بحث في أعداد المجلة الجملة   المؤلف

المجلد 8 , العدد 5 , ربيع الآخر 1439 - كانون الثاني (يناير) 2018   دراسة التعدد الشكلي لجين الـ Her2 لدى مريضات سرطان ثدي في مستشفيات جامعة دمشق Study of Her2 Genetic Polymorphism in Patients with Breast Cancer in Damascus University Hospitals د. دانة السلطي وأ. د. شادن حداد Al-Salti D. and Haddad Sh كلية الصيدلة، جامعة دمشق Faculty of Pharmacy, Damascus University الملخص Abstract سرطان الثدي مشكلة صحية رئيسية شائعة حول العالم. وهو ينتج عن عوامل جينية وبيئية تؤدي إلـى تراكم الطفرات في جينات أساسية. يلعب مستقبل عامل النمو البطاني البشري 2 (Her2) دوراً هاماً في تكون هذا الورم. تم اكتشاف حدوث تبدلات في هذا الجين، كالطفرات النقطية والتعددات الشكلية لدى مريضات سرطان الثدي. هدفت هذه الدراسة إلى استقصاء الارتباط بين التعدد الشكلي لجين الـ Her2 والاستعداد الجيني للإصابة بسرطان الثدي لدى نساء سوريات. شملت الدراسة 100 سيدة، 70 منهن يعانين من سرطان الثدي و30 سيدة صحيحة. أجـري تنميط جيني للمجموعتين من أجل تعيين تعدد أشكال نوكليوتيد مفرد بوساطة تفاعل البوليميراز التسلسلي وتحليل تعدد أشكال الشدف مقيدة الطول Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) باستخدام إنزيم BsmAI. كان تواتر الأنماط الوراثية AA، AG، GG لدى مجموعة المريضات 70%، 25.7%، 4.3%، على الترتيب، بينما كان تواترها لدى المجموعة الشاهدة 80%، 20%، 0%، على الترتيب. وهذا الاختلاف في التوزع بين المريضات والشواهد لم يكن معتداً به إحصائياً (P>0.05). أظهرت دراستنا عدم وجود ترابط بين التعدد الشكلي BsmAI لجين الـ Her2 وسرطان الثدي.   Breast cancer is a major public health problem around the world. It results from genetic and environmental factors, leading to the accumulation of mutations in essential genes. The human epidermal growth factor receptor 2 (Her2) plays an important role in the development of this neoplasm, and genetic alterations in this gene, such as point mutations and polymorphisms have been detected in breast cancer patients. This study aimed to investigate association between Her2 polymorphism and the genetic susceptibility to breast cancer in Syrian women. The study included 100 women,70 of them suffer from breast cancer, while 30 of them were healthy. Both groups were genotyped for single nucleotide polymorphism by polymerase chain reaction, and restriction fragment length polymorphism analysis by using BsmAI enzyme. The frequencies of AA,AG and GG genotypes (BsmAI polymorphism) in patients were 70%, 25.7% and 4.3% respectively. While, in control groups their frequency was 80%, 20% and 0%,respectively. This difference in distribution between patients and controls wasn`t statistically significant (P > 0.05). Our study showed that there was not an association between Her2 genotype and breast cancer risk.   