استقصاء طفرات الإكسون 11 لجين c-kit لدى عدد من مرضى الورم السَّدويّ المعديّ المعويّ السوريّين المُستجيبين وغير المُستجيبين لـِ Imatinib

Investigation of Exon 11 Mutations in c-kit Gene in a Number of Imatinib Responders and Non-Responders Syrian Gastrointestinal Stromal Tumor Patients

د. نور فرعون و أ.د. فوزة منعم

Pharaon Nour. and Monem Fawza

كلية الصيدلة، جامعة دمشق
Faculty of Pharmacy, Damascus University

الملخص Abstract

الورم السّدويّ المعديّ المعويّ (GIST) ساركوما تنشأ من الطبقة الميزنشيمية في الجدار العضلي للسبيل المعدي المعوي، ولطفرات جين c-kit دور ضالع في نشوء وتطوّر هذا الورم. تُمَثِّل طفرات الإكسون 11 من جين c-kit ثُلُثي هذه الطفرات. يُعدُّ دواء imatinibالخط الأولي لعلاج هذا الورم. وعلى الرُّغم من أنّ أكثر من نصف المرضى يبدون استجابة للعلاج، إلا أن هناك نسبة منهم لايستجيبون له. حيث أن المرضى الذين يُبدون طفرات الإكسون 11 هم الأكثر استجابةً للعلاج. ولما كانت المقاربات الحديثة لعلاج الـ GIST بالـ Imatinib تتطلب تحليلاً لوجود الطفرات على جين c-kit، والتي توجد بشكل رئيسي على الإكسون 11، فقد هدفت دراسَتُنا إلى التحقُّق من وجود أو غياب طفرات الإكسون 11 لدى عدد من المرضى المُستجيبين وغير المُستجيبين لـلـ imatinib. شملت هذه الدراسة الاستعادية سبعة من مرضى الورم السّدويّ (n=7)، أربعة منهم مستجيبين للعلاج (4/7)، وثلاثة مرضى غير مُستجيبين للعلاج (3/7). أُجريَت تفاعلات سَلْسَلة الإكسون 11 لجين c-kit في الدنا المُستَخلص من العينات المحفوظة لهؤلاء المرضى. برهنت دراستُنا وجود طفرات في الإكسون 11 لدى المرضى المُستجيبين وغيابها لدى المرضى غير المُستجيبين للدواء. تقترح نتائجنا ضرورة تبنّي هذا الاستقصاء عند وضع بروتوكول معالجة هؤلاء المرضى.

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is a sarcoma arising from mesenchymal layer in the muscular wall of the gastrointestinal tract.

C-kit gene mutations are involved in the emergence and development of this tumor. Exon 11 mutations of c-kit gene represent two-thirds of these mutations. Imatinib is the first-line treatment for GIST. Although more than half of the patients show a response to the treatment, a proportion of them do not respond. Whereas Patients who show exon 11 mutations are the most responsive to the treatment. Recent approaches for GIST treatment with imatinib request c-kit mutations analysis mainly present on exon 11. Our study aimed to verify the presence or absence of exon 11 mutations in a number of imatinib responsive and non-responsive patients. This retrospective study included seven GIST patients (n=7), four of them were responsive to treatment (4/7) and three patients were not (3/7). Sequencing of exon 11 c-kit gene in DNA extracted from specimens preserved for these patients was performed. Our results proved the presence of exon 11 mutations in responsive patients, and their absence in non-responders. Our findings suggest the necessity of adopting this investigation in setting the protocol of treatment of these patients.

الكلمات المفتاح Key Words: الإكسون 11 في جين c-kit/Exon 11 c-kit gene ، طفرات/Mutations ، الورم السدوي المعدي المعوي/Gastrointestinal Stromal Tumor، الاستجابة للإيماتينيب/Imatinib response .

