الثلاسيمية ونقل الدم

التعددات الشكلية في المنطقة الممتدة بين 4251-5274 من الدنا المتقدري لدى مريضات سرطان ثدي سوريات

Polymorphisms in a Region of Mitochondrial DNA Encompassing Position 4251-5274 in Syrian Breast Cancer Patients

عهد محروقة¹ و فوزة منعم^2،1

Ahed Mahrouka¹ and Fawza Monem^1,2

1: قسم الكيمياء الحيوية والأحياء الدقيقة، كلية الصيدلة، جامعة دمشق.

2: قسم المخبر، مستشفى الأسد الجامعي، جامعة دمشق.
¹Faculty of Pharmacy, Damascus University

²Al-Assad Hospital, Damascus University

الملخص Abstract

تساهم طفرات الدنا المتقدري (mt-DNA) في الاضطرابات الاستقلابية والسرطان. تتجه الدراسات الحديثة إلى تقصي أهمية الدنا المتقدري في الأورام، وحيث أنّه لا توجد دراسات عنه في سورية، فقد هدفت دراستنا إلى البحث عن مؤشرات الدنا المتقدري التي قد توجد في سرطان الثدي من خلال كشف تواتر الطفرات في منطقة من الدنا المتقدري تحوي جينات الرنا الناقل المتقدرية للحموض الأمينية؛ الإيزولوسين MT-TI، والغلوتامين MT-TQ، والميتيونين MT-TM، إضافةً إلى جزء من جينة الوُحَيدة الثانية لإنزيم نازعة هيدروجين ثنائي نوكليوتيد النيكوتينامين والأدنين MT-ND2 لدى 20 مريضة سرطان ثدي سوريات باستخدامDNA sequencing. وجدنا 10 تعددات شكلية لدى 19/20 مريضة، كان التعدد الشكلي A4769G أكثرها تواتراً، والذي قد يشير إلى اختطار أكبر للإصابة بسرطان الثدي، ولم نجد طفرات جسدية في الجينات المدروسة.

Mitochondrial DNA (mt-DNA) mutations contribute to metabolic disorders and cancer. Recent studies tend to investigate the importance of mt-DNA in tumors, and since there are no mt-DNA studies in Syria, we aimed to search for mt-DNA indicators that might be present in breast cancer by detecting mutations frequency in a region of mitochondrial DNA containing mitochondrially encoded tRNA isoleucine MT-TI, mitochondrially encoded tRNA glutamine MT-TQ and mitochondrially encoded tRNA methionine MT- TM genes, in addition to a part of mitochondrially encoded NADH dehydrogenase 2 gene MT-ND2 in 20 Syrian breast cancer patients using DNA sequencing. We found 10 polymorphisms in 19/20 patients. The polymorphism A4769G was the most frequent one which might indicate a higher risk for developing breast cancer, and we didn’t find somatic mutations in the studied genes.

الكلمات المفتاح Key words: تعددات شكلية Polymorphisms، دنا متقدري mitochondrial DNA، سرطان ثديbreast cancer، سورية Syria.

المقدمة Introduction

سرطان الثدي أكثر السرطانات شيوعاً بين النساء في سورية، حيث يعتبر المسؤول عن 30% من حالات الإصابة بالسرطان بين النساء السوريات [1]. الدنا المتقدري mt-DNA جزيء دنا حلقي ثنائي الطاق، يتكون من 16569 زوج أساس ويُشفّر 13 من البروتينات المشاركة في عملية الفسفرة التأكسدية OXPHOS وعددها الكلي 87 بروتيناً، كما يُشفّر لاثنين من الرنا الريبوزومي rRNAs و 22 رنا ناقل tRNAs تحتاجها المتقدرة من أجل اصطناع البروتينات المتقدرية [2].

تؤدي المتقدرة وظائف خلوية متعددة. حيث تنتج الطاقة على شكل جزيئات ATP من خلال عملية الفسفرة التأكسدية [3]. كان Otto Warburg أول من وصف عوز OXPHOS في الخلايا السرطانية، حيث افترض عام 1932 أنّ الخلايا السرطانية تعتمد في توفير حاجتها من الطاقة على تحلل السكر Glycolysis بصورة أكبر من نظام الفسفرة التأكسدية رغم توفر الأكسجين، لذا فإنّه من المتوقع أن تسبب الطفرات في الدنا المتقدري خللاً في نظام الفسفرة التأكسدية حيث تعتبر البروتينات "التي يُشفّر لها الدنا المتقدري وعددها 13" أساسية لبُنية ووظيفة وسلامة المعقد الأول والثالث والخامس من معقدات OXPHOS. تشير الدراسات الحديثة إلى حدوث خلل وخيم في الوظيفة المتقدرية في مختلف السرطانات ومنها سرطان الثدي نتيجة خلل جيني في نظام الفسفرة التأكسدية [4].