المقدمة Introduction  سرطان الثدي آفة خبيثة يمكن أن تنشأ على حساب أي نسيج موجود في الثدي، حيث تتميز الخلايا بنمو خارج عن السيطرة. تضم الأنواع النسيجية لسرطان الثدي: النمط القنيوي Ductal يقسم إلى (السرطانة القنيوية المُوضّعة (DCIS) Ductal Carcinoma in Situ والسرطانة القنيوية الغازية Invasive Ductal Carcinoma (IDC) وهو يشكل حوالي 70% من سرطانات الثدي)، والنمط الفصيصي Lobular ويُقسم إلى (السرطانة الفصيصية الموضعة (LCIS) Lobular Carcinoma in Situ والسرطانة الفصيصية الغازية (ILC) Invasive Lobular Carcinoma) (1، 2). يعد سرطان الثدي أكثر السرطانات شيوعاً لدى النساء في العالم، حيث يشكل 30-25% من إجمالي حالات السرطان (3، 4). أما في العالم العربي فإن معدل الإصابة يُعد منخفضاً إذا ما قورن بأوروبا وأمريكا، لكن هذه النسبة في تزايد مستمر. إن سرطان الثدي من أكثر السرطانات انتشاراً لدى النساء العربيات حيث يشكل 14-42% من إجمالي حالات السرطان لدى نساء الوطن العربي (4، 5). نشرت المنظمة الدولية لأبحاث السرطان International Agency for Research on Cancer والتابعة لمنظمة الصحة العالمية World Health Organization (WHO) على موقعها على الانترنت إحصائية لسرطان الثدي في سورية عام 2012 http://globocan.iarc.frPages- fact sheets population.aspx، حيث يعد سرطان الثدي أكثر السرطانات انتشاراً لدى النساء في سورية بمعدل %36.4، كما بلغ معدل الوفيات الناجمة عنه 24.8%. يرتبط سرطان الثدي بعمر المرأة، إذ يشكل %5 فقط من مجموع السرطانات التي تصيب النساء تحت سن الـ 40 عاماً، كما أنه يحـدث لدى النساء بتواتر أعلى بمقدار150 مرة تقريباً مما هــو عليه لدى الرجال (6). توجد عدة أنواع لعلاج سرطان الثدي وهي العلاج الموضعي Local treatment ويتضمن الجراحة والعلاج الإشعاعي، والعلاج الجهازي Systemic treatment ويتضمن المعالجة الكيميائية والهرمونية والموجهة (7). إلى الآن لم يجرِ التعرف على الأسباب الرئيسية لسرطان الثدي ولكن هنالك العديد من العوامل المؤهبة للإصابة به كالعوامل الوراثية والهرمونية والبيئية (8). أحد أهم الجينات التي تمت دراستها في هذا المجال هي مستقبل عامل النمو البطاني البشري 2 Her2)) الذي جرى تصنيفه كمؤشر إنذاري جزيئي ومن الممكن استهدافه بالمعالجة. يجري التعبير عن الـ Her2 في العديد من الأنسجة، حيث يكون دوره الرئيسي تسهيل نمو الخلايا بشكل مفرط وغير منضبط، مما يؤدي إلى تشكل الأورام (9). إن التضخيم و/ أو زيادة التعبير هي الآليات الأساسية لتفعيل جين الـ Her2. تحدث التبدلات في هذا الجين في 20-25% من سرطانات الثدي وهي ترتبط بنتائج سريرية غير مرغوبة، فهي ترتبط سريرياً بالأورام السلبية للمستقبلات الهرمونية، ومعدل عالٍ من التكاثر الخلوي (10)، وانخفاض الاستجابة للمعالجة الكيميائية والهرمونية وبالتالي نمو الورم بشكل أسرع وخيارات علاجية أقل، وزيادة احتمال عودة الورم أو تطور النقائل، مما يؤدي إلى التصرف العدائي للورم وإنذار سيئ لسرطان الثدي (11). يوجد تباين في نتائج الأبحاث المجراة على الارتباط المحتمل بين سرطان الثدي لدى النساء والنمط الجيني للـ Her2، حيث يمكن أن يعود هذا التباين في نتائج الدراسات إلى المجموعات العرقية المختلفة والتوزعات السكانية الجغرافية المختلفة (11). إن مجموعة العوامل السابقة بالإضافة إلى عدم وجود دراسات تدرس الارتباط بين التعدد الشكلي لجين الـ Her2 وسرطان الثدي في سورية، دفعنا إلى إجراء هذه الدراسة للاستقصاء عن الارتباط بين التعدد الشكلي BsmAI لجين الـ Her2 وحدوث سرطان الثدي لدى النساء في سورية.   