المقدمة Introduction

الورم السَّدويّ المعديّ المعويّ GIST) Gastrointestinal stromal tumor) ساركوما تنشأ من الطبقة الميزنشيمية في الجدار العضلي للسبيل المعدي المعوي، وبالأخص في المعدة والأمعاء الدقيقة [1]. حيث ينشأ من خلايا كاجال Cajal cells التي تُولد إشارات عصبية تُسبّب في حركته [2]. يُعدُّ من أكثر الأورام الميزنشيمية انتشارا ً[3]. يتميز هذا الورم بالتعبير عن CD117 (c-kit) مستقبل غشائي ينتمي إلى عائلة النمط الثالث من مستقبلات التيروزين كيناز، وهو نتاج جين c-kit proto-oncogene الذي يتوضع على الصبغي الرابع في الموقع 4q12 ويتكون من 21 إكسوناً [4]. جرى تأكيد الدور الضالع لهذا الجين في نشوء وتطور ورم GIST، حيث أن الطفرات التي تنشأ في جين c-kit تكون طفرات مفَعِّلة/ طفرات كسب وظيفة (activating mutations/ gain of function mutation) تُؤدي إلى تفعيل مستمر للمستقبل حتى في غياب اللَّجين Ligand وبالتالي تفعيل سُبل تنبيغ الإشارة التي تُؤدي إلى تكاثر غير منضبطٍ للخلايا ومقاومةٍ للاستماتة [5، 6]. تظهر الطّفرات في جين c-kit في الإكسون 11، الإكسون 9 ونادراً في الإكسون 13 و17. تُشكّل الطفرات المفعِّلة في الإكسون 11 حوالي ثُلثي الحالات (65%) وهي الطفرات الأكثر شيوعاً وتتضمن حذف، إدخال، استبدال، تضاعف أو مزيج مما سبق [7]. يُرمِّز الإكسون 11 للمجال المجاور للغشاء من مستقبلc-kit الذي يمتلك دوراً هاماً في تثبيط المستقبل عند غياب العامل الرابط المُفعّل له، حيث يُشكل بنية ملقط الشعر، تتوضّع هذه البنية بين الفص الصغير والفص الكبير لمجال الكيناز من المستقبل، ممّا يؤدي إلى منعهما من الحركة الضرورية لتفعيل سبييل التّنبيغ الخلوي [8].

وافقت إدارة الغذاء والدواء (FDA) على (Gleevec) Imatinib mesylate كخط أولي لعلاج أورام GIST المنتقلة metastatic GIST بجرعة 400 ملغ يومياً بصورة مستمرة، كما ويُعطى كعلاج مُساعد في أورام GIST الموضّعة Localized GIST بعد العمل الجراحي أيضاً [9]. إنَّ الـ Imatinib mesylate جزيء صغير، وهو مثبط نوعي للنمط الثالث من مستقبلات التيروزين كيناز المتضمنة لـ c-kit. تشبه بنيته بنية ATP، حيث يعمل كمثبط تنافسي للمجال الرابط لـ الأدينوزين ثلاثي الفسفات في مستقبل c-kit، وما ينجم عن ذلك من تثبيط لسُبل تنبيغ الإشارة [10، 11].

تُقيَّم الاستجابة للعلاج كاستجابة كاملة Complete response (CR) عندما يُبدي المريض تراجعاً كاملاً في حجم الآفة الورمية، أو استجابة جزئية Partial response (PR) عندما يكون تراجع حجم الآفة جزئياً. وتُعرَّف عدم الاستجابة للعلاج بأنها مرض مستقرّ Stable disease (SD)عند ثبات موجودات التَّقارير الشعاعية، ومرض مُتقدّم Progressive disease (PD) أي زيادة في حجم الآفة، حسب معايير RECIST (Response Evaluation Criteria In Solid Tumor) [12، 13].

على الرغم من أن أكثر من نصف مرضى GIST يُظهرون استجابة كاملة أو جزئية للعلاج، إلا أن هنالك نسبة من المرضى لا يستجيبون له. حيثُ أظهرت العديد من الدراسات السابقة أنّ المرضى الذين يبدون طفرة على مستوى الإكسون 11 في جين c-kit هم أكثر استجابة للعلاج مقارنةً مع بقية المرضى [14-19]. ولما كانت المقاربات الحديثة لعلاج الـ GIST بالـ Imatinib تتطلب استقصاءً لوجود الطفرات على جين c-kit، والتي تتواجد بأكبر معدل على الإكسون 11. وحيث أن Imatinib الغالي الثمن الذي يُوفَّر لمرضى GIST مجاناً في سورية يُعطى دون تقصي طفرات جين c-kit، فقد هدفت دراستُنا إلى التحقق من وجود أو غياب هذه الطفرات لدى المُستجيبين وغير المُستجيبين للعلاج، وبالتالي اقتراح هذا التقصّي لاستخدامه عند وضع بروتوكول العلاج لهؤلاء المرضى.