تم ربط أكثر من 200 طفرة في جينات الرنا الناقل المتقدرية مع حالات مرضية مختلفة، حيث تمنع هذه الطفرات غالباً الأستلة الأمينية لجزيئات الرنا الناقل مما يؤثر على اصطناع البروتينات والتعبيرعنها، كما تؤثر على تطوي إنزيمات الفسفرة التأكسدية ووظيفتها[5]. وقد تؤثر هذه الطفرات على بنية جزيئات الرنا الناقل الثانوية والثالثية مسببةً عيوباً في الانتساخ والترجمة وخللاً وظيفياً في سلسلة التنفس المتقدرية [6].

لا يزال دور طفرات الدنا المتقدري في تطور الورم غير واضح، فقد تظهر الطفرات إمّا في الخط الجنسي germ line وتدعى بالطفرات الورمية الجنسية oncogene germ mutations تؤهب للإصابة بالسرطان، أو في الأنسجة وتدعى بالطفرات الجسمية النوعية للورم tumor-specific somatic mutations تساهم في تقدم الورم[7].

تتجه الدراسات الحديثة إلى تقصي أهمية الدنا المتقدري في الأورام، وبما أنّه لا توجد دراسات عنه في سورية، إضافةً إلى ارتفاع معدل الإصابة بسرطان الثدي عن السرطانات الأخرى بين النساء السوريات، فقد هدفت دراستنا إلى البحث عن مؤشرات قد توجد في الدنا المتقدري لدى المصابات بسرطان الثدي من خلال تقصي تواتر الطفرات في منطقة من الدنا المتقدري تحوي ثلاث من جينات الرنا الناقل المتقدري لكلٍ من الحموض الأمينية؛ الإيزولوسين MT-TI، والغلوتامين MT-TQ، والميتيونين MT-TM، إضافةً إلى جزء من جين الوُحَيدة الثانية لإنزيم نازعة هيدروجين ثنائي نوكليوتيد النيكوتينامين والأدنين "المعقد الأول من معقدات الفسفرة التأكسدية" MT-ND2 لدى مريضات سرطان ثدي سوريات باستخدام تقنية DNA sequencing.

المواد والطرق:

شملت دراستنا المقطعية المستعرضة Cross-sectional study 20 سيدة، راجعن مستشفى الأسد الجامعي في دمشق بسبب وجود كتلة في الثدي. وبعد الحصول على الموافقة المستنيرة، جُمع من كل امرأة 3 عينات مختلفة؛ عينة دم قبل تشخيص الإصابة بالسرطان، وعينتين طازجتين من النسيج الورمي والنسيج السليم المحيط بالكتلة بعد تأكيد التشريح المرضي الإصابة بالسرطان. أنجزت جميع مراحل العمل المخبري في مخبر البيولوجيا الجزيئية في مستشفى الأسد الجامعي في دمشق.

تم استخلاص الـ DNA (الجينومي والمتقدري) من العينات الثلاث (نسيج ورمي ونسيج سليم مجاور والدم) المأخوذة من كل مريضة باستخدام عتيدة QIAamp DNA Mini Kit (شركة Qiagen، ألمانيا) حسب تعليمات الشركة الصانعة. حُفظ الـ DNA المُستخلص في الدرجة -̊80 لحين إجراء تفاعل البوليمراز التسلسلي PCR.

