بحث في أعداد المجلة الجملة   المؤلف

المجلد 8 , العدد 5 , ربيع الآخر 1439 - كانون الثاني (يناير) 2018   تواتر التعدد الشكلي للرامزة 72 لجين p53 لدى مريضات سرطان ثدي في مستشفيات جامعة دمشق Frequency of Codon72 Polymorphism of Gene P53 in Breast Cancer Patients in Damascus University Hospitals د. أسماء الصياد و أ. د. شادن حداد Al-Sayyad A. and Haddad Sh. كلية الصيدلة، جامعة دمشق Faculty of Pharmacy, Damascus University الملخص Abstract يعد سرطان الثدي السرطان الأكثر شيوعاً لدى النساء في العالم والوطن العربي، كما يعد الأكثر تسبباً في وفاة النساء المصابات بالسرطان حول العالم. تسهم العوامل الوراثية في اختطار السرطان. ومن أهم الجينات المؤثرة في اختطار السرطان جين p53، حيث وجد طافراً في 50% من السرطانات. وإن التعدد الشكلي R72P هو الأعلى تواتراً للتعددات الشكلية لجين P53 وهنالك الكثير من الدراسات التي ربطت p53 R72P بحدوث السرطان. هدفت هذه الدراسة إلى استقصاء الارتباط بين التعدد الشكلي لجين البروتين الكابح للورم p53 R72P والاستعداد الجيني للإصابة بسرطان الثدي لدى نساء سوريات مصابات بسرطان الثدي. شملت الدراسة 100 سيدة، 70 سيدة منهن يعانين من سرطان الثدي و30 سيدة صحيحة. أجري تنميط جيني لكلا المجموعتين، من أجل التعدد الشكلي مفرد النوكليوتيد، بإجراء تفاعل البوليميراز التسلسلي وتحليل تعدد أشكال الشدف مقيدة الطول (RFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism باستخدام إنزيم BstUI. كان تواتر الأنماط الوراثية GG ,GC ,CC (التعدد الشكلي R72P) لدى مجموعة المرضى 48.6%، 21.4%، 30%، على الترتيب. بينما كان تواترهم لدى المجموعة الشاهدة 43.3% ,43.3% ,13.3%، على الترتيب. كان هذا الاختلاف في التوزع بين المريضات والشواهد معتداً به إحصائياً (P = 0.048). كان النمط الجيني GC مرتبطاً مع الاختطار الأقل لحدوث سرطان الثدي. أظهرت دراستنا أن هنالك علاقة بين اختطار سرطان الثدي والتعدد الشكلي R72P لجين الـ P53 لدى مجموعة سيدات سوريات مصابات بسرطان الثدي.   Breast cancer is the most common cancer in the world and Arab land, and is responsible for most of cancer deaths of women around the world. Genetic factors contribute to cancer risk. One of the genes that affect cancer risk is P53 gene, as it is found to be mutated in about 50% of cancers in total. R72P polymorphism has the highest frequency of p53 polymorphisms and there are a lot of studies that associate p53R72P with cancer. The study aimed of to investigate the association between p53 R72P polymorphism and the genetic susceptibility to breast cancer in Syrian women with breast cancer. The study included 100 women, 70 of them suffer from breast cancer, while 30 of them were healthy. Both groups were genotyped, for single nucleotide polymorphism, by polymerase chain reaction, and restriction fragment length polymorphism analysis by using BstUI enzyme. The frequencies of GG, GC and CC genotypes (R72P polymorphism) in patients were 48.6%, 21.4% and 30%, respectively. While, in control groups their frequency was 43.3%, 43.3% and 13.3%, respectively. This difference in distribution between patients and controls was statistically significant (P=0.048). GC genotype was associated with the lowest risk of Breast cancer. Our study shows that there is an association between p53 R72P polymorphism and breast cancer risk in a group of breast cancer Syrian women.   