المواد والطرق

تصميم الدراسة

صممت الدراسة كدراسة مقطعية عرضية استعادية

retrospective cross-sectional study.

العينات

قُمنا بمراجعة سجلات مرضى الورم السّدويّ المعديّ المعويّ في أرشيف مستشفى البيروني في المزة وحرستا، ومستشفى ابن النفيس، حيث يُصرف دواء imatinib لهؤلاء المرضى، لاختيار السجلات الحاوية على بيانات الصرف الشهري للدواء بالإضافة إلى نتائج التصوير الشعاعي الطبقي المحوري متعدّد الشرائح (Multi Sliced Computed Temography، MSCT) المجراة كل ثلاثة أشهر لمتابعة المرضى. بلغ عدد السجلات التي توافرت فيها هذه البيانات 7 سجلات فقط من 47 سجلاً - لمرضى GIST تراوحت تواريخُها من 2006-2016 - جرى البحث فيها. وتبيّن أن هنالك 2/7 مرضى أظهرا استجابة كاملة للعلاج (CR) و2/7 مرضى أظهرا استجابة جزئية للعلاج (PR) و3/7 مرضى غير مستجيبن للعلاج (SD). بحثنا في أرشيف التّشريح المرضي في كلٍّ من مستشفى الأسد والمواساة الجامعيَين عن العينات النسيجية للمرضى ذوي السّجلات السّبع. وبعد الحصول على موافقتهم المستنيرة، جرى الحصول على عيناتهم النسيجية المحفوظة (7 عينات). وجرى العمل عليها في مخابر التشريح المرضي والبيولوجيا الجُزيئية في مستشفى الأسد الجامعي بدمشق.

الإعتيان من العينات النّسيجيّة

اقتُطع مقطع نسيجي من عينة البارافين ولُوِّن

بالهيماتوكسيلين-أيوزين لتحديد الجزء الورميّ من العينة من قبل أخصائي التشريح المرضي باستخدام المجهر الضوئي. تمَّ الاسترشاد بمكان الجزء الورميّ في المقطع الملوّن لاقتطاع الجزء الورمي من عينة البارافين. جرى حل البارافين من العينات بحضنها بالإكزيلين لمدة نصف ساعة، ثم بحضنها بمدروج من الإيثانول (المطلق، 80%، 60%، 40%) ثم غسلها بالماء ثنائي التقطير. حُضن النسيج بـ 40 مكل من Proteinase K و 200 مكل من درائة الحل Lysis buffer طوال الليل بدرجة حرارة 55 درجة سيليسيوس ((C°.

استخلاص الدنا الجينومي

استُخلص الدنا الجينومي من الحلالة باستخدام عتيدة Dual Genomic DNA Isolation Kit-Tissue صنع شركة (GeneDireX،Taiwan ) وفقاً لتعليمات الشركة الصانعة ولكن بتخطّي مرحلة الاستخلاص بالطور العضوي (الكلوروفورم) والاكتفاء بمرحلة الاستشراب على الأعمدة. جرى التحقق من جودة عينات الدنا بقياس الامتصاصية بطول موجة 260 و280 نانومتر باستخدام جهاز NanoDrop (صنع شركة NanoDrop Technologies, Inc.، USA).

تفاعل البوليميراز التسلسلي التقليدي

جرى تضخيم الإكسون 11 الذي يمتدُّ من نوكليوتيد 74422 إلى نوكليوتيد 74548 من جين c-kit ذي التسلسل المرجعي (NCBI Reference Sequence: NG_007456.1). استخدمنا مشارع primers ذات تسلسلات منشورة (الجدول 1) [20]. تم التأكد من تراصف Alignment هذه المشارع مع المنطقة المراد تضخيمها باستخدام أداة BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi وقد جرى تصنيع المشارع في شركة (Eurofins Genomics، Germany).