المواد والطرق Materials and Methods  صممت هذه الدراسة لتكون دراسة حالة شاهد مقطعية Cross-Sectional case control study. أجريت هذه الدراسة في مستشفى البيروني والمواساة في الفترة الواقعة بين 9/7/2016 حتى 27/9/2016. شملت هذه الدراسة 100 سيدة وكان متوسط أعمارهن ± الانحراف المعياري: 50.62±2.51 عاماً. كان من بينهن 70 سيدة مشخصة بسرطان الثدي ومعالجة، و30 سيدة صحيحات ظاهرياً. جرى تقديم شروح وافية عن الدراسة للمشتركات جميعهن، كما جرى استبعاد النساء المصابات بنمط آخر من السرطان. الاعتيان Sampling بُزل 2.5 مل من الدم الوريدي على أنبوب يحوي مضاد تخثر EDTA من كل امرأة مشاركة في الدراسة، ثم أُجريت عملية استخلاص الدنا DNA يدوياً باستخدام اليوريا كمادة ممسخة للبروتين ومثبطة للـ DNase (12، 13) من العينات مباشرةً بعد السحب. التنميط الوراثي Genotyping حُفظ الدنا المعزول بدرجة حرارة -20C? إلى حين إجراء تفاعل البوليميراز التسلسلي Polymerase Chain Reaction (PCR) وتقصي وجود تعددات شكلية اعتماداً على تعدد أشكال الشدف مقيدة الطول restriction fragment length polymorphism. ي تفاعل الـ PCR باستخدام جهاز Thermal Cycler Biocycler TC-S لشركة Boeco Germany)). ضُخِمت منطقة محددة من جين الـ Her2 يبلغ طولها bp 148 باستخدام مشرعين مُنقيين بتقنية HPLC لشركة Euro Fins Genomics الألمانية Germany، حيث استخدم المشرعين (10): For 5'-AGAGCGCCAGCCCTCTGACGTCCAT -3' Rev 5'-TCCGTTTCCTGCAGCAGTCTCCGCA -3' وعتيدة PCR Master Mix ×1.1 لشركة Genedirex الماليزية Malaysia. اعتمِد البرنامج الحراري التالي في عملية التضخيم: التمسخ البدئي بدرجة 94 C? لمدة 5 د. ثم أتبعت بـ 35 دورة (94 C? لمدة 1 د. و 62 C? لمدة 1 د. و 72 C?لمدة 1 د.) وبعدها الاستطالة النهائية بدرجة 72 C? لمدة 7 د. بعد التضخيم هُضمت شدف الدنا المُضخمة باستخدام إنزيم BsmAI لشركة Thermo scientific USA)) بدرجة 37 C?لمدة 5 ساعات ثم رُحلت العينات على هلامة الأغاروز 3% لمدة ساعة باستخدام جهاز رحلان أفقي لشركة Pequlab الألمانية Germany. حُددت الأنماط الجينية بوساطة حجرة إظهار بالأشعة فوق البنفسجية من شركةCleaver scientific ltd البريطانية (UK)، وأشير إلى عدم وجود موقع اقتطاع متماثل الزيجوت بـ AA وظهور عصابة واحدة بطول bp 148، أما وجود موقع اقتطاع متغاير الزيجوت فأشير له بـ AG وظهور ثلاث عصابات بأطوال مختلفة (32، 116، 148 bp) ووجود موقع اقتطاع متماثل الزيجوت بـ GG وظهور عصابتين فقط بطولين مختلفين (32، 116bp ). الدراسة الإحصائية Statistical analysis جرى تحليل النتائج إحصائياً باستخدام برنامجي IBM SPSS statistics version 22 وMicrosoft office Excel 2013، حيث جرى تطبيق اختبار كاي مربع Chi-square لمقارنة توزع الأنماط الوراثية وتوزع الألائل للتعدد الشكلي BsmAI بين مجموعة المريضات والمجموعة الشاهدة. وجرى اعتماد فاصل الموثوقية Confidence Interval مساوياً لـ 95% وقيمة مستوى الدلالة أقل من 0.05 (P<0.05). النتائج