المقدمة Introduction  يعد سرطان الثدي السرطان الأكثر شيوعاً لدى النساء في العالم والوطن العربي، وهو يمثل حوالي %25 من مجموع الإصابات بالسرطان لدى النساء، كما يعد الأكثر تسبباً في وفاة النساء المصابات بالسرطان حول العالم (1-3). كذلك يعد سرطان الثدي السرطان الأكثر انتشاراً لدى النساء السوريات، وبحسب تقرير منظمة الصحة العالمية المنشور في آذار 2011 يعد سرطان الثدي من أسباب الوفاة العشرين الأولى في سورية، حيث وصل عدد الوفيات في سورية بسبب سرطان الثدي في عام 2011 إلى 667 حالة وفاة، أي ما يعادل %1.02 من الوفيات الكلية (4). هنالك العديد من العوامل التي تزيد من اختطار حدوث سرطان الثدي لدى النساء، منها التقدم في العمر والعرق الأبيض والسمنة بعد سن الإياس وتناول الكحول واستخدام موانع الحمل الفموية والمعالجة الهرمونية المعاوضة، ووجود قصة عائلية للإصابة بسرطان الثدي؛ فالعوامل الجينية تؤثر بشكل كبير في اختطار سرطان الثدي، حيث وجدت جينات طافرة موروثة من أحد الأبوين في 5-7% من حالات سرطان الثدي (1، 5، 6). يعد جين P53 الكابح للورم من أهم الجينات المرتبطة بالسرطان، حيث يوجد طافراً في أكثر من 50% من السرطانات بشكل عام، وفي 20% من حالات سرطان الثدي (7)، وإن أكثر الطفرات التي يتعرض لها هي طفرات نقطية وتم ربط بعض هذه الطفرات بتأثير مهم على وظيفة البروتين الكابحة للورم (8). يلعب بروتين p53 دوراً مهماً في تنظيم الدورة الخلوية وكعامل انتساخ وله دور في إصلاح الدنا وتثبيط نمو الخلايا وتحريض الاستماتة (9) وكذلك شيوخة الخلايا senescence، والفعالية الاستقلابية ضمن الخلية التي تدعم نمو واستمرار الورم (10)، وكذلك توليد الأوعية الدموية angiogenesis وتمايز الخلايا والاستجابة المناعية (11، 12). عند أذية المادة الوراثية في الخلية ترتفع مستويات البروتين p53 ضمن الخلية والذي يقوم بإبقاء وحصر الخلية في الطور G1، وإصلاح الدنا المتضرر قبل الدخول في الطور S. أما في حال كانت أذية المادة الوراثية كبيرة وغير قابلة للعكس، يقوم البروتين p53 بتحريض الاستماتة الخلوية. وبالتالي فإن غياب وظيفة هذا البروتين يسمح بتكاثر الخلايا ذات المادة الوراثية المتضررة، مما يسمح بإمكانية تشكل بدايات الورم (11، 13، 14). إن التعدد الشكلي R72P يعد من أكثر التعددات الشكلية الناتجة عن طفرة نقطية في جين p53 تواتراً ودراسة. وتختلف نسبة هذا التعدد الشكلي حسب المجموعات العرقية ويؤثر على قابلية حدوث السرطان (6). يرمز الأليل C للبرولين ويرمز الأليل G للأرجينين. وتظهر الدراسات المجراة على الخطوط الخلوية السرطانية اختلافات بين الشكلين في التوضع داخل المتقدرات mitochondria، في التأثير على الاستماتة والدورة الخلوية وكذلك على إصلاح الدنا وإيقاف نمو الخلية وتفعيل انتساخ الجينات (8)، فبينما يتمتع الشكل p53-Pro72 بقدرة أكبر على تفعيل الجينات الهدف ويتفاعل بشكل أقل مع p73، يتميز الشكل p53-Arg72 بقدرة أكبر على إحداث الاستماتة (15). وتوجد العديد من الدراسات حول تأثير هذا التعدد الشكلي على حدوث السرطان وتطور المرض وإنذاره، ولكن نتائج هذه الدراسات كانت متباينة (8). إن مجموعة العوامل السابقة بالإضافة إلى عدم وجود دراسات للارتباط بين التعدد الشكلي لجين p53 وسرطان الثدي لدى النساء في سورية، دفعنا إلى إجراء هذه الدراسة للاستقصاء عن الارتباط بين التعدد الشكلي R72P لجين p53 وسرطان الثدي لدى النساء في سورية.   المواد والطرق Materials and Methods  أجريت هذه الدراسة المقطعية Cross Sectional Study في مستشفيي البيروني والمواساة في الفترة الواقعة بين 9/ 7/ 2016 و27/ 9/ 2016. شملت هذه الدراسة 100 سيدة متوسط أعمارهن±الانحراف المعياري: 50.62±2.51 عاماً. كان بينهن 70 سيدة مريضة بسرطان الثدي و30 سيدة صحيحة ظاهرياً. جرى تقديم شروح وافية عن الدراسة وتوقيع الموافقة المستنيرة من المشتركات في الدراسة، كما جرى استبعاد النساء المصابات بنمط آخر من السرطان.   