أُجري تفاعل PCR باستخدام محلول المزيج الجاهز HotStar PCR SuperMix صنع شركة (GeneDireX، Taiwan ). كان الحجم النهائي للتفاعل 50 مكل وتضمن: محلول المزيج الجاهز master mix 25 مكل، المشرع المتقدم 1مكل (بتركيز 10 مكرومول)، المشرع العكسي 1مكل (بتركيز 10 مكرومول)، عينة الدنا المُستخلصة 5 مكل (بتركيز 30 مكغ/ مل) وأُكمل الحجم إلى 50 مكل بالماء ثنائي التقطير. أُجري التفاعل باستخدام جهاز MasterCycler pro S (Eppendorf، Germany). اعتمدنا البرنامج الحراري التالي: دورة واحدة من التمسخ البدئي بدرجة C°94 لمدة 2 د، تليها 45 دورة (94 C°لمدة 30 ثا، 54 C°لمدة 30 ثا، 72 C°لمدة 1 د) ودورة واحدة من الاستطالة النهائية بالدرجة 72 C° لمدة 7 دقائق.

أُجريَ الرحلان الكهربائي على هلامة الأغاروز ذات التركيز .52% الحاوية على بروميد الإيثيديوم للتحقّق من وجود نواتج التّضخيم (281bp) (الشكل 1). تمّ توثيق الهلامة باستخدام جهاز توثيق الهلام G:BOX gel documentation system صنع شركة (Syngene، UK).

تفاعل السّلسلة Sequencing

بعد تنقية نواتج التّضخيم باستخدام عتيدة High pure PCR product purification kit (Roche، Germany) حسب تعليمات الشركة المصنعة، أُجريَ تفاعل السّلسلة باستخدام عتيدة Big dye terminator v3.1 cycle sequencing kit (صنع شركةApplied Biosystems، USA). أُجري تفاعلي سَلسلة -أحدهما باستخدام المشرع المتقدّم، والآخر باستخدام المشرع العكسي- لكل عينة باستخدام المشارع المستخدمة في تفاعل PCR. جرى ترحيل نواتج السَّلسلة باستخدام جهاز السّلسلة المؤتمت ABI PRISM® 3100- AvantTM Genetic Analyzer (صنع شركة Applied Biosystems، .(USA أُجريَ تحليل الكروماتوغرام الناتج وقراءة التسلسلات ومقارنتها بالتسلسل المرجعي المسجل في قاعدة البيانات NCBI (NCBI Reference Sequence: NG-007456.1) لاستكشاف الطفرات الناتجة.

الشكل 1: نواتج تضخيم الإكسون 11 (281bp ) لعينات GIST المفحوصة بعد ترحيلها على هلامة أغاروز 2.5%.

M: واصم لقياس شدف الدنا (-1001000bp).

1-7: عينات لـ 7 مرضى.

الجدول 1: المشارع المستخدمة في تفاعل البوليميراز التسلسلي التقليدي لتضخيم الإكسون 11 من جين c-kit لدى مرضى GIST المشاركين في الدراسة، درجة التلدين وطول الشدفة.

المشارع Primers	تسلسل المشارع Primers sequences	درجة التلدين Anealing	طول الشدفة Amplicon	المرجع Reference
المشرع المتقدم Forward Primer	5’-CCAGAGTGCTCTAATGACTGAGA -3’	54 C°	281 bp	[20]
المشرع العكسي Reverse Primer	5’-AAACAAAGGAAGCCACTGGA -3’

النتائج

نتائج تسلسلات الإكسون 11 من جين c-kit للمرضى المشمولين في الدراسة: بعد إجراء تفاعلات سلسلة الإكسون 11 للمرضى المدروسين (n=7)، تبيّن وجود طفرات لدى أربعة منهم (4/7)؛ قُيِّمت استجابة مريضَين منهم كاستجابة كاملة (CR) والمريضَين الآخَرَين كاستجابة جزئية (PR)، وغياب الطفرات لدى المرضى )3/7) الذين لم يُبدوا استجابة للعلاج (SD) (الجدول 2). الطفرات

المُكتشفة على الإكسون 11 للعينات المدروسة:

يُوضِّح الشكل 2 الطفرات على الإكسون 11 المُكتشفة لدى كلٍ من المرضى المشمولين بالدراسة (n=7). ظهرت طفرة حذف وإدخال p.(Trp557-Val559delinsPhe) في عينة واحدة فقط؛ حذف على مستوى الدنا الجينومي أدى إلى حذف وإدخال على مستوى الأحماض الأمينية في البروتين، حيث حُذفت الأحماض الأمينية Tryptophan وlysine و Valine في المواقع 557 و558 و559، على الترتيب من بروتين c-kit وأُدخل الحمض الأميني Phenylalanine إلى هذا البروتين؛ نتيجة ً لحذف - خارج إطار القراءة - نوكليوتيدات GGAAGG من الموقع 1670 إلى 1675 من المنطقة المرمزة من جين c-kit. كما يُوضِّح الشكل 2 ظهور طفرة استبدال p.(Leu576Pro) في عيّنة أخرى؛ استبدال الحمض الأميني Leucine بـ Proline في الموقع 576 من بروتين c-kit نتيجة ً لاستبدال التايمين بـ السيتوزين في الموقع 1727 من التسلسل المرمز من جين .c-kit

ويُوضِّح الشكل 3 كروماتوغرام طفرة حذف p.(Trp557-Lys558del) لدى مريضيَن من مرضى الدراسة (2/7)؛ حذف الحمضين الأمينين Tryptophan في الموقع 557 وlysine في الموقع 558 من بروتين c-kit نتيجة ً لحذف نوكليوتيدات TGGAAG في الموقع 1669- 1674 من المنطقة المرمزة من جين c-kit. بالإضافة إلى أنّ هذه الطفرة قد ترافقت لدى مريض واحد مع طفرة p.(Lys550Arg)؛ استبدال الحمض الأميني Lysine بـ Arginine في الموقع 550 من بروتين c-kit نتيجة ًلاستبدال نوكليوتيد الأدينين بـ الغوانين في الموقعين 1649 و 1650 من المنطقة المرمزة من جين c-kit لدى هذا المريض.

الشكل 2: أنماط الطفرات الناتجة (حذف وإدخال، استبدال، حذف+استبدال، حذف) في الموقع 550_591 من تسلسل الحموض الأمينية من بروتين c-kit، تكرارها وتكرار النمط الشائع لدى مرضى GIST المدروسين (n=7).

الشكل 3: كروماتوغرام سَلْسَلَة الإكسون11 لجين c-kit لمريض GIST (باستخدام المشرع العكسي) يُوضِّح وجود طفرة حذف c.1669-1674del TGGAAG متغايرة الزيجوت.

الجدول 2. وجود الطفرات على الإكسون 11 لجين c-kit أو غيابها لدى المرضى المدروسين (n=7) المُستجيبين (4/7) وغير المُستجيبين (3/7)، النقائل، جرعة الدواء، المدة الزمنية حتى تقدّم المرض، موقع النكس.

Patient #	Mutation	Metastasis/ Site	Imatinib dose	Clinical response*	TTP	Site of recurrence
1	c.1670_1675del6 p.(Trp557_Val559 delinsPhe)	No	400mg/ day	Complete response	17 months	liver
2	c.1727T>C p.(Leu576Pro)	No	400mg/ day	Complete response	No progression till now	-
3	c.1669_1674del6 p.(Trp557_Lys558del)/ c.1649A>G,c.1650A>G p.(Lys550Arg)	Yes/ omentum	400mg/day	Partial response	No progression till now	-
4	c.1669_1674del6 p.(Trp557_Lys558del)	Yes/liver	400mg/ day	Partial response	124 months/ Dose escalation 800mg/ progression	Liver/lung
5	Wild type	Yes/spleen, pancrease omentum	400mg/ day	Stable disease	29 months/ Dose escalation 800mg/ progression	Stomach/ left adrenal
6	Wild type	No	400mg/ day	Stable disease (up to 34months)	NA	NA
7	Wild type	Yes/ liver	400mg/ day	Stable disease	21 months	Liver

* According to RECIST criteria

TTP:(Time to progression) time from start of imatinib treatment to progression (appearance of new lesions or increase in tumor size).