Results جرى استخدام إنزيم الاقتطاع BsmAI في التحليل الوراثي Genotypic analysis ونتج عن ذلك ثلاثة أنماط جينية GG,AG,AA. ويبين الشكلان 1 و2 نتائج تفاعل الـ PCR ونتائج الهضم بإنزيم BsmAI بعد الترحيل على هلامة الأغاروز 3%، وعُرِض تواتر الأليلات والأنماط الجينية لمجموعتي الدراسة في الجدول 1. كانت تكرارية الأنماط GG, AG, AA لدى مجموعة المريضات 70% و25.7% و4.3%، أما بالنسبة للمجموعة الشاهدة فكانت التكرارية 80% و20% و0%، على الترتيب. ولتحديد أي الأليلين (A أو G) مرتبط مع سرطان الثدي، أُجربت المقارنة بين الأليل A الكلي والأليل G الكلي بين مجموعة المريضات والمجموعة الشاهدة وكانت قيمة P تساوي 0.195.   يظهر البئر M واصماً شاهداً لقياس طول شدف الـDNA، بينما تمثل الابار 1،2،3،4،5،6 ناتج تفاعل الـPCR، حيث كان طول القطعة المضخمة bp148. يظهر البئر M واصماً شاهداً لقياس طول شدف الـDNA. تمثل الآبار 1، 2، 4، 7، 8، 9، 10 النمط الجيني AA متماثل الزيجوت (عدم جود موقع اقتطاع بإنزيم BsmAI) وتظهر عصابة واحدة بطول 148 bp، ويمثل البئران 3 و5 النمط الجيني AG متخالف الزيجوت لتظهر ثلاث عصابات bp148، 116 bp، bp 32، بينما يمثل البئر 6 النمط الجيني GG متماثل الزيجوت، حيث تظهر عصابتان 116 bp و 32 bp. عند دراسة توزع النساء المشتركات بالدراسة وفقاً لأنماطهن الجينية (AA مقارنة مع AG) تبين أن سرطان الثدي مرتبط بشكل أكبر مع النمط الجيني AG، حيث كانت 25.7% من السيدات اللاتي يعانين من سرطان الثدي من النمط الجيني AG مقابل 20% من المجموعة الشاهدة. وعند تطبيق اختبار كاي مربع تبين أن هذا الفارق لا يعتد به إحصائياً (P = 0.469) وكانت قيمة OR=0.681. وبالمثل لدى دراسة توزع الألائل عند المشتركات بالدراسة (A مع G)، ارتبط الأليل G باختطار أكبر لسرطان الثدي، حيث كانت نسبته لدى مجموعة المريضات 17.1% و10% لدى المجموعة الشاهدة. وعند تطبيق اختبار كاي مربع تبين أن هذا الفارق لا يعتد به إحصائياً (P = 0.195).   المناقشة Discussion  يعد سرطان الثدي من أهم المشاكل الصحية في عصرنا، خصوصاً مع الاتجاه إلى تحسين الرعاية الصحية. ينتج هذا المرض متعدد العوامل عن تآثر العديد من العوامل الهرمونية والجينية والبيئية (8)، حيث إن وجود قصة عائلية لسرطان الثدي يشير إلى وجود مؤهب وراثي لهذا المرض. ويعد جين الـ Her2 واحداً من أهم الجينات المرشحة candidate gene للتدخل في إمراضية سرطان الثدي وإنذاره السيء، فجين Her2 يتوضع على الموقع الصبغي 17q ويحتوي العديد من مناطق التعددات الشكلية، بما فيها BsmAI التي يمكن أن تؤثر في فعالية البروتين، حيث تزيد فعالية التيروزين كيناز وعملية التشكيل المثنوي بالإضافةً إلى زيادة عمليات الفسفرة، مما يؤدي إلى زيادة التحول في الخلايا (9). قمنا في هذا البحث بدراسة التعدد الشكلي لجين HER2 وعلاقته بسرطان الثدي. حيث تلعب عائلة مستقبل عامل النمو البطاني البشري (EGFR) من بين المستقبلات دوراً مركزياً في إحداث الإمراضية في العديد من السرطانات فهي تنظم نمو، بُقيا وتمايز الخلايا عن طريق المشاركة بمسالك نقل الإشارة (11). إن حوالي 10- 40% من سرطانات الثدي تحدث بسبب تبدلات في هذا الجين، حيث ربطت العديد من البراهين اختطار سرطان الثدي بوجود تعدد شكلي في