جمع العينات Sample Collecting  بُزل 3 مل من الدم الوريدي على أنبوب يحوي مضاد تخثر EDTA من كل مشاركة في الدراسة، ثم جرت عملية استخلاص الدنا من العينات خلال يومين من تاريخ السحب بطريقة يدوية تعتمد على تخريب البروتينات باليوريا. التنميط الجيني Genotyping حُفظ الدنا المعزول في درجة حرارة -20°C حتى القيام بإجراء تفاعل البوليميراز السلسلي Polymerase Chain Reaction (PCR) وتقصي وجود تعددات شكلية اعتماداً على تعدد أشكال الشدف مقيدة الطول (RFLP)restriction fragment length polymorphism. أجري تفاعل الـ PCR باستخدام جهاز Thermal Cycler T100 لشركة Bio-Rad الأمريكية. ضُخِمت منطقة محددة من جين الـ P53 باستخدام مشرعات منقاة بتقنية HPLC لشركة Euro Fins Genomics (Germany)، حيث استخدم المشرعين التاليين (16) والذين يعطيان بعد تفاعل التضخيم ناتجاً نوعياً بطول 199 bp. F :5'-TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA-3' R: 5'-TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC-3' وعتيدة PCR Master Mix ×1.1 لشركة Genedirex Malaysia)). اعتمد البرنامج الحراري التالي في عملية التضخيم: التمسخ البدئي بدرجة 94°C لمدة 5 د ثم أتبعت بـ 35 دورة (94°C لمدة 30 ثا و55°C لمدة 1 د و72°C لمدة 1 د. وبعدها الاستطالة النهائية بدرجة 72°C لمدة 1 د. جرى التأكد من ناتج التضخيم بالرحلان الكهربائي على هلامة الأغاروز 1.5%. بعد التضخيم هُضمت شدف الدنا المضخمة باستخدام إنزيم BstUI لشركة New England Biolabs England)) بدرجة 60°C لمدة ساعة ونصف ثم رُحلت العينات على هلامة الاغاروز 3% لمدة ساعة باستخدام جهاز رحلان أفقي لشركة Pequlab (Germany). حُددت الأنماط الجينية بواسطة حجرة إظهار بالأشعة فوق البنفسجية من شركة Cleaver scientific Itd (UK)، وأشير إلى عدم وجود موقع اقتطاع متماثل الزيجوت بـ CC وظهور عصابة واحدة بطولbp 199، أما وجود موقع اقتطاع متغاير الزيجوت فأشير له بـ GC وظهور ثلاث عصابات بأطوال مختلفة (bp 86-113-199)، ووجود موقع اقتطاع متماثل الزيجوت بـ GG وظهور عصابتين فقط بطولين مختلفين (bp 86-113). الدراسة الإحصائية Statistical analysis جرى تحليل النتائج إحصائيا باستخدام برنامجي IBM SPSS statistics version 22 وMicrosoft office Excel 2013، حيث جرى تطبيق اختبار كاي مربع Chi-square لمقارنة توزع الأنماط الوراثية وتوزع الألائل للتعدد الشكلي R72P بين مجموعة المرضى والمجموعة الشاهدة. وجرى اعتماد فاصل الموثوقية Confidence Interval مساوياً %95 وقيمة مستوى الدلالة أقل من 0.05 (P<0.05).   النتائج Results  جرى استخدام إنزيم الاقتطاع BstUI في التحليل الجيني Genotypic analysis ونتج عن ذلك ثلاثة أنماط جينية، النمط متماثل الزيجوت CC ويظهر بشكل عصابة واحدة بطول 199 bp، النمط متماثل الزيجوت GG ويظهر بشكل عصابتين بطول 113 bp و86 bp، والنمط متغاير الزيجوت GC ويظهر بشكل ثلاث عصابات بطول 199 bp و113 bp و86 bp. ويبين الشكلان 1 و2 نتائج تفاعل الـ PCR ونتائج الهضم بإنزيم BstUI بعد الترحيل على هلامة الأغاروز 1.5% و3%، على الترتيب، وعُرِض تواتر الأليلات والأنماط الجينية لمجموعتي الدراسة (الجدول 1). كانت تكرارية الأنماط CC, GC, GG لدى مجموعة المرضى %48.6 و%21.4 و%30، أما بالنسبة للمجموعة الشاهدة فكانت التكرارية %43.3 و%43.3 و%13.3 ، على الترتيب. كان الاختلاف في توزع الأنماط الجينية بين مجموعة المريضات والمجموعة الشاهدة معتداً به إحصائياً (P = 0.048). ولتحديد أي الأليلين (G أو C) مرتبط مع سرطان الثدي، أُجريت المقارنة بين الأليل G الكلي والأليل C الكلي بين مجموعة المرضى والمجموعة الشاهدة وكانت قيمة 0.448=P.   