تم تضخيم منطقة من الدنا المتقدري بطول 1024

زوج أساس، تمتد من النوكليوتيد رقم 4251 إلى النوكليوتيد رقم 5274 ((GenBank accession no; NC-012920 باستعمال عتيدة GeneAmp® High Fidelity PCR System (شركة Applied Biosystems، أمريكا) باستخدام زوج من المشارع [8](الجدول 1) صُنع (شركة TIB MOLBIOL، ألمانيا). احتوى مزيج التفاعل (50µl)؛ 0.5µM من كل مَشرَع و5µl من الـ DNA المُستخلص (تراكيز الـDNA 12.6- 175.5نانوغرام/مل)، وزيادة من MgCl₂(4mM). استخدم البرنامج الحراري التالي "التمسيخ البدئي initial denaturation في درجة حرارة ̊94 مدة 2 دقيقة، يتبعها 40 دورة من التمسخ denaturation في درجة 94 مدة 15 ثانية والتلدن annealing في درجة ̊56 مدة 30 ثانية والإطالة elongation في درجة ̊72 مدة 3 دقائق مع زيادة 10 ثانية/ دورة بعد الدورة العاشرة، والإطالة النهائية final extension في درجة ̊72 مدة 7 دقائق"، تم اختيار شروط تفاعل الـ PCR المناسبة لطول ناتج التضخيم (1024 زوج أساس) حسب تعليمات الشركة الصانعة. تم التأكد من نجاح تضخيم المنطقة المدروسة في جميع العينات لدى مريضات الدراسة(20 مريضة، 60 عينة) بالترحيل على هلامة الآغاروز 1.5% قبل متابعة العمل.

تم تنقية نواتج التضخيم (60 ناتج تضخيم) باستخدام عتيدة High Pure PCR Product Purification Kit (شركة Roche، ألمانيا) حسب تعليمات الشركة الصانعة. حددنا تسلسل نوكليوتيدات جينات الرنا الناقل tRNAs لكلٍ من الايزولوسين MT-TI والغلوتامين MT-TQ والميتيونين MT-TM، إضافةً إلى تسلسل 805 زوج أساس من جين الوُحَيدة الثانية لإنزيم نازعة هيدروجين ثنائي نوكليوتيد النيكوتينامين والأدنين MT-ND2 باستخدام عتيدة BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing، وجهاز ABI PRISM® 3100-AvantT Genetic Analyzer (شركةApplied Biosystems، أمريكا). تمت مقارنة التسلسلات التي حصلنا عليها مع التسلسل المرجعي لـ DNA المتقدري (GenBank accession no; NC_012920)

من أجل التحقق من التغيرات النوكليوتيدية باستخدام برمجية blastn http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi، كما تم تحديد تغيرات mtDNA باستخدام برمجية Mitomaster .http://www.mitomap.org

أشرنا إلى التغيرات الجينية التي وجدناها في الدم و/أو النسيج السليم إضافةً إلى النسيج الورمي بمصطلح التعددات الشكلية polymorphisms، وإلى التغيرات الجينية التي وجدناها في النسيج الورمي فقط بمصطلح طفرات جسدية somatic mutations.

الدراسة الإحصائية:

اقتصرت الدراسة الإحصائية على حساب تواتر التعددات الشكلية والنسبة المئوية لها في المنطقة المدروسة.

النتائج:

تم الحصول على 60 ناتج تضخيم للمنطقة الممتدة بين النوكليوتيد 42251-5274 من الدنا المتقدري عند إخضاع العينات الثلاث (النسيج الورمي، والنسيج السليم المجاور، والدم) المأخوذة من كل مريضة(20مريضة، 60عينة) إلى تفاعل البوليمراز التسلسلي PCR.

تم الحصول على سلسلة 49/60 ناتج تضخيم للمنطقة المدروسة في 20 عينة نسيج ورمي و20 عينة دم، و9 عينات نسيج سليم مجاور. يوضح الجدول 2 التغيرات النوكليوتيدية في المنطقة المدروسة في عينات النسيج الورمي والسليم المجاور والدم لدى مريضات الدراسة. وجدنا تعدداً شكلياً واحد في جين الرنا الناقل للغلوتامين MT-TQ لدى 1/ 20 (5%) مريضة، ولم نجد أيّ تعددٍ شكلي في جينات الرنا الناقل لكلٍ من الإيزولوسين MT-TI والميتيونين MT-TM، إضافةً إلى عدم ظهور طفرات جسدية في الجينات الثلاث. أظهرت نتائجنا عند سلسلة 805 زوج أساس من جين MT-ND2 وجود 9 تعددات شكلية لدى 19/20 (95%) مريضة مشاركة في البحث، توزعت هذه التعددات الشكلية التسع بين مريضات الدراسة كالتالي؛ 3 تعددات شكلية لدى مريضتين، و5 تعددات شكلية لدى مريضة واحدة، وتعدد شكلي واحد لدى 19 مريضة، ولم نجد طفرات جسدية في المنطقة المدروسة من جين MT-ND2، الجدول 3.