c.: DNA level, p.: Protein level, NA: not available

المناقشة Discussion

أظهرت دراسَتُنا وجود أربعة أنماط من طفرات الإكسون 11 لجين c-Kit، لدى المرضى الذين أثبتت سجلاتهم استجابة لـ imatinib، وغياب الطفرات لدى المرضى الذين أظهرت سجلاتهم عدم الاستجابة له. وعلى الرغم من قلّة عدد مرضى GIST المدروسين سواء كانوا مستجيبين أو غير مستجيبين للعلاج فقد تماشى ما وجدناه مع الدراسات السابقة التي أثبتت أن المرضى الطافرون في الإكسون 11 هم الأكثر استجابةً لـ imatinib ]14-19[. حيث وجد Debiec-Rychter 2004 أن مرضى GIST الذين يبدون طفرات في الإكسون 11 هم الأكثر حظاً لتحقيق استجابة جزئية للعلاج (PR، 83%)، مقارنةً مع المرضى الذين لم يبدوا طفرات في هذا الإكسون (23%) [19]. ويمكن تفسير استجابة المرضى الذين يُبدون طفرات في الإكسون 11 للعلاج بالـ Imatinib، بدوره في تثبيط مستقبل Kit الذي يتفعًّل بوجود هذه الطفرات.

كما أوضحت نتائجنا تغايراً بين أنواع الطفرات الناّتجة من حذف Deletion، أو استبدال Subtitution، أو حذف وإدخال Indel. وَجدنا هذه الطفرات مُسجّلة في قاعدة البيانات للطفرات الجسمية COSMIC، حيث جرى اكتشافها وتسجيلها من قبل دراسات أُخرى [21]. إنّ هذه الطفرات التي تظهر في الإكسون 11 هي طفرات مفعّلة للمستقبل (activating mutation) - طفرات كسب وظيفة Gain of function mutations - وذلك لأنها تُخرّب البنية التثبيطية للمجال المجاور للغشاء مما يؤدي إلى تفعيل مستمر للمستقبل [6، 22].

بيّنت دراستنا وجود طفرة استبدال p.(Leu576Pro) لدى مريض تلقّى العلاج بـ imatinib لمدة عامين فقط وتماثل لشفاء كامل (CR) بعد ستة أشهر من بدء العلاج، ولم يُبدِ أي نكس حتى تاريخه. هذا وقد ذكرJoensuu et al. في دراسته التي نشرت عام 2017 والتي قارن فيها بين مرضى يُبدون طفرات استبدال، تلقّت مجموعة منهم العلاج بـ imatinib كعلاج مُساعد لمدة عام والمجموعة الأخرى لمدة ثلاثة أعوام، حيث لم تجد الدراسة أي فارق يُعتدُّ به إحصائياً بمعدل البُقيا بدون نكس (Relapse free survival RFS,) بين المجموعتين [23]. ظهرت طفرة حذف p.(Trp557-Val558delinsPhe) لدى مريض في دراستنا أوضحت سجلاته أنه عانى نكساً بعد 17 شهراً من انقضاء العمل الجراحي والعلاج بـ Imatinib. هذا وقد أثبتت دراسة Wozniak et al. أن أورام GIST المُوضّعة التي أبدت طفرة حذف متضمّنةً الكودون 557 والكودون 558 تُمثل مؤشراً خطراً للنكس حيث ترافقت مع معدلات أعلى للنكس، وهذا ما يتوافق مع ما وجدناه [24]. على الرُّغم من أن الطفرات التي وُجِدت بأنواعها المختلفة في دراستنا كانت معدودة بسبب ندرة سجلّات المرضى التي توفّرت فيها بيانات كاملة لمتابعة العلاج، فقد حقّقت الغرض من إجراءنا لهذا البحث.

الاستنتاجات

خَلُصَت دراستنا إلى ضرورة التحري عن وجود أو غياب الطّفرات لدى مرضى GIST قبل وضع منهج العلاج بـ imatinib.

المراجع References

1.Corless C.L.

Gastrointestinal stromal tumors: what do we know now?

Modern pathology, 27 Suppl 1: S1-16, 2014.

2.Kwon J.G; Hwang S.J; Hennig G.W; Bayguinov Y; McCann C; Chen H; Rossi F; Besmer P; Sanders K.M. and Ward S.M.

Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors.

Gastroenterology, 136 (2): 630-639, 2009.

3.Ducimetière F; Lurkin A; Ranchère-Vince D; Decouvelaere AV; Péoc'h M; Istier L; Chalabreysse P; Muller C; Alberti L; Bringuier PP; Scoazec JY; Schott AM; Bergeron C; Cellier D; Blay Y. and Ray-Coquard I.