عند دراسة توزع النساء المشتركات بالدراسة وفقاً لأنماطهنّ الجينية (GC مقارنة مع CC + GG) تبين أن النمط الجيني GC أقل اختطاراً لحدوث سرطان الثدي، حيث كانت 21.4% من السيدات اللاتي يعانين من سرطان الثدي من النمط الجيني GC مقابل 43.3% من المجموعة الشاهدة. وكانت قيمة OR=0.3566 وقيمة P=0.0282 وهي معتد بها إحصائياً (الجدول 2).  المناقشة Discussion   يعد سرطان الثدي من أكثر المشاكل الصحية في عصرنا فهو السرطان الأكثر شيوعا لدى النساء في العالم والوطن العربي وفي سورية ويعد الأكثر تسببا في وفاة النساء المصابات بالسرطان حول العالم (1، 2). ينتج هذا المرض متعدد العوامل عن تآثر العديد من العوامل الهرمونية والجينية والبيئية. ويعد الجين الكابح للورم P53 واحدا ً من أهم الجينات المؤثرة في إمراضية سرطان الثدي، حيث يلعب دوراً هاماً في تنظيم الدورة الخلوية وله دور في إصلاح الدنا وتثبيط نمو الخلايا وتحريض الاستماتة، ويوجد طافراً في 20% من الحالات. (7، 9). يوجد في جين p53 العديد من التعددات الشكلية بما فيها التعدد الشكلي R72P والذي يوجد دليل واضح على تأثيره على فعالية بروتين p53 (8) وعلى القابلية لحدوث السرطان (7). هنالك العديد من الدراسات التي قيمت اختطار كل من هذين الشكلين على حدوث السرطان وعلى سن تطور المرض وعلى الإنذار، لكن لا يوجد إلى الآن دليل حاسم يشير إلى الشكل المفضل والأحسن إنذاراً، حيث كانت نتائج تلك الدراسات متباينة (8). لدى دراسة التعدد الشكلي R72P وجدنا أن هنالك اختلافا في توزع الأنماط الجينية بين مجموعة المريضات والصحيحات (P=0.048). وعند تقسيم مجموعتي الدراسة اعتماداً على نمطهم الجيني، GC مقابل GG+CC، تبين أن النمط متغاير الزيجوت أقل تكرارية لدى المصابات (21.4%)، وقد يؤمن عامل وقاية ضد سرطان الثدي، حيث كانت P=0.0282 (OR= 0.3566 (0.1420 to 0.8954))، وهذا ما توافق مع دراسةMabrouk I. et al., (17) في تونس عام 2003 ودراسةAl-Qasem et al., (18) في السعودية عام 2012. وتخالفت دراستنا مع دراسة Hou J. et al. (19) في الصين عام 2013، ودراسة Irshad M. et al. (20) في السعودية عام 2015، والتي بينت أنه لا علاقة لأي من الأنماط الجينية المدروسة بزيادة أو إنقاص اختطار سرطان الثدي، ودراسة Soleimani A. et al. (21) عام 2016 في إيران، والتي تظهر أثراً حامياً ضد سرطان الثدي للنمط الجيني pro/pro. يمكن أن نفسر هذا الاختلاف في النتائج بالاختلاف في حجم العينات في الدراسات المختلفة. وإن ارتباط النمط الجيني G/C مع تواتر أقل لحدوث سرطان الثدي، قد يعود إلى الأثر الإيجابي الذي يقدمه وجود كلا الشكلين في الخلية، فبينما يتمتع الشكل p53-P72 بقدرة أكبر على تفعيل الجينات الهدف ويتفاعل بشكل أقل مع p73، فإن الشكل p53-R72 يتميز بقدرة أكبر على إحداث الاستماتة. وبالنتيجة فقد بينت هذه الدراسة وجود ارتباط بين سرطان الثدي والتعدد الشكلي R72P لجين P53، حيث أظهرت أن النمط الجيني GC هو الأقل تواتراً لدى المريضات السوريات وارتبط بتواتر أقل لحدوث سرطان الثدي.   المراجع References    1-Rosen E.M; Fan S; Pestell R.G. and Goldberg I.D. BRCA1 gene in breast cancer. J Cell physiology, 196:19, 2003. 2-Martin D; Easton D.F. and Stratton M. Genetic heterogeneity and hormonal risk factors in breast cancer. J Natl Cancer Inst, 92:1126, 2000. 