الجدول 2: التغيرات النوكليوتيدية في المنطقة المدروسة في عينات النسيج الورمي والسليم المجاور والدم لدى مريضات الدراسة (n=20)

التسلسل في الدم	التسلسل في النسيج السليم المجاور	التسلسل في النسيج الورمي	rCRS*	النوكليوتيد	الجين	المريضة
C	C	C	T	4336	MT-TQ	1
G	G	G	A	4769	MT-ND2	1
C	C	C	T	4639	MT-ND2	2
G	G	G	A	4769	MT-ND2
C	C	C	T	5004	MT-ND2
T	T	T	C	5135	MT-ND2
C	C	C	T	4639	MT-ND2	3
G	G	G	A	4769	MT-ND2
C	C	C	T	5004	MT-ND2
T	T	T	C	5135	MT-ND2
G	-	G	A	4769	MT-ND2	4
G	-	G	A	4769	MT-ND2	5
C	-	C	T	4586	MT-ND2	6
G	-	G	A	4769	MT-ND2
C	-	C	T	5096	MT-ND2
T	T	T	A	4529	MT-ND2	7
G	G	G	A	4769	MT-ND2	7
G	-	G	A	4769	MT-ND2	8
G	G	G	A	4769	MT-ND2	9
G	G	G	A	4769	MT-ND2	10
G	-	G	A	4769	MT-ND2	11
G	G	G	A	4769	MT-ND2	12
G	-	G	A	4769	MT-ND2	13
-	-	-	-	-	MT-ND2	14
G	G	G	A	4769	MT-ND2	15
G	-	G	A	4745	MT-ND2	16
G	-	G	A	4769	MT-ND2	16
G	G	G	A	4715	MT-ND2	17
G	G	G	A	4769	MT-ND2	17
G	-	G	A	4769	MT-ND2	18
G	-	G	A	4769	MT-ND2	19
G	-	G	A	4769	MT-ND2	20
*rCRS: revised Cambridge Reference sequence

الجدول 3: تواتر التعددات الشكلية لكلٍ من جين MT-TQ(n=1) و جين MT-ND2 (n=9) في عينات الدنا المتقدري المستخلصة من النسيج الورمي والنسيج السليم المجاور والدم لمريضات سرطان الثدي المدروسات (n=20).

لدم n=20	النسيج السليم المجاور n=9	النسيج الورمي n=20	النسبة المئوية*	تكرار التعدد الشكلي	التعدد الشكلي	الجين
1	1	1	5%	1	T4336C	MT-TQ
1	1	1	5%	1	A4529T	MT-ND2
1	0	1	5%	1	T4586C
2	2	2	10%	2	T4639C
1	1	1	5%	1	A4715G
1	0	1	5%	1	A4745G
19	9	19	95%	19	A4769G
2	2	2	10%	2	T5004C
1	0	1	5%	1	T5096C
2	2	2	10%	2	C5135T

*النسبة المئوية = تكرار التعدد الشكلي/ عدد المريضات × 100

المناقشة Discussion

توخينا اختيار الشروط المناسبة (تركيز 4mM من MgCl₂، وإضافة 10 ثانية/دورة لمرحلة الإطالة بعد الدورة العاشرة، و7 دقائق لمرحلة الإطالة النهائية) المذكورة في تعليمات الشركة الصانعة لعتيدة تفاعل PCR، نظراً لطول ناتج التضخيم (1024 زوج أساس).

نجحنا في تحديد التسلسل النوكليوتيدي لـ 49/60 ناتج تضخيم للمنطقة المدروسة في 20 عينة نسيج ورمي و20 عينة دم، و9 عينات نسيج سليم مجاور، قد يُعزى عدم تمكننا من تحديد التسلسل النوكليوتيدي لـ 11 ناتج تضخيم إلى خطأ أثناء تنقية نواتج التضخيم أو أثناء سلسلتها.

عند مقارنة وجود تعدد شكلي واحد T4336C في جين الرنا الناقل للحمض الأميني الغلوتامين لدى 1/20(5%) مريضة في دراستنا مع دراسات الدنا المتقدري في سرطان الثدي، وجدنا إشارة إلى هذا التعدد الشكلي في دراسة Zhu وزملائه 2005 [9]، ودراسة Bai وزملائه 2007 حيث تكرر هذا التعدد الشكلي 4 مرات في كلٍ من مجموعتي المريضات والشواهد [10]. كما لم نجد طفرات جسدية في جينات الرنا الناقل للحموض الأمينية؛ الايزولوسين والغلوتامين والميتيونين في مجموعة الدراسة، ويتوافق هذا مع دراسة Grzybowska-Szatkowska، 2012 [11]، ودراسة Tan، 2002 [12]، مما قد يُشير إلى أنّ جينات الرنا الناقل المدروسة ليست من المناطق الأكثر عرضة للطفرات في سرطان الثدي.