Incidence of Sarcoma Histotypes and Molecular Subtypes in a Prospective

Epidemiological Study with Central Pathology Review and Molecular Testing.

PLoS One, 6 (8): e20294, 2011.

4.Abbaspour Babaei M; Kamalidehghan B; Saleem M; Huri H.Z.and Ahmadipour F.

Receptor tyrosine kinase (c-Kit) inhibitors: a potential therapeutic target in cancer cells.

Drug Des Devel Ther, 10: 2443-2459, 2016.

5.Heinrich Michael C; Rubin Brian P; Longley B.Jack and Fletcher Jonathan A.

Biology and genetic aspects of gastrointestinal stromal tumors: KIT activation and cytogenetic alterations.

Hum Pathol, 33 (5): 484-495, 2002.

6.Hirota S; Isozaki K; Moriyama Y; Hashimoto K; Nishida T; Ishiguro S; Kawano K; Hanada M; Kurata A; Takeda M; Muhammad Tunio G; Matsuzawa Y; Kanakura Y; Shinomura Y.and Kitamura Y.

Gain‑of‑function mutations of c‑kit in human gastrointestinal stromal tumors.

Science, 279 (5350): 577‑580, 1998.

7.Barnett C.M; Corless C.L.and Heinrich M.C.

Gastrointestinal stromal tumors: molecular markers and genetic subtypes.

Hematol Oncol Clin North Am, 27 (5): 871-888, 2013.

8.Mol C.D; Dougan D.R; Schneider T.R; Skene R.J; Kraus M.L; Scheibe D.N; Snell G.P; Zou H; Sang B.C.and Wilson K.P.

Structural basis for the autoinhibition and STI-571 inhibition of c-Kit tyrosine kinase.

J Biol Chem, 279 (30): 31655-31663, 2004.

9.Gheorghe M; Predescu D; Iosif C; Ardeleanu C; Băcanu F. and Constantinoiu S.

Clinical and therapeutic considerations of GIST.

J Med Life, 7(2): 139-149, 2014.

10.Buchdunger E; Cioffi C.L; Law N; Stover D; Ohno-Jones S; Druker B.J. and Lydon N.B.

Abl Protein-Tyrosine Kinase Inhibitor STI571 Inhibits In Vitro Signal

Transduction Mediated by c-Kit and Platelet-Derived Growth Factor Receptors.

J Pharmacol Exp Ther, 295 (1): 139-145, 2000.

11.Eisenberg B.L. and Judson I.

Surgery and imatinib in the management of GIST: emerging approaches to adjuvant and neoadjuvant therapy.

Ann. Surg. Oncol, 11 (5): 465-475, 2004.

12.Therasse P; Arbuck S.G; Eisenhauer E.A; Wanders J; Kaplan R.S; Rubinstein L; Verweij J; Glabbeke M.V; Oosterom A.T; Christian M.C. and Gwyther S.G.

New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors.

J Natl Cancer Inst, 92 (3): 205–216, 2000.

13.Guidance for Industry/Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics.

https://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm071590.pdf

14.Kang H.J; Ryu M.H; Kim K.M; Park Y.S; Choi J; Ryoo B.Y; Kim W.H; Im S.A; Bang Y.J; Park S.H; Lee J.H; Chung I.J; Bae H.I; Kim J.G; Lee K.H; Song H.S; Kwon H.C; Baek J.H; Shin D.B; Lee K.E. and Kang Y.K.

Imatinib efficacy by tumor genotype in Korean patients with advanced gastrointestinal stromal tumors (GIST): The Korean GIST Study Group (KGSG) study.

Acta Oncol, 51 (4): 528-536, 2012.

15.Heinrich M.C; Owzar K; Corless C.L; Hollis D; Borden E.C; Fletcher C.D; Ryan C.W; Mehren M; Blanke C.D; Rankin C; Benjamin R.S; Bramwell V.H; Demetri G.D; Bertagnolli M.M. and Fletcher J.A.

Correlation of kinase genotype and clinical outcome in the North American Intergroup Phase III Trial of imatinib mesylate for treatment of advanced gastrointestinal stromal tumor: CALGB 150105 Study by Cancer and Leukemia Group B and Southwest Oncology Group.