الرامز 655 من جين الـ Her2 في المنطقة المرمزة منه (14). يجري التعبير عن الـ Her2 في العديد من الأنسجة، حيث يكون دوره الرئيسي تسهيل نمو الخلايا بشكل مفرط وغير منضبط مما يؤدي إلى تشكل الأورام (9). وزيادة التعبير عن الـ Her2 تجعل سرطان الثدي أكثر عدائية و مقاومة للعلاج ويكون إنذاره أسوأ (11). على الرغم من أنه لم توجد في دراستنا علاقة بين النمط الجيني للـ Her2 وسرطان الثدي، باعتبار أن P > 0.05، إلا أن نسب الأنماط الجينية لدينا كانت متوافقة مع النسب في أغلب الدراسات، حيث كانت نسبة النمط الجيني AG (متغاير الزيجوت) في دراستنا 25.7% لدى مجموعة المريضات و20% لدى المجموعة الشاهدة. بينما كانت نسبة النمط الجيني GG (متماثل الزيجوت مع وجود موقع القطع) 4.3% لدى مجموعة المريضات و0% لدى المجموعة الشاهدة، حيث ارتبط أليل الفالين (G) باختطار أكبر لسرطان الثدي. توافقت دراستنا مع دراسة Xie وزملائه عام 2000 (10)، حيث كانت نسبة النمط الجيني AG 25.1% لدى مجموعة المريضات و21.7% لدى المجموعة الشاهدة، بينما كانت نسبة النمط الجيني GG 3.2% و0.3%، على الترتيب. توافقت دراستنا أيضاً مع كل من دراسة Pinto D. وزملائه عام 2004 (8)، ودراسة Frank B. 2005 وزملائه عام 2005 (15)، ودراسةKim NK. وزملائه عام(16) 2005 ، ودراسةBenusiglio PR. وزملائه عام 2005 (17)، ودراسةDanko J. وزملائه عام 2006 (18)، ودراسة Siddig A. وزملائه عام 2008 (19). بينما تخالفت دراستنا مع دراسة Michael N. وزملائه عام 2005 (20) في الولايات المتحدة، ودراسة Cox DG. وزملائه عام 2005 (21) في القوقاز. يمكن أن نفسر هذا الاختلاف في النتائج في ضوء الاختلافات في الخلفية العرقية وحجم العينات في الدراسات المختلفة، بالإضافة إلى التمازج والاختلاط السكاني.   الاستنتاج Conclusion  أظهرت هذه الدراسة عدم وجود ارتباط بين التعدد الشكلي BsmAI لجين الـ Her2 مع الإصابة بسرطان الثدي لدى النساء السوريات.   المراجع References  1. Schmale L, Liu S, Rayhanabad J, Ressell C. and Sener S. Ductal carcinoma in situ (DCIS) of the breast: perspectives on biology and controversies in current management. J. of Surgical Oncol. 2012, 105: 20-212. 2. Weigelta B; Geyerb F. and Reis-Filhob J. Histological types of breast cancer: how special are they? Molecular oncol. 2010, 4: 192-208. 3. Porter P. Global trends in breast cancer incidence and mortality. Salud Publica Mex. 2009, 51(2): 6-141. 4. Chouchane L, Boussen H. and Sastry K. Breast cancer in arab populations: molecular characteristics and disease management implications. Lancet Oncol. 2013, 14: 24-417. 5. El Saghir N and Abulkhair O. Epidemiology,prevention and management guidelines for breast cancer in arab countries. Pan Arab J oncol. 2010, 3(1): 8-12. 6. Rosen EM, Fan S, Pestell RG and Goldberg ID. BRCA1 gene in breast cancer. J Cell physiology. 2003; 196:19. 7. American Cancer Society. Treating Breast Cancer, 2017. 8. Pinto D, Vasconcelos A, Costa S Pereira D, Rodrigues H, Lopes C and Medeiros R. Her2 Polymorphism and Brast Cancer Risk in Portugal. European Journal of Cancer Prevention, 2004; 13: 177-181. 