وجدنا عند دراسة جزء من جين MT-ND2 9 تعددات شكلية، كان A4769G أكثرها تواتراً حيث ظهر لدى 19/20 (95%) مريضة، ويتوافق هذا مع نتائج كلٍ من دراسة Zhu وزملائه،2005 [9]، ودراسة CZARNECKA وزملائه ،2010 التي ذكرت وجود هذا التعدد لدى 12/44 (27%) مريضة [13]، ودراسة Ma وزملائه، 2010 على خطوط سرطان ثدي خلوية حيث وجده في جميع الخطوط الخلوية المدروسة 4/4(100%)[14]، ودراسة Grzybowska-Szatkowska وزملائه، 2014 التي وجدت التعدد الشكلي A4769G لدى 27/50 (54%) مريضة [15]. يشير ارتفاع تواتر التعدد الشكلي A4769G إلى أنّه قد يُشكّل عامل اختطار للإصابة بسرطان الثدي، ولكن يحتاج البت بهذا الأمر، إجراء دراسات تالية تتضمن أعداداً أكثر من مريضات سرطان الثدي ونساء سليمات.

أما عن التعددات الشكلية T5004C، وT4639C، وC5135T التي وجدناها لدى 2/19 (10%( مريضة، فقد وجد Tan وزملاؤه، 2002 التعدد الشكلي T5004C لدى 1/19 (5%) مريضة [12]، كما وجده CZARNECKA وزملاؤه، 2010 لدى 1/44 (2%) مريضة [13]. أما التعدد الشكلي T4639C، فقد وجده Grzybowska-Szatkowska وزملاؤه، 2014 لدى 1/50 (2%) مريضة [15]. ورغم أننا وجدنا التعدد الشكلي C5135T لدى مريضتين فقط، إلّا أنّ دراسات الدنا المتقدري في سرطان الثدي لم تُشر إليه. إنّ انخفاض تواتر وجود هذه التعددات الشكلية الثلاث قد يوحي بأنّه لا أهمية لها في سرطان الثدي.

أشارت دراستنا إلى وجود التعدد الشكلي A4529T في جين MT-ND2 لدى 1/20 (5%) مريضة، كما وجد Bai وزملائه 2007، هذا التعدد لدى 10/156 (6%) مريضة ولدى 8/260 (3%) امرأة سليمة [10]، أما Grzybowska-Szatkowska، 2014 فقد وجده لدى 1/50 (2%) مريضة فقط[15] . رغم أنّ دراستنا أُجريت على مريضات سوريات، ودراسة Bai على مريضات أمريكيات من أصل أوروبي، ودراسة Grzybowska-Szatkowska على مريضات بولنديات، إلّا أنّ نتائج هذه الدراسات اتفقت على انخفاض تواتر ظهور هذا التعدد الشكلي في سرطان الثدي، مما قد يشير إلى أنّه تعدد شكلي طبيعي يوجد في مجتمعات عدة.

أظهرت نتائجنا وجود التعدد الشكلي A4745G لدى 1/20 (5%) مريضة، كما وجده CZARNECKA وزملاؤه، 2010 لدى 1/44 (2%( مريضة سرطان ثدي، حيث أشاروا إلى أنّه ربما من التعددات الشكلية النادرة جداً [13].

وجدنا في دراستنا كلاً من التعددين الشكليين A4715G و T5096C لدى 1/20 (5%( مريضة، كما لم تشر الدراسات على الدنا المتقدري في سرطان الثدي إليهما. قد يقترح هذا أنّها رغم تواتر ظهورها المنخفض في دراستنا إلّأ أنّها قد تكون خاصة بمجتمعنا السوري وربما باختطار الإصابة بسرطان الثدي لدى السوريات، مما يستدعي إجراء دراسات تالية على عدد أكبر من المصابات بسرطان الثدي إضافةً إلى نساء سليمات في محاولة لكشف ماهية هذا التعدد الشكلي في سرطان الثدي في سورية.