J Clin Oncol, 26 (33): 5360-5367, 2008.

16.Heinrich M.C; Corless C.L; Demetri G.D; Blanke C.D; Mehren M; Joensuu H; McGreevey L.S; Chen C.J; Van den Abbeele A.D; Druker B.J; Kiese B; Eisenberg B; Roberts P.J; Singer S; Fletcher C.D; Silberman S; Dimitrijevic S. and Fletcher J.A.

Kinase mutations and imatinib response in patients with metastatic gastrointestinal stromal tumor.

J Clin Oncol, 21 (23): 4342-4349, 2003.

17.Gao J; Dang Y; Sun N; Li J. and Shen L.

C-KIT mutations were closely associated with the response to Imatinib in Chinese advanced gastrointestinal stromal tumor patients.

Med Oncol, 29 (5): 3039-3045, 2012.

18.Debiec-Rychter M; Sciot R; Le Cesne A; Schlemmer M; Hohenberger P; Van Oosterom A.T; Blay J.Y; Leyvraz S; Stul M; Casali P.G; Zalcberg J; Verweij J; Van Glabbeke M; Hagemeijer A. and Judson I. Tissue Eortc Soft, Bone Sarcoma Group, Italian Sarcoma Group and Australasian GastroIntestinal Trials Group. KIT mutations and dose selection for imatinib in patients with advanced gastrointestinal stromal tumours.

Eur J Cancer, 42 (8): 1093-1103, 2006.

19.Debiec-Rychter M; Dumez H; Judson I; Wasag B; Verweij J; Brown M; Dimitrijevic S; Sciot R; Stul M; Vranck H; Scurr M; Hagemeijer A; Van Glabbeke M; Van Oosterom A.T.

Tissue Eortc Soft and Bone Sarcoma Group.

Use of c-KIT/PDGFRA mutational analysis to predict the clinical response to imatinib in patients with advanced gastrointestinal stromal tumours entered on phase I and II studies of the EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group.

Eur J Cancer, 40 (5): 689-695, 2004.

20.Calibasi G; Baskin Y; Alyuruk H; Cavas L; Oztop I; Sagol O; Atila K; Ellidokuz H. and Yilmaz U.

Molecular analysis of the KIT gene in gastrointestinal stromal tumors with novel mutations.

Appl Immunohistochem Mol Morphol, 22 (1): 37-45, 2014.

21.Forbes S.A; Bindal N; Bamford S; Cole C; Kok C.Y; Beare D; Jia M; Shepherd R; Leung K; Menzies A; Teague J.W; Campbell P.J; Stratton M.R. and Futreal P.A.

COSMIC: mining complete cancer genomes in the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer.

Nucleic Acids Res, 39 (Database issue): D945-950, 2011.

22.Rubin B.P; Singer S; Tsao C; Duensing A; Lux M.L; Ruiz R; Hibbard M.K; Chen C.J; Xiao S; Tuveson D.A; Demetri G.D; Fletcher C.D. and Fletcher J.A.

KIT Activation Is a Ubiquitous Feature of Gastrointestinal Stromal Tumors.

Cancer Res, 61 (22): 139-145, 2001.

23.Joensuu H; Wardelmann E; Sihto H; Eriksson M; Sund by Hall K; Reichardt A; Hartmann JT; Pink D; Cameron S; Hohenberger P; Al-Batran SE; Schlemmer M; Bauer S; Nilsson B; Kallio R., Junnila J; Vehtari A. and Reichardt P.

Effect of KIT and PDGFRA Mutations on Survival in Patients With Gastrointestinal Stromal Tumors Treated With Adjuvant Imatinib: An Exploratory Analysis of a Randomized Clinical Trial.

JAMA Oncol, 3(5): 602-609, 2017.

24.Wozniak A; Rutkowski P; Schöffski P; Ray-Coquard I; Hostein I; Schildhaus HU; Le Cesne A; Bylina E; Limon J; Blay JY; Siedlecki JA; Wardelmann E; Sciot R; Coindre JM. and Debiec-Rychter M.

Tumor genotype is an independent prognostic factor in primary

gastrointestinal stromal tumors of gastric origin: a european multicenter analysis based on Contica GIST.

Clin Cancer Res, 20 (23): 6105-6116, 2014.