3-http://gco.iarc.fr/today/online-analysis multibars?mode=cancer&mode-population= continents&population=900&sex=2&cancer=29&type=0&statistic=0&prevalence=0&color_palette=default. 4-Lori jardines M.D. Breast cancer overview; risk factors, screening, genetic testing and prevention, multi-displinary approach of cancer. 137-157, 2001. 5-Wooster R. Identification of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. Nature, 378:6559, 789-792, 1995. 6-Ruddon R.W. The Epidemiology of Human Cancer In "Cancer Biology" Oxford university press, 2007. 62-116. 7-Tong D; Kucer E; Stimpfl M; Kolbl H; Lodolter S. and Zeillinger R. Detection of p53 Polymorphism at Codon 72 by PCR and Allele-specific Oligonucleotide Hybridization on Microtiter Plates. Clinical Chemistry, 46:1, 2000. 8-Whibley C; Pharoah P.D. and Hollstein M. P53 polymorphisms: cancer implications. Nat Rev Cancer, 9(2):95-107, 2009. 9-Flammann H.T. and Kuhn H.M. P53 Autoantibodies and Cancer: Specificity, Diagnosis and Monitoring. Elsevier Science B.V. Cancer and Autoimmunity, 2000. 10-Puzio-kuter A.M. The role of p53 in metabolic regulation. Genes Cancer. 2(4): 385-391. 2011. 11-Suzuki K. and Matsubara H. Recent Advances in p53 Research and Cancer Treatment. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2011. 12-Joerger A.C. and Fersht A.R. The p53 pathway: Origins, Inactivation in Cancer, and Emerging Therapeutic Approaches. Annu. Rev. Biochem. 85:28.1–28.30, 2016. 13-Oren M. and Rotter V. Introduction: p53-the first twenty years. Cell. Mol. Life Sci, 55:9–11, 1999. 14-Lane DP. P53 guardian of the genome. Nature, 358:15-16, 1992. 15-Soussi T. Analysis of P53 Gene Alterations In Cancer: A Critical View. In "25 years of p53 research. Hainaut P. and Wiman K.G. Springer Netherlands, 2005. 16-Fan R; Wu M.T; Miller D; Wain J.C; Kelsey K.T; Wiencke J.K. and Christiani D.C. The P53 Codon 72 Polymorphism and Lung Cancer Risk. Cancer Epidemiology, Biomarkers and prevention, 9:1037-1042, 2009. 17-Mabrouk I; Baccouche S; El-Abed R; Mokdad-Gargouri R; Mosbah A; Saïd S; Daoud J; Frikha M; Jlidi R. and Gargouri A. No evidence of correlation between p53 codon 72 polymorphism and risk of bladder or breast carcinoma in Tunisian patients. N. Y. Acad. Sci, 1010:764-70, 2003. 18-Al-Qasem A; Toulimat M; Tulbah A; Elkum N; Altweigeri T. and Aboussekhra A. The p53 codon 72 polymorphism is associated with risk and early onset of breast cancer among Saudi women. Oncol Lett. 3(4): 875–878. 2012. 19-Hou J; Jiang Y; Tang W. and Jia S. P53 codon 72 polymorphism and breast cancer risk: a meta-analysis. Experimental and Therapeutic Medicine, 5: 1397-1402, 2013. 20-Irshad M; Mandal R.K; Al-Drees A; Khalil M.S. and Abdulghani H.M. No Evidence of Association of the Arg72Pro p53 Gene Polymorphism with Cancer Risk in the Saudi Population: a Meta-Analysis. APJCP, 16.14.5663, 2015. 21-Soleimani A; Rahmani Y; Farshchian N; Delpisheh A; Khassi K; Shahmohammadi A. and Amirifard N. The Evaluation of p53 Polymorphism at Condon 72 and Association with Breast Cancer in Iran: A Systematic Review and Meta-analysis. Journal of Cancer Prevention, 21:4, 2006. المجلد 8 , العدد 5 , ربيع الآخر 1439 - كانون الثاني (يناير) 2018 SCLA