9. Iqbal Ni and Iqbal Na. Human Epidermal Growth Factor Receptor 2(Her2) in Cancers: Overexpression and Therapeutic Implications. Molecular Biology International, 2014 Aug; 14: 357-366. 10. Xie D, Shu XO, Dang Z, Wen WQ, Craek K, Dai Q, Gao YT, Jin F and Zheng W. Population-Based, case-control study of Her2 Genetic Polymorphism and Breast Cancer Risk. Journal of the National Cancer Institute, 2000 Dec; 92: 412-417. 11. Santin AD, Bellon S, Roman JJ, Mckenney JK and Pecorelli S. Trastuzumab Treatment in Patients with Advanced or Recurrent Endothelial Carcinoma Overexpressing Her2/neu. International journal of Gynaecology and Obstetrics, 2008 Aug;102(2): 31-128. 12. Dashek WV. Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology. 1997. 13. Ruddon RW. Cancer Biology fourth edition. Oxford University press. 2007; 344-346. 14. Buiarto BR and Desriani. Detection of Her2 Gene Polymorphismin Breast Cancer: PCR, Optimization Study. International Seminar on Pharmacentics, 2015, 84: 103-111. 15. Frank B, Hemmink K, Wirtenberg M, Bermejo JL, Bugert P, Klaes R, Schmutzler RK and Burwinkel B. The ERBB2 variant Ile655Val is associated with an increased familial breast cancer. US National library of Medicine, 2005 Mar; 26(3): 7-643. 16. Kim NK, Oh D, Kim SH, Park MJ, Jung MY, Kang H, Kim SG, Lee KP and Lee KS. Her2 genotype and breast cancer progression in Korean population". US National library of Medicine, 2005 Feb; 55(2): 48-52. 17. Benusiglio PR, Lesueur F, Luccarini C, Conroy DM, Shah M,Easton DF, Day NE,Dunning AM, Pharoah PD and Pander BA. Common ERBB2 polymorphisms and risk of breast cancer in a white British population: a case-control study. US National library of Medicine,2005; 7(2): 9-204. 18. Danko J, Zubor P, Vojvodova A, Kajo K, Szunyogh N, Lasabova Z, Biringer K, Visnovsky J, Dokus K, Galajda P and Plank L. HER2 Ile655Val polymorphism in association with breast cancer risk: a population based case-control study in Slovakia. US National library of Medicine, 2006; 53(1): 49-55. 19 . Siddig A, Mohamed AO, Kamal H, Awad S, Hassan AH, Zilahi E, Al-Haj M, Bemsen R and Adem A. HER-2\neu Ile655Val polymorphism and the risk of breast cancer. US National library of Medicine, 2008 Sep; 1138: 84-94. 20. Michael N, Stephanie EN, John MH and Amy T. A case-control study of the HER2 Ile655Val polymorphism in relation to risk of invasive breast cancer. US National library of Medicine, 2005; 7(3): R357-364. 21. Cox DG, Hankinso SE and Hunter DJ. The erbB2\Her2\ neu receptor polymorphism Ile655Val and breast cancer risk. Pharmacogenet Genomics. 2005 Jul; 15(7): 50-447.     المجلد 8 , العدد 5 , ربيع الآخر 1439 - كانون الثاني (يناير) 2018 SCLA