف باستخدام توزع ستيودنت T-student ، حيث p<0.05 قيمة يعتد بها إحصائياً وفق مجال ثقة 95%. النتائج أظهرت التلوينات المناعية أن 41.66% من العينات كانت ذات إيجابية شديدة، 20.83% من العينات كانت ذات إيجابية حدية، 37.5% من العينات كانت سلبية، وهو اختلاف إحصائي يُعتد به، حيث p<0.05 (الشكل 2). التعبير عن بروتين الـ c-FLIP وعلاقته بدرجة الورم. جرت الاستعانة بتقارير التشريح المرضي في مستشفيي الأسد الجامعي والمواساة، بغية معرفة التصنيف الورمي للحالات المشاركة في الدراسة (الجدول 2). وعند دراسة معامل الاقتران Contingency Coefficent وجدنا أنه يساوي 0.17 أي أن الارتباط بين درجة الورم والتعبير عن البروتين ضعيف جداً، ولا يوجد أي اقتران بين الظاهرتين.   المناقشة والاستنتاجات   أثبتنا في هذه الدراسة زيادة التعبير عن الـ c-FLIP على مستوى البروتين. وهي تُعزى من وجهة نظر بيولوجيّة إلى تبدلات التخلق المتوالي epigenetic changes، أو إلى بعض الطفرات المورّثية الطارئة على جين الـ c-FLIP (8)؛ حيث تقوم النسج الورمية بتطوير استراتيجيات عديدة بغية التملص من الاستماتة الخلوية المحدثة بالسبيل الخارجي، ويعد الـ c-FLIP المشتبه الأول وراء الهروب المناعي من اللمفاويات التائية والـ Tumor Counterattack عبر تثبيط تنبيغ إشارة الموت الخلوي المترافقة مع زيادة التعبير عن جزيئات الـ Fas ولجائنها (9-11)، جيث أن البروتين المدروس يمتلك حيّزا هيولياً مماثلاً للحيّز الهيولي لمستقبلات الموت الخلوي، فيقوم معقد الـ DISC بتجنيده عوضاً عن طليعة الكاسباز 8 الذي هو المشرع الأساس في سبيل الاستماتة الخارجي، ولما كانت تلك الطليعة مشابهة للـ cFLIP إلى حد كبير، لذلك فإن كل أشكال الـ cFLIP تثبط تفعيلها، حيث تطرأ مزامرة متغايرة hetero-dimerization تثبط التفعيل لأنه يمتلك التسلسل النوكليوتيدي ذاته، على الرغم من افتقار الـ c-FLIP إلى الموضع الحالّ، يلي ذلك ارتباطه بالـ FADD ضمن معقد الـ DISC عبر تآثر DED-DED، ويقوم بثلم عدد محدد من الركازات حول الـ DISC وهذا ما يفسر قدرة الـ c-FLIP على تثبيط الاستماتة، على الرغم من امتلاكه الفعالية الكيميائية والحيوية لتفعيل طليعة الكاسباز 8، فهو يمنع ارتباطها بالـ DISC ويثبط عملية التعديل المجراة عليها (12)، بالتالي ينتج عن ذلك تثبيط تفعيل الكاسباز، وتثبيط الاستماتة الخلوية، مما يؤكد ضلوع الـ c-FLIP في زيادة معدل التوالد الخلوي proliferation والاستحداث الورمي Tumour-genesis ، حيث أنه ينقص حساسية الخلايا تجاه لجائن الموت الخلوي. أظهرت دراستنا أيضاٌ عدم علاقته الـ c-FLIP بدرجة الورم grade عبر دراسة معامل الاقتران وبالتالي ليس له علاقة بالاستحالة الورمية Tumor Transformation (13). توافقت نتائجنا مع نتائج دراسة Byung-Kyu Ryu وزملائه عام 2001 في كوريا الجنوبية من حيث زيادة التعبير عن الـ c-FLIP في سرطان القولون وعدم علاقته بتطور الورم (14). تفتح هذه الدراسة آفاقاً جديدة أمام إمكانية دراسة الـ c-FLIP كمعلم واعد يمكّننا من الكشف المبكر عن المرض، أو التنبؤ به، لما لذلك من أهمية في ارتفاع نسبة الشفاء، وزيادة نسبة الاستجابة للعلاج الكيميائي ( والتي غالباً ما تكون ناكسة دون وجود مطاوعة جيدة من قبل المريض).   المراجع References  1-Miller KD, Siegel RL, Lin CC, et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 2016;66: 271-289. 2-Vaux DL. and Strasser A. The molecular biology of apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A., 1996; 93: 2239-2244. 3-Djerbi M; Screpanti V; Catrina AI; Bogen B; Biberfeld P. and Grandien A. The inhibitor of death receptor signaling, FLICE inhibitory protein, defines a new class of tumor progression factors. J Exp Med 1999; 190: 1025-1031. 4-Scaffidi C; Schmitz I; Krammer PH. and Peter ME. The role of c-FLIP in modulation of CD95-induced apoptosis. J Biol Chem1999; 274: 1541-1548. 5-Foley E F; Gaffey MJ. and Frierson HF. Jr. Frequency and clinical significance of neuroendocrine cells within stage III adenocarcinoma of the colon. Archives of Patholo & Laboratory Medicine, Oct 1998; 122; 912-914. 6-Saclarides TJ; Szeluga D. and Staren ED. Neuroendocrine cancers of the colon and rectum. Dis Colon Rectum 1994; 37(7): 635-42 7-Miettinen M; Sobin LH. and Lasota J. Gastrointestinal Stromal Tumors of the Colon: A Clinicopathologic, Immunohistochemical, and Molecular Genetic Study of 1765 Cases. Am J Surg Pathol. 2005 jan; 29 (1): 52-68. 8-Han L; Zhao Y. and Jia X. Mathematical modeling identified c-FLIP as an apoptotic switch in death receptor induced apoptosis. Apoptosis 2008, 13, 1198-1204. 9-Fricker N; Beaudouin J; Richter P; Eils R; Krammer P.H. and Lavrik I.N. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro-and antiapoptotic role of c-FLIPL. J. Cell Biol. 2010, 190, 377-389. 10-Zhang L. and Gallagher P.J. Mind bomb 1 regulation of cFLIP interactions. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2009, 297, C1275-C1283. 11-Reyher U; Strater J; Kittstein W; Gschwendt M; Krammer PH. and Moller P. Colon carcinoma cells use different mechanisms to escape CD95-mediated apoptosis. Cancer Res 1998; 58: 526-534. 12-Tepper CG. and Seldin MF. Modulation of caspase-8 and FLICE inhibitory protein expression as a potential mechanism of Epstein-Barr virus tumorigenesis in Burkitt’s lymphoma. Blood, 2014; 1727-1737. 13-Irmler M; Thome M. and Hahne M. Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP. Nature, 2013; 388: 190-195. 14- Byung- Kyu Ryu; Min-Goo Lee; Sung-Gil Chi; Youn-Wha Kim. and Jae-Hoon Park. Increased expression of cFLIPL in colonic adenocarcinoma. The Journal of Pathology, 2001; 194 (1), 15-19.           المجلد 8 , العدد 5 , ربيع الآخر 1439 - كانون الثاني (يناير) 2018 SCLA