الاستنتاج Conclusion

أشارت نتائج دراستنا إلى أنّ جينات الرنا الناقل المتقدرية للحموض الأمينية؛ الإيزولوسين والغلوتامين والميتيونين المدروسة ليست من المناطق الأكثر عرضة للطفرات في سرطان الثدي. كما أظهرت دراستنا أنّ الجزء المدروس من جين الوُحَيدة الثانية لإنزيم نازعة هيدروجين ثنائي نوكليوتيد النيكوتينامين والأدنين من المناطق الغنية بالتعددات الشكلية التي قد تؤهب للإصابة بسرطان الثدي.

المراجع References

1-Simaan S.F.

Clinical and Pathological Characte-ristics of Breast Cancer in Syria.

Int J Cancer Res Ther. 2(3): 1-4, 2017.

2-Radpour R; Fan AX; Kohler C; Holzgreve W. and Zhong XY.

Current Understanding of Mitochondrial DNA in Breast

Cancer. Breast J. 15(5): 505-909, 2009.

3-Chandra D. and Singh K.K.

Genetic insights into OXPHOS defect and its role in cancer.

Biochim. Biophys. Acta. 1807(6), 620-625, 2011.

4-Yadav N. and Chandra D.

Mitochondrial DNA mutations and breast tumorigenesis.

Biochim. Biophys. Acta. 1836(2): 336-344, 2013.

5-He ZF; Zheng LC; Xie DY; Yu SS. and Zhao J.

Mutational analysis of mitochondrial tRNA genes in patients with lung cancer.

BJMG. 19(2): 45-50, 2016.

6-Lv F; Qian G; You W; Lin H; Wang XF; Qiu GS; Jiang YS; Pang LX; Kang YM; Jia BF; Xu JZ and Yu Y.

Variants In Mitochondrial Trna Gene May Not Be Associated With Thyroid Carcinoma.

BJMG. 18(2): 59-64,2015.

7-Salgado J; Honorato B. and García-Foncillas J.

Mitochondrial Defects in Breast Cancer.

Clin Med Oncol. 2: 199-207, 2008.

8-Xiu-Cheng A; Kohler C; Radpour R; Montazer Haghighi M; Zanetti-Dällenbach R; Wight E; Holzgreve W. and Yan Zhong X.

High throughput multiplex assay for the simultaneous detection of 22 mutations of mtDNA in breast cancer tissues using microarray chip based.

Maldi-Tof MS. Ph.D thesis, Basel University, 2009.

9-Zhu W; Qin W; Bradley P; Wessel A; Puckett CL. and Sauter ER.

Mitochondrial DNA mutations in breast cancer tissue and in matched nipple aspirate fluid.

Carcinogenesis. 26(1): 145-152, 2005.

10-Bai RK, Leal SM, Covarrubias D, Liu A and Wong LJ.

Mitochondrial genetic background modifies breast cancer risk.

Cancer Res. 67(10): 4687-94, 2007.

11-Grzybowska-Szatkowsk L. and Slaska B.

Polymorphisms in genes encoding mt-tRNA in female breast cancer in Poland.

Mitochondrial DNA. 23(2): 106–111, 2012.

12-Tan DJ; Bai RK. and Wong LJC.

Comprehensive Scanning of Somatic Mitochondrial DNA Mutations in Breast Cancer.

Cancer Res. 62(4): 972-976, 2002.

13-Czarnecka AM; Klemba A; Krawczyk T; Zdrozny M; Arnold RS; Bartnik E. and Petros JA.

Mitochondrial NADH-dehydrogenase polymorphisms as sporadic breast cancer risk factor.

Oncol Rep. 23(2): 531-535,2010.

14-Ma Y; Bai RK; Trieu R. and Wong LJ.

Mitochondrial dysfunction in human breast cancer cells and their transmitochondrial cybrids.

Biochim Biophys Acta. 1797(1):29-37, 2010.

15-Grzybowska-Szatkowsk L. and Slaska B.

Mitochondrial NADH dehydrogenase polymorphisms are associated with breast cancer in Poland.

J Appl Genetics. 55(2): 173–181, 2014.

المشرع	التسلسل النوكليوتيدي	الموقع	المرجع
F99	5'CCCTCAAACCTAAGAAATATG3'	4271-4251	[8]
R94	5'CTTCGATAATGGCCCATTTG3'	5274-5255	[8]